Name: 临床样品RNA病毒的无偏深度测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习无偏深度测序技术用于临床样品中RNA病毒的基因组分析。该方法采用随机引物cDNA合成和RNase H选择性去除技术，无需先验序列知识即可实现拉沙病毒和埃博拉病毒等病原体的快速检测与进化研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由美国国立卫生研究院主任办公室创新奖（编号：DP2OD06514）（PCS）的联邦资金资助，以及由美国卫生与公共服务部下属的美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所根据合同（编号：HHSN272200900018C、HHSN272200900049C 和 U19AI110818）提供资助。

伦理声明：拉沙热患者是根据杜兰大学、哈佛大学、布罗德研究所、尼日利亚伊瑞瓦专科教学医院（ISTH）、凯内马政府医院（KGH）、尼日利亚伊巴丹奥约州卫生部以及塞拉利昂卫生部人类受试者委员会批准的方案招募进入本研究的。所有患者均接受同等标准的治疗护理，并被提供抗病毒药物利巴韦林，无论其是否决定参与本研究。对于拉沙热（LF）患者，利巴韦林的治疗遵循目前推荐的治疗指南，通常在高度怀疑患有拉沙热后立即给予。
由于埃博拉病毒病（EVD）疫情严重暴发，无法通过我们的标准方案获得患者的知情同意。因此，使用在塞拉利昂和哈佛大学的机构审查委员会评估并批准的EVD患者临床剩余样本。塞拉利昂伦理与科学审查委员会办公室、塞拉利昂卫生与环境卫生部以及哈佛大学人类受试者使用委员会已批准豁免知情同意，允许对在塞拉利昂埃博拉疫情中采集的患者及密切接触者样本中获得的病毒序列进行测序并公开发布。这些机构还批准使用在疫情应对期间接受治疗的所有疑似EVD患者所采集的去标识化样本的临床和流行病学数据。塞拉利昂卫生与环境卫生部还批准将非传染性、非生物性样本从塞拉利昂运往布罗德研究所和哈佛大学，用于疫情样本的基因组研究。
1. 样品RNA的DNase处理（最多55 µl提取的总RNA，约4小时）
<ol>
	<li>在生物安全柜中的冰上，按照所述方法在96孔PCR板中设置DNase反应 表1，步骤1.1（总体积， 70 µl/well）。注意：可配制预混液。</li>
	<li>轻轻且充分涡旋振荡，然后在室温下以280 x g离心1分钟。</li>
	<li>孵育于 37 °C 30分钟</li>
	<li>使用 RNA 固相可逆固定（SPRI）磁珠进行纯化。
	<ol>
		<li>将RNA beads在RT下孵育30分钟。</li>
		<li>轻轻摇动RNA磁珠瓶，以重悬可能已沉降的磁性颗粒。加入1.8倍体积（126 µl) RNA珠与经DNase处理的RNA的比值70 µl），用移液器吹打混合10次，在室温下孵育5分钟（孔中总体积， 196 µl).</li>
		<li>将混合物置于磁力架上，等待溶液澄清（5 - 10 分钟）。</li>
		<li>移除站上的上清液，用移液器吸出并弃去。在站上操作，用70%乙醇覆盖沉淀以洗涤磁珠，孵育1分钟。用移液器吸出乙醇并弃去。共重复洗涤两次。 
		注意：使用精确配制的70%新鲜乙醇至关重要，因为浓度过高将导致对较小分子的洗涤效率降低，而 &lt;70% 乙醇可能导致样品损失7.</li>
		<li>将培养板留在工作台上并敞开放置以晾干。注意：务必让磁珠充分干燥，直至磁珠表面开始出现裂纹。</li>
		<li>添加 55 µl 加入无核酸酶水至孔板中以洗脱RNA。从仪器上取下孔板，用移液器充分吹打混合磁珠与水。注意：也可使用较少的水量（≤ 10 µl) 以浓缩总 RNA。</li>
		<li>将培养板放回工作站。待溶液澄清后，用移液器转移至新的螺旋盖管中，用于长期保存（-80 °C）。放置 5 µl 用于去除的新的96孔PCR板中的RNA（步骤2.4）。</li>
		<li>可选：保存并稀释 1 µl 在 19 µl 水（1:20），用于rRNA的qRT-PCR例如，18S，28S rRNA) (表 2）和病毒标志物5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从病毒RNA样本中选择性去除核糖体RNA和载体RNA（约4小时）
<ol>
	<li>按照 表1 中所述方法配制含线性丙烯酰胺载体的5倍杂交缓冲液、10倍RNase H反应缓冲液以及无核酸酶水。</li>
	<li>在冰上，于96孔PCR板中将RNA与rRNA去除寡核苷酸（表3）及寡核苷酸(dT)混合，建立杂交反应，具体如 表1 所述。 
