Name: 共价结合的抗体，以纤维素纸光盘及其裸眼比色法免疫分析应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习使用高碘酸盐氧化和戊二醛交联技术将抗体共价固定在纤维素纸圆片上，开发用于IgG检测的裸眼比色免疫分析方法。该方法为即时诊断提供了低成本、稳定的蛋白质固定方案。

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本工作由新加坡教育部通过转化与创新基金（MOE2012-TIF-2-G-009）提供经费支持。

1. 在纤维素纸片上接枝胺基官能团
<ol>
	<li>准备一张尺寸为1 cm × 1 cm的正方形纸片，以及100个用1号纤维素纸（中流速滤纸）通过打孔器制备的直径为6.0 mm的圆形纸片。</li>
	<li>为了获得 -NH2 在纸片上形成基团：在通风橱内，将1 ml APS与10 ml丙酮加入50 ml玻璃瓶中混合。将纸片加入新配制的APS试剂混合液中，于室温下以200 rpm转速振荡孵育5小时32. 
	注意：请在通风橱中操作 APS 和丙酮。</li>
	<li>将50 ml玻璃瓶中的过量溶液倾倒至有机废液容器中。</li>
	<li>向玻璃瓶中加入 10 ml 丙酮，充分混匀，然后完全倾倒，以去除未反应的 APS 及其他杂质。重复此步骤两次。</li>
	<li>将纸片平铺在纸巾上，并置于 110 °C 在烘箱中加热3小时。让纸片冷却。将纸片置于50 ml离心管中，室温保存。</li>
	<li>采用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）检测胺基在纤维素方形纸上的接枝情况，具体步骤如下（图3A).
	<ol>
		<li>打开计算机并启动傅里叶变换红外光谱仪。</li>
		<li>打开傅里叶变换红外光谱（FTIR）软件。</li>
		<li>转到“测量 → 初始化”。初始化完成后，“BS: KBr”、“Lamp: Infrared”和“Laser”的矩形框将变为绿色。</li>
		<li>在矩形下方选择“数据”，并为“测量模式”、“切趾函数”、“扫描次数”、“分辨率”和“范围（cm-1）”分别选择“%透射率”、“Happ-Genzel”、“45”、“4.0”和“最小值：400，最大值：4000”。</li>
		<li>点击“测量”。</li>
		<li>选择“数据文件”作为背景数据。记录下备注信息。</li>
		<li>单击“BKG”以获取背景的基线。</li>
		<li>将方形纸片固定在薄膜样品台上。</li>
		<li>选择样本数据的“数据文件”。记录下备注信息。</li>
		<li>单击“样品”以获取样品的光谱。</li>
		<li>关闭傅里叶变换红外光谱仪软件并关闭计算机。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复上述步骤（步骤1.1至1.6），制备氨基功能化的113号等级纤维素方形纸和圆片（快速流动滤纸），并获取113号等级方形纸的FTIR光谱图3B).</li>
</ol>
2. 在氨基功能化纤维素纸片上共价固定抗体
<img alt="抗体固定化示意图；NaIO4，APS 程序；化学关键词：醛基，硅烷。" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 1. 通过两种不同方法共价固定抗体。 A. 通过高碘酸盐氧化将抗体固定在胺基功能化的纤维素纸片上。碳水化合物残基被高碘酸钠氧化生成醛基官能团。随后，将氧化后的抗体加载到胺基功能化的纤维素纸片上。 B. 抗体通过戊二醛固定在胺基功能化的纤维素纸片上。将胺基功能化的纤维素纸片浸入 0.05% 戊二醛溶液中，以在纸片上引入醛基。洗涤后，将抗体加载到醛基功能化的纸片上。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>通过高碘酸钠氧化法将抗体固定在氨基功能化的纤维素纸片上（图 1A）。
	<ol>
		<li>在 1.5 ml 离心管中，将 1 µl 的 2.5 mM 高碘酸钠与 2 µl 的 0.1 mg/ml 兔抗人 IgG-FITC 及 7 µl 的 100 mM pH 5.5 醋酸盐缓冲液混合，并在避光条件下孵育 30 分钟。 
		注意：如有需要，可按照此体积比例制备更多氧化抗体。可通过调整高碘酸钠和兔抗人 IgG-FITC 的体积比例来优化其浓度。</li>
		<li>用 30 µl 的 50 mM 磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）稀释上述抗体溶液，最终体积为 40 µl。</li>
		<li>准备三个氨基功能化的中流速滤纸片和三个氨基功能化的快速滤纸片（如第 1 节所述）。
		<ol>