	注意：可预先配制总反应混合液。可加入50飞克（fg）一种独特的合成RNA（ERCCs8），用于追踪病毒测序过程及潜在的索引读段交叉污染。
	<ol>
		<li>轻轻涡旋充分混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。 
		在95 °C孵育2分钟，以每秒-0.1 °C的缓慢斜率降温至45 °C。将热循环仪暂停在45 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照 表1 中所述方法在冰上配制RNase H反应混合液，然后在45 °C预热2分钟。注意：可预先配制总反应混合液。
	<ol>
		<li>在保持PCR板处于45 °C热循环仪中的条件下，将预热的RNase H反应液加入杂交反应体系中。</li>
		<li>通过轻柔吹打6–8次充分混匀，于45 °C继续孵育30分钟。随后置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照 表1 中所述方法在冰上配制DNase反应混合液。注意：可预先配制总反应混合液。
	<ol>
		<li>将DNase反应液加入PCR板中的RNase H反应体系中，轻轻涡旋充分混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。于37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>加入5 µl 0.5 M EDTA终止DNase反应。轻轻涡旋充分混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用RNA磁珠（见步骤1.3）进行纯化，加入1.8倍体积（144 µl）磁珠。用11 µl无核酸酶水洗脱。注意：为安全冷藏保存，建议将去除rRNA后的RNA样本在-80 °C过夜保存。</li>
</ol>
3. cDNA 合成（约 6 小时）
<ol>
	<li>按照表1所述，在冰上将rRNA/载体耗尽的RNA与随机引物在96孔PCR板中混合，轻轻涡旋并充分混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。
	<ol>
		<li>在热循环仪中于70 °C加热混合物10分钟。热变性后立即置于冰上冷却1至5分钟。在进行第一链合成反应前，RNA在冰上静置时间不得超过5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照表1所述，在冰上配制第一链合成反应混合液。 
	注意：可预先配制总混合液（master mix）。
	<ol>
		<li>将其加入板中的RNA/随机引物混合液中，轻轻涡旋并充分混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。在22 - 25 °C孵育10分钟。</li>
		<li>在空气孵育箱中于55 °C孵育60分钟。将板置于冰上以终止反应。注意：推荐使用空气孵育箱，以便在第一链合成反应过程中实现缓慢升温，使引物充分退火并启动第一链的延伸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照表1所述，在冰上配制第二链合成反应混合液。 
	注意：可预先配制总混合液（master mix）。
	<ol>
		<li>将其加入板中的第一链合成反应体系中，轻轻涡旋并充分混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。在16 °C孵育2小时（保持盖温为25 °C）。温度不得超过16 °C。</li>
		<li>将板置于冰上，然后加入5 µl 0.5 M EDTA以终止反应，轻轻且充分混匀，再在室温下以280 × g离心1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用DNA磁珠进行纯化（纯化步骤参见1.3），加入1.8倍体积（153 µl）的磁珠。用9 µl洗脱缓冲液（EB）洗脱。保留1 µl用于定量。后续步骤使用1 ng cDNA。若cDNA浓度过低无法检测，则使用4 µl cDNA进行片段化（参见步骤4.1）。</li>
	<li>为安全冷藏，可将双链cDNA短期保存于4 °C过夜，或长期保存于-20 °C。</li>
</ol>
4. 文库制备——DNA文库构建（约4小时）
<ol>
	<li>转移 4 µl 将cDNA加入96孔板中，并将剩余的cDNA保存，以备需要时进行第二次尝试。</li>
	<li>在冰上按照以下所述设置转座反应 表1. 
	注意：可预先配制混合液。为降低背景信号并减少总体成本，将片段化反应的总体积从 20 减少至 10 µl. 由于cDNA是限制因素，ATM的量（即， 反应中所用的转座子（transposome）用量也相应减少，以降低整合位点的数量。
	<ol>
		<li>将标签化混合物加入到平板中的 cDNA 中，轻轻涡旋混匀，280 × g（室温）离心 1 分钟。孵育于 55 °C 5 分钟，保持 10 °C.</li>
		<li>一旦到达 10 °C立即加入 2.5 µl 加入中和片段化缓冲液（NT）以终止反应。用移液器吹打混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。</li>
		<li>室温孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上按照所述方法设置PCR扩增反应 表1.
	<ol>
		<li>轻轻且充分涡旋混匀，然后在室温下以 280 × g 离心 1 分钟。</li>
		<li>使用所述条件在热循环仪中进行PCR 表1. 
		注意：对于1 ng的经转座酶处理的cDNA，建议进行12个PCR循环；然而，病毒临床样本中的cDNA含量通常极低甚至无法检测。当cDNA含量较低时（&lt;1 ng），可使用最多18个PCR循环以生成足够的文库用于测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库制备——测序前的纯化与文库合并
	<ol>
		<li>将样品补至 50 µl 与EB一起。</li>
		<li>使用0.6倍体积的DNA磁珠进行纯化（纯化步骤见1.3）30 µl)珠子。洗脱于 15 µl EB</li>
		<li>确定文库浓度（图3通过使用生物分析仪软件进行区域分析（150 至 1,000 bp）9，排除引物二聚体（约120 bp）对区域分析的干扰。注意：也可采用qPCR对文库进行定量 10.</li>
		<li>以不低于1 nM的最低摩尔浓度合并文库。若文库浓度低于1 nM，可加入少量该文库样本（约为其他文库体积的1倍）进行合并，以获取这些文库的序列信息。</li>
		<li>使用0.7倍体积的DNA磁珠对混合物进行纯化，步骤同上（见步骤2）。洗脱于 15 µl EB。注意：磁珠体积取决于混合液的最终体积。</li>
		<li>分析池9. 通过区域分析（150 至 1,000 bp）确定摩尔浓度9注意：也可使用qPCR来定量文库池 10.</li>
		<li>以10 pM文库浓度上机测序，生成101 bp双端双标签测序读长11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于EBOV分析的cDNA文库与引物二聚体的琼脂糖凝胶电泳。" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 从埃博拉病毒临床样本构建的文库。 4个代表性埃博拉病毒（EBOV）文库的凝胶图像。图中显示了文库片段和引物二聚体的区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Stremlau, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+rhabdoviruses+in+the+blood+of+healthy+individuals+from+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa.</a> PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631(2015).</li>
<li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345, 1369-1372 (2014).</li>
<li>Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+rRNA+enables+whole+transcriptome+profiling+of+archival+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue.</a> PLoS One. 7, e42882(2012).</li>
<li>Park, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebola+Virus+Epidemiology%2C+Transmission%2C+and+Evolution+during+Seven+Months+in+Sierra+Leone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone.</a> Cell. 161, 1516-1526 (2015).</li>
<li>Andersen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Sequencing+Uncovers+Origins+and+Evolution+of+Lassa+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus.</a> Cell. 162, 738-750 (2015).</li>
<li>Matranga, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+methods+for+unbiased+deep+sequencing+of+Lassa+and+Ebola+RNA+viruses+from+clinical+and+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples.</a> Genome Biol. 15, 519(2014).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).</li>