			<li>将 5 µl 高碘酸钠氧化的兔抗人 IgG-FITC 加载至每个中流速滤纸片上，将 8 µl 加载至每个快速滤纸片上。将这些纸片在室温下避光放置 1 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 0.2 ml 洗涤缓冲液（50 mM Tris 缓冲液含 0.15 M NaCl 和 0.05% 表面活性剂，pH 7.4）洗涤每个纸片。重复洗涤三次。</li>
		<li>通过荧光分子成像仪拍摄荧光图像，以确认各纤维素纸片上是否存在抗体32。使用空白纸片（在无高碘酸钠条件下以相同浓度抗体处理）作为对照（图 S1 至 图 S3）。 
		注意：为进行实验优化，应改变一个待优化参数的浓度，同时固定其他所有参数的浓度。较高的荧光强度可增加固定在纤维素纸片上的捕获抗体的量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过戊二醛法将抗体固定在氨基功能化的纤维素纸片上（图 1B）。
	<ol>
		<li>将第 1 节中所述的三个经 APS 处理的中流速滤纸片和三个快速滤纸片加入含有 0.05% 戊二醛的 2 ml 50 mM PBS（pH 7.4）中，室温下以旋转振荡方式处理 1 小时。 
		注意：戊二醛应在通风橱中操作。</li>
		<li>将三个纸片分别放入两个 1.5 ml 离心管中。每管加入 1 ml 去离子水（DI 水），振荡 10 秒。用移液器吸除水相。重复此步骤两次，以去除未反应的戊二醛。</li>
		<li>向每个醛基功能化的中流速滤纸片上加载 5 µl 的 25 µg/ml 兔抗人 IgG-FITC（捕获抗体），向每个醛基功能化的快速滤纸片上加载 8 µl。室温下避光孵育约 20 分钟。随后，在不移除抗体的情况下，向每个纸片加入 10 µl 的 50 mM PBS（pH 7.4），继续孵育 40 分钟以完成胺醛反应。</li>
		<li>将纸片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤两次。</li>
		<li>通过荧光分子成像仪拍摄荧光图像，以检测各纤维素纸片上抗体的存在情况33。使用空白纸片作为对照。 
		注意：在 图 4 中，“0”代表未使用戊二醛处理但以相同浓度 FITC-抗体处理的空白纸片；在 图 5A 中，空白纸片经戊二醛处理，但未加载 FITC-抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将第 2.1 和 2.2 节所得纸片在 37 °C 下干燥 10 分钟。</li>
	<li>用 15 µl 封闭缓冲液（含 10% 脱脂奶粉的 50 mM Tris 缓冲液，pH 7.4，含 0.15 M NaCl）在室温下封闭纸片 10 分钟。</li>
	<li>分别向中流速和快速滤纸片上加载 5 µl 和 8 µl 的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG PBS 溶液（1:10,000 稀释）。室温下避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>将纸片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。 
	注意：无需完全去除洗涤缓冲液，因其对结果无影响。</li>
	<li>向每个纸片上加载 10 µl 的 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）与过氧化氢溶液的混合液。</li>
	<li>孵育 5 分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄纸片图像。 
	注意：在 图 5B 中，“0”代表经戊二醛处理后加载抗体-HRP（辣根过氧化物酶）偶联物但未加载 FITC-抗体的纸片。</li>
</ol>
3. 基于纸张的ELISA法检测IgG
<img alt="ELISA 方法示意图，显示抗体、封闭、抗原结合、HRP 信号、TMB 氧化。" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 基于纸张的IgG检测ELISA方法示意图。 捕获抗体通过戊二醛共价固定在醛基功能化的纤维素纸片上。纤维素纸片用封闭缓冲液进行封闭。然后将目标IgG加入纸片，接着加入HRP标记的信号抗体。最后，将TMB和过氧化氢混合溶液加至每张纸片以产生显色信号。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54111/54111fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>向一个 20 ml 玻璃瓶中加入 5 ml 0.05% 戊二醛溶液（用 50 mM PBS 缓冲液配制，pH 7.4）。将 15 个氨基功能化的中流速滤纸圆片浸入该溶液中，室温下振荡孵育 1 小时。