<li>Agilennt Technologies. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf.">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2946-90004_Vespucci_UG_eBook_(NoSecPack).pdf.</a> (2015).</li>
<li>Kapa Biosystems. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2015).</li>
<li>Illumina Technologies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf.">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf.</a> (2015).</li>
<li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3(2012).</li>
<li>Andrews, S. Babraham Bioinformatics. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses%2C+arenaviruses%2C+and+New+World+hantaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+high-resolution+analysis+of+blood+virome+and+host+cytokines+expression+profile+of+a+patient+with+fatal+H7N9+infection+by+massively+parallel+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing.</a> Clin Microbiol Infect. 21, e1-4 713(2015).</li>
<li>Simon-Loriere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+lineages+of+Ebola+virus+in+Guinea+during+the+2014+West+African+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic.</a> Nature. 524, 102-104 (2015).</li>
<li>Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empowering+African+genomics+for+infectious+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Empowering African genomics for infectious disease control.</a> Genome Biol. 15, 515(2014).</li>
<li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39, 19(2011).</li>
<li>Malboeuf, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+viral+RNA+genome+sequencing+of+ultra-low+copy+samples+by+sequence-independent+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification.</a> Nucleic Acids Res. 41, 13(2013).</li>
<li>Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+gene+sequences+and+hominoid+phylogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny.</a> Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nat Methods. 10, 623-629 (2013).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

该方案具有稳健性、通用性和快速测序的特点，在2014年埃博拉病毒暴发期间已被用于病毒测序2,4。通过将选择性耗竭和cDNA合成与基于标签片段化（tagmentation）的文库构建相结合，整体流程时间比此前的接头连接方法缩短了约2天。最近，该方案已被国际合作者及其他研究团队成功应用15,16，并将被推广至西非的实验室，以支持当地的基因组学研究和诊断工作17。
本方案采用随机引物制备用于病毒RNA测序文库的cDNA。与以往的病毒RNA测序方法不同，该方法无需预先了解序列信息，也无需针对特定病毒或进化枝设计复杂且耗时的引物。该方法可应用于任何病毒RNA样本。例如，该方法已成功用于埃博拉病毒和拉沙病毒样本的病毒组分分析6。此外，该方案也可用于宿主转录组、宏基因组及病原体发现测序项目1。