	<ol>
		<li>同时，重复步骤 3.1，制备另外 15 个醛基功能化的快速滤纸圆片。 
		注意：应在通风橱中操作戊二醛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为去除滤纸圆片上未反应的戊二醛，将 15 个中流速滤纸圆片放入一个 15 ml 离心管中，另将 15 个快速滤纸圆片放入另一个 15 ml 离心管中。每管加入 5 ml 去离子水，振荡 10 秒。用移液器吸除水相。重复洗涤两次，以彻底去除未反应的戊二醛。</li>
	<li>将滤纸圆片置于 37 °C 烘箱中干燥。</li>
	<li>分别向每个中流速和快速滤纸圆片上加入 5 µl 和 8 µl 的 0.025 mg/ml 小鼠 IgG-Fc 片段抗体，孵育 20 分钟。</li>
	<li>在不移除抗体的情况下，向每张滤纸圆片上加入 10 µl 50 mM PBS（pH 7.4），孵育 40 分钟，以完成氨基与醛基的反应。</li>
	<li>将滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。</li>
	<li>将滤纸圆片在 37 °C 烘箱中干燥。</li>
	<li>用 15 µl 封闭缓冲液在室温下封闭滤纸圆片 10 分钟。</li>
	<li>将每张滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。</li>
	<li>运行 IgG 标准品。
	<ol>
		<li>将不同浓度的 IgG 溶液（例如，0、10、125、250 和 500 ng/ml，溶于 PBS 中）各取 10 µl，每种浓度设三个重复，分别加样至各圆片上。室温孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。</li>
	<li>向每张滤纸圆片上加样 10 µl 辣根过氧化物酶（HRP）标记的小鼠 IgG-Fc 片段抗体（1:10,000 稀释，溶于 10 mM PBS，pH 7.4），室温孵育 1 小时。</li>
	<li>将滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。 
	注意：无需完全去除洗涤缓冲液，因为缓冲液的存在不影响检测结果。</li>
	<li>向每张圆片上加样 10 µl TMB 与过氧化氢的混合液。</li>
	<li>孵育 5 分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄所有滤纸圆片的图像。 
	注意：在 图 6A 中，“0”代表仅进行了捕获抗体固定化处理，并加入了抗体-HRP/TMB 溶液但未加 IgG 血清的滤纸圆片。</li>
	<li>使用 Image J 软件分析图像中每张滤纸圆片的信号强度。
	<ol>
		<li>将步骤 3.15 中拍摄的图像转换为 '.tif' 格式。</li>
		<li>打开 'Image J' 软件。</li>
		<li>点击 'File → Open'，选择待分析的图像。</li>
		<li>选择形状工具中的 'Oval'（椭圆）。</li>
		<li>点击 'Image → Type → 32 bit'。</li>
		<li>点击 'Edit → Invert'（反相）。</li>
		<li>点击 'Analyze → Measure'（分析→测量）。</li>
		<li>将测得的数据复制至电子表格中进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过将纯化的山羊抗小鼠IgG-Fc捕获抗体直接包被于未经修饰的纤维素纸片上，用于检测IgG浓度。结果表明，为确保实验的可重复性，需对捕获抗体进行进一步固定。硅烷化技术成功地在纤维素纸片上引入了氨基功能团34。APS的浓度影响抗体的固定效果，因此也对丙酮中APS的用量进行了优化。在10 ml丙酮中加入1 ml APS为最佳浓度，可有效接枝氨基，进而通过戊二醛交联剂实现抗体的固定。抗体通过高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法两种方式被接枝到纤维素纸片上。研究结果表明，对于中流速和快速流速的滤纸片，戊二醛交联法固定的抗体结合能力优于高碘酸盐氧化法。此外，通过戊二醛交联法固定在纤维素纸片上的捕获抗体保持了其功能活性，并且即使纸片经受了15次涡旋洗涤所产生的机械应力，抗体仍能稳定地固定在纸片上。实验发现，10%脱脂奶粉封闭缓冲液在经历15次洗涤后仍能保持其封闭效率（图S5）。
共价固定的抗体被用于进行针对IgG检测的夹心ELISA。使用基于纸片的检测方法，肉眼即可检测到浓度为100 ng/ml的IgG。当每一步均孵育一小时时，IgG血清浓度在0...