该实验方案的关键步骤是靶向RNase H消化，这是一种高通量、低成本的方法，用于从病毒样本中去除不需要的载体和宿主RNA。方案中的选择性耗竭步骤涉及多种组分，需要较高的操作技巧和准确性。在初始设置阶段应额外投入时间并谨慎操作。
由于大多数临床血清和血浆样本中的核酸物质含量极低，污染和样本损失较为常见。为避免这些问题，在使用本方案时应格外谨慎。首先，RNA极易降解，因此所有操作区域应保持清洁且无核酸酶。其次，为筛选适用于本方案的样本，应采用针对宿主RNA和病毒的qRT-PCR检测进行定量5,6。在将输入量与本方案的测序结果进行比较时发现，测序成功（即&#160;获得足够数据以完成病毒全基因组组装）与样本中总RNA含量至少达到100 pg且病毒拷贝数至少为1,000相关。第三，应避免样本接触环境中外源性核酸来源。此处所述方案应在生物安全柜中进行，以确保操作安全并减少环境污染物的引入。此外，我们课题组及其他研究团队已注意到，商用酶类可能是低输入样本中污染性细菌核酸的另一来源6,18。使用洁净的工作空间（例如，PCR操作台、生物安全柜）以及设置阴性对照（例如，水或缓冲液）将分别有助于减轻污染并追踪污染来源。对于总RNA含量&#60;100 pg的样本，仅应去除poly(rA)载体RNA，而不应去除rRNA，以确保获得高质量的测序结果，同时尽量减少样本损失。对于输入量极低的样本，cDNA扩增方法可能更为适用19，但应在cDNA合成前去除poly(rA)载体。
去除宿主rRNA可富集测序文库中的病毒成分，适用于多种样本类型，包括血清或血浆，以及啮齿类动物和非人灵长类动物的多种组织5,6。在非人生物中，去除后仍存在比对到28S rRNA的读长，表明28S rRNA在人类与其他物种之间保守性较低6,20。当将该方法用于非人来源的样本时，可能需要补充针对特定宿主差异性rRNA序列的DNA寡核苷酸3,21。
由于该实验方案无偏向性，病毒序列读长可能仅占文库总内容的一小部分。尽管核糖体RNA（rRNA）是宿主RNA中最丰富的种类，且rRNA读长仅有一小部分被保留（&#60;1%）在选择性去除后仍存在，所有其他宿主RNA（例如，mRNA）在耗尽后仍会残留，并可能导致样本中产生大量测序读段。因此 &#34;过采样&#34; (即为了获得足够的测序深度以进行病毒基因组组装和变异位点检测，需要对单个文库进行高通量测序（oversequencing）。在我们的研究中，每个样本力求测定约2000万条读长，以确保对病毒基因组及其相关变异和宏基因组内容的分析具有足够的测序深度。2,5在宏基因组学和病原体发现研究中，需要注意的是，污染性的宿主DNA会通过DNase消化被去除。因此，含有DNA基因组的病毒及其他病原体可能在此过程中丢失，但其RNA中间产物仍可能被测序。

来自临床样本的病毒下一代测序可用于研究感染的传播途径和流行病学特征，并有助于推动新型诊断方法、疫苗和治疗手段的研发。利用随机引物进行cDNA合成，已实现对差异较大、共感染或甚至 novel 病毒的基因组检测与组装1,2。与其他无偏倚方法一样，非目标污染物会占据大量测序读长，对测序结果产生负面影响。宿主核酸和聚(rA)载体RNA是现有许多病毒样本库中存在的主要污染物。
本方案描述了一种基于无偏倚的全RNA测序（total RNA-seq）技术高效且经济地对RNA病毒基因组进行深度测序的方法。该方法利用RNase H选择性去除步骤3，以清除不需要的宿主核糖体RNA和载体RNA。选择性去除可富集病毒序列内容（图1），并提升临床样本测序数据的整体质量（图2）。此外，本方案引入了标签化片段化（tagmentation）步骤，显著缩短了文库构建时间。这些方法已被用于快速生成埃博拉病毒和拉沙病毒基因组的大规模数据集2,4,5，并可广泛应用于多种RNA病毒的研究。最后，该方法不仅限于人类样本；已有研究在感染拉沙病毒的啮齿类动物及非人灵长类疾病模型的组织样本中验证了选择性去除策略的有效性5,6。
<img alt="RNA输入分析；18S rRNA拷贝数、LASV富集、临床分离株评估示意图。" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 总RNA含量反映了通过选择性耗竭富集拉沙病毒（Lassa Virus, LASV）的效果。 对九个不同临床分离株进行rRNA耗竭前后，初始总RNA含量（RNA输入）及独特拉沙病毒（LASV）序列读数（文库含量）的变化情况。本图改编自6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示碱基质量分数的测序循环图；poly(rA) 影响比较。" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 去除载体 RNA 后测序质量更高。来自质控报告13的受 poly(rA) 污染的拉沙病毒文库（红色）与对照文库（文库中未检测到载体，黑色）在每个测序循环中的中位碱基质量。双端测序的 Read 1 和 Read 2 已合并至文库 BAM 文件中，每个碱基位置的质量分数均显示于此。该图已根据文献6修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
病毒RNA测序方案详细描述了直接从临床和生物样本中提取的RNA构建文库的步骤。为确保个人安全，所有病毒血清、血浆和组织样本在进行RNA提取前，应先在适当的缓冲液中灭活。某些灭活和提取试剂盒中含有载体多聚(rA) RNA；该成分将在初始的RNase H选择性耗竭步骤中被去除。根据完全回收的预期，载体RNA的浓度为100 ng/µl。在本方案中，使用110 ng/µl的寡核苷酸dT RNA（即1.1倍载体浓度）进行耗竭。如果样本中不含多聚(rA)载体，则在耗竭前不应添加寡核苷酸(dT)。
以下方案适用于 24 个反应的 PCR 板格式（最多 250 µl 体积）。该方案的早期版本已在 Matranga 等人中报道。 等6.