即时检测（POCT）诊断研究对于开发新的治疗策略、个性化医疗和家庭护理具有重要意义1纤维素纸被广泛用作免疫测定的平台，因其成本低廉、易于获取且用户熟悉。2此外，纤维素纸的多孔结构具有在无需额外能量输入的情况下驱动液体流动的能力。基于纸张的生物分析记录最早可追溯至20世纪th 世纪，纸色谱法于1952年首次被发明。最常见的例子是免疫层析试验3，例如妊娠和血糖试纸条。这些检测方法具有相对较短的检测时间和低廉的分析成本4由于其操作简便，这些传统的试纸条检测方法已广泛应用于即时检验（POCT）诊断中5.
已有报道采用比色法6、电化学法7和电化学发光法8等检测方法来测定生物样本中的目标物。除了这些定量方法外，将抗体稳定固定在纤维素纸上的可靠方法对于诊断装置的开发也至关重要。非特异性吸附是将抗体修饰到纸质装置表面的主要策略9, 10，以确保抗体固定后对其靶标具有最大结合能力。然而，先前一项研究 表明，吸附在纤维素纸上的抗体可能从纤维上解吸，解吸率高达40%11 。因此，将抗体直接吸附在纤维素上可能无法提供可重复的实验结果12。将抗体通过共价键接枝到纸张表面进行共价固定，是开发高效纸质生物检测方法的另一种替代策略13。已有多种方法被报道用于纤维素的修饰14, 15。理想情况下，抗体在固定后应保持其原有的功能活性12。已有研究使用碳酰二咪唑联合四氟硼酸-1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓16；通过基于紫外活化的1-氟-2-硝基-4-叠氮苯17, 18；基于木葡聚糖修饰的化学酶法策略19；1,4-亚苯基二异硫氰酸酯交联剂20；杂多糖氧化21、点击化学22；以及阳离子卟啉23等方法，实现生物分子在纤维素纸上的共价固定。壳聚糖修饰的纸张因其来源丰富且具有良好的生物相容性27，已被用于开发基于纸张的免疫检测装置24-26。壳聚糖带正电荷，可牢固地吸附于带负电荷的纤维素表面27。捕获抗体通过壳聚糖涂层与戊二醛交联的方式固定在纸张上。高碘酸盐氧化是另一种将捕获抗体接枝到纤维素纸上的方法28。该方法通过在纸上点加高碘酸钠，将纤维素中的1,2-二羟基（邻二醇）基团直接转化为醛基。随后利用这些醛基在多糖与抗体之间形成共价键28。尽管该制备方法简单，但高碘酸钠难以彻底清洗干净。残留的高碘酸钠可能导致已固定在纤维素纸上的抗体发生进一步氧化，从而影响抗体的活性与稳定性。N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺交联剂也已被用于将抗体共价固定在电纺聚-L-乳酸和醋酸纤维素纳米纤维上，以开发基于纳米纤维的检测方法29。
本研究采用硅烷偶联技术将氨基官能团接枝到纤维素纸片上。该技术有助于保持纤维素滤纸原有的孔径、毛细渗透性和过滤速率，从而在免疫分析中实现最大的垂直流过效果。硅烷偶联技术已广泛应用于生物传感器中，用于在基底表面引入仲胺基团，随后进一步通过生物分子进行修饰。基质表面氨基的接枝过程包括有机功能硅烷试剂的-OH基团与基质基底之间的缩合反应30。本研究通过3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APS）31，利用硅烷偶联法对纤维素纸片进行氨基官能化。随后采用两种不同方法共价固定捕获抗体。第一种方法是将高碘酸盐氧化后的捕获抗体与氨基官能化的纤维素纸片结合；第二种方法则使用戊二醛作为交联剂，将捕获抗体连接至含氨基官能团的纤维素纸片上。通过兔抗人IgG-异硫氰酸荧光素（FITC）标记物并结合荧光分子成像仪检测，确认了捕获抗体的存在。同时，利用过氧化物酶底物评估了兔抗人IgG-FITC与羊抗兔IgG之间的结合活性。研究还考察了不同浓度的高碘酸钠、戊二醛以及捕获抗体的影响。最终，通过检测IgG血清成功完成了固定化捕获抗体的应用测试。

<table><tbody><tr><td>纤维素滤纸，1号规格（中速流动滤纸）</td><td>GE Healthcare Pte Ltd Singapore&amp;nbsp;</td><td>1001 110</td><td></td></tr><tr><td>纤维素滤纸，113号规格（快速流动滤纸）</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>1113-320</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>G6257</td><td>Ⅱ级，25% 水溶液 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>表面活性剂</td><td>Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Singapore</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Louis Fran&amp;ccedil;ois&amp;nbsp;</td><td></td><td>由 Kitchen Capers, Singapore 分装</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td>Merck</td><td>106597</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>106585</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>CALBIOCHEM</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS 含有 137&amp;nbsp;mmol/L NaCl、2.7&amp;nbsp;mmol/L KCl、8.0&amp;nbsp;mmol&amp;#8288;/&amp;#8288;L Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 1.5&amp;nbsp;mmol/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，使用水配制，并用 0.1&amp;nbsp;mol/L NaOH 或 0.1&amp;nbsp;mol/L HCl 调节至 pH 7.4</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore</td><td>9005-68</td><td></td></tr><tr><td>TMB 与过氧化氢溶液混合物&amp;nbsp;</td><td>1-Step ultra TMB-ELISA 溶液，Thermo Scientific Pierce</td><td>34029</td><td>1 L</td></tr><tr><td>兔抗人 IgG-FITC</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapore</td><td>sc-2278</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG</td><td>TWC/Bio Pte Ltd Singapore</td><td>sc-2030</td><td></td></tr><tr><td>亲和纯化的山羊抗小鼠 IgG-Fc 包被抗体</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠参考血清</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>RS10-101-5</td><td>9.5 mg/ml</td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG-Fc 检测抗体</td><td>Bethyl Laboratories, Inc</td><td>A90-131P</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>傅里叶变换红外光谱仪</td><td>Shimadzu IR Prestige-21&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>荧光分子成像仪</td><td>Pharos FXTM plus 分子成像仪，Bio-Rad, Singapore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>NUVE FN500</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Turbo 混匀仪 VM-2000</td><td>MYC LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>RGB，免费下载</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

抗体共价结合至纤维素纸片及其在肉眼可见比色免疫测定中的应用

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

本报告介绍了两种将捕获抗体共价固定在1号纤维素滤纸（中速流动滤纸）圆片和113号纤维素滤纸（快速流动滤纸）圆片上的方法。在抗体固定之前，这些纤维素纸片通过硅烷偶联技术接枝了氨基官能团。采用高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法将捕获抗体接枝到纤维素纸片表面。为了确保抗体固定后对其靶标的结合能力达到最大，研究了不同浓度的高碘酸钠、戊二醛以及捕获抗体对纸片表面固定效果的影响。通过戊二醛交联剂将抗体包被在氨基功能化纤维素纸片上后，其对靶标的结合活性优于高碘酸盐氧化法。本研究以小鼠参考血清中的IgG作为参考靶标，用于验证通过戊二醛共价固定抗体的应用效果。成功开发并验证了一种新型基于纸张的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法用于检测IgG。该方法无需仪器设备，可检测低至100 ng/ml的IgG。快速流动滤纸比中速流动滤纸更灵敏。该检测方法孵育时间短，所需样本体积小。这种肉眼可视的比色免疫测定法可进一步拓展用于检测传统ELISA可识别的其他靶标。

<img alt="显示吸收率与波数关系的纤维素纸张类型的红外光谱图" src="/files/ftp_upload/54111/54111fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 未处理及 APS 处理的中速流速滤纸（A）和快速流速滤纸（B）的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。A. 未处理中速流速滤纸的光谱与经 APS 处理的中速流速滤纸相似。在 902–1,170 cm-1 和 1,210–1,500 cm-1 波段，APS 处理滤纸的强度增强，分别归属于 Si-O-纤维素键以及 SiOC-H 基团的 C-H 变形振动。在 1,650 cm-1 和 2,885 cm-1 处波段的增强分别归属于硅烷丙基部分的 -NH2 弯曲振动和 CH2 振动。 ...

本文介绍了在纸质圆片上共价固定抗体的高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法。评估了固定化抗体的结合活性。根据这些结果，采用戊二醛交联法开发了一种用于检测免疫球蛋白G（IgG）的新型纸质免疫分析方法。

本报告介绍了两种将捕获抗体共价固定在1号纤维素滤纸（中速滤纸）上的方法……

本方法的总体目标是将抗体和蛋白质稳定固定在纤维素基质上，以促进肉眼可视的比色免疫分析法的开发，从而有助于即时诊断领域的应用。该方法有助于解决即时诊断领域中的一些关键问题。该技术的主要优势在于，它能够帮助蛋白质在纤维素材料上保持稳定，从而推动低成本纸质诊断检测方法的开发。演示该实验步骤的是我实验室的学生 Gloria Chang。首先，准备一张边长为一厘米的正方形纸片。同时，使用打孔器从 Whatman 一号纤维素滤纸上制备 100 个直径为 6.0 毫米的圆形纸片。为了在纸片上引入氨基，于通风橱中将1毫升APS与10毫升丙酮加入50毫升玻璃瓶中混合。将纸片加入新鲜配制的APS试剂混合液中，然后在室温下以旋转振荡方式孵育5小时。将50毫升玻璃瓶中的过量溶液倾倒至有机废液容器中。向玻璃瓶中加入10毫升丙酮，充分混匀后完全倾倒，以去除未反应的APS及其他杂质。重复此步骤两次。将纸片平铺在纸巾上，置于110摄氏度的烘箱中烘烤3小时。待纸片冷却后，将其储存在50毫升离心管中，室温保存。采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测纤维素方形纸片上胺基的接枝情况。打开傅里叶变换红外光谱（FTIR）软件。进入测量初始化界面。选择矩形区域下方的数据，并将测量模式设为百分比透光率。然后选择 Happ-Genzel 作为切趾函数，设置扫描次数为 45，分辨率为 4.0，并将波数范围设置为最小值 400 至最大值 4,000。点击“测量”，然后选择数据文件作为背景数据。点击 BKG 以获取背景基线。接下来，将方形纸片固定在薄膜样品架上。然后选择样品数据的数据文件，点击“样品”以获取样品的光谱。关闭傅里叶变换红外光谱（FTIR）应用程序并关闭计算机。向一个20毫升的玻璃瓶中加入5毫升0.05%戊二醛溶液。将15个氨基功能化的中流速滤纸圆片浸入该溶液中，在室温下振荡孵育1小时。同时，重复此步骤以制备另外15个醛基功能化的快速流速滤纸圆片。为了去除纸片上未反应的戊二醛，首先将中速滤纸片和快速滤纸片分别放入两个15毫升离心管中。然后向每个离心管中加入5毫升去离子水，振荡10秒。用移液器抽吸去除水分。重复两次以去除未反应的戊二醛。然后将纸片置于37摄氏度烘箱中干燥。干燥后，向中速流动滤纸片加入5微升浓度为0.025毫克/毫升的小鼠IgG Fc片段抗体，向快速流动滤纸片加入8微升。孵育20分钟后，在不移除抗体的情况下，向每个纸片加入10微升50毫摩尔的PBS（pH 7.4）。继续孵育40分钟以进行胺醛反应。将纸片置于纸巾上，用0.2毫升洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。将纸片在37摄氏度的烘箱中干燥后，每张纸片加入15微升封闭缓冲液，在室温下封闭10分钟。然后将每张纸片置于纸巾上，用0.2毫升洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。接着，进行IgG标准品检测。将不同浓度的IgG各10微升，每种浓度设三个复孔，分别加入到独立的反应孔中。室温孵育1小时。在纸巾上用0.2毫升洗涤缓冲液清洗纸片，重复洗涤3次。洗涤后，加入10 µL HRP标记的小鼠IgG Fc片段抗体，室温孵育1小时。将纸片置于纸巾上，用0.2 mL洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。最后，将10微升TMB与过氧化氢的混合液加载到每个圆片上。孵育5分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄所有纸质圆片的图像，并按照文本方案中讨论的方法进行分析。图中显示的是未经处理和经APS处理的中速流动滤纸与快速流动滤纸的FTIR光谱。中速流动滤纸在 902 和 1,170 cm⁻¹ 以及 1,210 至 1,500 cm⁻¹ 处谱带强度的增加，以及快速流动滤纸在 972 至 1,180 cm⁻¹ 范围内的特征峰表明，APS 已成功接枝到纤维素滤纸上。此处展示了不同浓度的戊二醛对 IgG-FITC 在纸片上固定化的影响。戊二醛的最佳浓度为 0.05%。同样，也展示了不同浓度的 IgG-FITC 对其自身在纸片上固定化的影响。增加IgG FITC的载量和浓度会提高其在纸盘上的固定量。然而，固定的IgG FITC浓度增加并不会提高其与抗原的结合能力。图中显示的是通过基于纸张的ELISA法测定IgG的校准曲线。使用这种基于纸张的检测方法，通过肉眼即可检测到浓度为每毫升一纳克 IgG 的抗体。当每一步孵育时间为一小时时，IgG 血清浓度在 0 至 500 纳克每毫升范围内与比色强度呈线性关系。观看本视频后，您应能充分理解如何将抗体固定在细胞基质上以开发免疫测定方法。最初，我们在开发低成本诊断检测方法时产生了这一想法，因为这些方法的灵敏度有限。该技术开发成功后，为现场即时诊断领域的研究人员探索针对各种病原体的低成本现场诊断检测方法的开发铺平了道路。

covalent-binding-antibodies-to-cellulose-paper-discs-their

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

共价结合的抗体，以纤维素纸光盘及其裸眼比色法免疫分析应用

本视频展示了化学偶联的抗体-抗原复合物的检测方法 通过...

酶联免疫吸附测定法验证化学偶联的抗体-抗原结合物

该视频展示了一种基于纸张的免疫分析方法，该方法采用胺基功能化的纤维素圆片，并通过戊二醛进行交联。首先将特异性识别IgG-Fc段的捕获抗体共价固定在圆片上，随后加入免疫球蛋白G和辣根过氧化物酶标记的检测抗体，若存在免疫球蛋白G，则发生显色反应，通过颜色变化予以确认。...

一种用于检测免疫球蛋白 G 的纸质免疫分析法

本方案描述了两种IgG类单克隆抗体（mAbs）的制备，这些抗体对鲸目动物的肌红蛋白具有强反应性。这些单克隆抗体被应用于基于夹心法的胶体金免疫层析试纸条，以区分鲸目动物与海豹及其他动物的肌红蛋白。...

基于胶体金的免疫层析试纸条的研制及其在鲸类肌红蛋白检测中的应用

基于纳米颗粒的光学探针已被设计为用于通过拉曼光谱和紫外-可见光谱检测抗原的载体。本文描述了一种制备此类探针用于紫外-可见/拉曼光谱免疫分析的方案，该方案可整合未来的多重检测能力。...

构建紫外-可见光与拉曼光谱免疫分析平台

我们展示了一种“卡扣芯片”技术，通过简单地将两张载玻片卡合，即可实现无交叉反应的多重夹心免疫测定。该技术使用一种卡扣装置，可可靠地将试剂从一个微阵列转移至另一个微阵列。这种卡扣芯片可用于任何需要不同试剂共定位且避免交叉污染的生化反应。...

用于无交叉反应和无点样多重夹心免疫测定的Snap Chip

本研究展示了印刷糖阵列（PGA）技术在分析小型动物体内循环抗碳水化合物抗体方面的潜力。...

打印型聚糖芯片：一种用于分析小型动物循环中抗碳水化合物抗体谱的灵敏技术

基于膜的侧向流动免疫层析试纸条（ICSs）是用于低成本自我诊断的实用工具，已有效应用于毒素、...

用于小分子化合物快速定量检测的侧向流动免疫层析试纸条的开发

本方案描述了一种用于制备乳胶微球的方法，该微球可用于基于IgY抗体的抗原检测实验。...

基于卵黄抗体的流式微球阵列检测标准化

针对紧迫的登革热诊断需求，本文介绍了一种与智能手机应用程序集成的基于纸张的登革热NS1抗原检测装置（DEN-NS1-PAD），可用于定量临床血清/血液样本中的登革热NS1抗原浓度。该创新技术有助于在各类医疗环境中进行临床决策，即使在资源有限的地区也能提升登革热的管理水平。...

便携式纸质免疫分析法结合智能手机应用程序用于登革病毒NS1抗原的比色与定量检测

本文介绍了一种量子点纳米微球（QDNB）的制备方法，以及利用基于QDNB的侧向层析免疫检测试纸条检测疾病生物标志物的方案。检测结果可在15分钟内通过紫外光照射进行定性判读，或使用荧光试纸条读数仪进行定量测定。...

基于量子点纳米珠的荧光侧向流免疫分析法

我们介绍一种基于无细胞合成生物学原理和点印迹技术的新型免疫检测平台，可用于定制化检测人和动物血清中的抗体反应。...

无细胞点印迹法作为一种实用且可灵活调整的免疫检测平台，用于检测人和动物血清中的抗体反应

学习使用高碘酸盐氧化和戊二醛交联技术将抗体共价固定在纤维素纸圆片上，开发用于IgG检测的裸眼比色免疫分析方法。该方法为即时诊断提供了低成本、稳定的蛋白质固定方案。

抗体共价结合至纤维素纸片及其在肉眼可见比色免疫测定中的应用

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