<table><tbody><tr><td>96孔PCR板</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>八联管盖条</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50 ml 瓶装</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>RNA提取后步骤，2 U/&amp;micro;l，含缓冲液</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td></td><td></td><td>任意PCR仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI磁珠&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>用于RNA纯化的磁珠</td></tr><tr><td>实时定量PCR系统</td><td></td><td></td><td>任意系统</td></tr><tr><td>DynaMag-96侧裙磁板</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td></td><td></td><td>现配</td></tr><tr><td>qRT-PCR引物</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>见 &lt;strong&gt;表2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5 M NaCl&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>线性聚丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>覆盖完整rRNA区域的DNA寡核苷酸</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>见 &lt;strong&gt;表3&lt;/strong&gt;，订购实验室就绪型，浓度为100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt 长，脱盐处理</td></tr><tr><td>Hybridase耐热RNase H&amp;nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>选择性去除步骤后使用</td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase抑制剂</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>随机引物&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>主要为六聚体</td></tr><tr><td>10 mM dNTP混合液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III反转录酶&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>含第一链合成缓冲液、DTT</td></tr><tr><td>空气孵育仪</td><td></td><td></td><td>任意空气孵育仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext第二链合成（无dNTP）反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA聚合酶I&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI磁珠</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>用于DNA纯化的磁珠</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl，pH 8.5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit荧光计&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA样本制备试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA索引试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度D1000试剂</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度DNA试剂</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>文库定量完整试剂盒（通用型）</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>可替代Tapestation或BioAnalyzer用于文库定量</td></tr></tbody></table>

临床样本中rna病毒的无偏深度测序

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

本文概述了一种能够实现下一代RNA测序的实验方案 从头合成 从临床和生物来源收集的病毒基因组的组装及宿主内变异检测。该方法具有无偏性和普适性，采用随机引物进行cDNA合成，无需预先了解病毒序列信息。在文库构建前，利用基于RNase H的选择性消化方法去除病毒RNA样本中不需要的RNA，包括聚(rA)载体和核糖体RNA。选择性去除可提高病毒RNA测序文库的数据质量和唯一读段数量。此外，本方案采用基于转座酶的“标签片段化”（tagmentation）步骤，可缩短文库构建的总体时间。该方案已成功实现对600多个拉沙病毒和埃博拉病毒样本（包括血液和组织分离物）的快速深度测序，且广泛适用于其他微生物基因组学研究。

本方案能够从低起始量的病毒RNA样本中生成高质量的测序读段，同时富集独特的病毒序列内容。如图1所示，在所有样本中（与未去除的对照相比），该方案对拉沙病毒独特序列的富集倍数至少达到五倍，即使样本中仅含有约一百万个18S rRNA拷贝（约100 pg总RNA）。同样，测序成功率也与特定样本中的病毒含量呈正相关。以qRT-PCR作为病毒量的替代指标，含有约1,000个或更多病毒基因组拷贝的样本通常能够完成完整的基因组组装（数据未显示）。此外，去除聚(rA)载体可减少文库中A和T的同聚物序列，从而获得更洁净的文库制备产物，并确保更高质量的测序读段（图2）。来自低起始量病毒临床样本的最终文库，其片段长度通常较宽，范围在150至1,000 bp之间（图3）。
测序完成后，为降低样本误识别以及文库池中各文库之间的交叉干扰12，仅保留去复用过程中索引读段碱基质量分数为25（q25）且无任何错配的读段。病毒基因组的组装采用专为高度变异病毒设计的生物信息学分析流程2,4-6。这些工具可通过 https://github.com/broadinstitute/viral-ngs 获取，或通过商业云平台获得4。
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤 1.1：DNase 反应</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>每反应体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DNase 缓冲液</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>提取的病毒RNA</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase（2 U/&#181;l)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 2.1：5× 杂交缓冲液</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>1 ml 体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH 7.4)</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第2.1步：10x RNase H反应缓冲液</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>1 ml 体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl（pH 7.5）</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第2.1步：含线性丙烯酰胺的水</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>1 ml 缓冲液的体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>线性丙烯酰胺（5 mg/ml）</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">步骤 2.2：用于选择性去除的杂交反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>每反应体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x 杂交缓冲液</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rRNA 耗竭寡核苷酸混合物（100 &#181;M)</td>
			<td>1.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo(dT)（550 ng/μL）&#181;l)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>经DNase处理的总RNA&#160;</td>
			<td>最多 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>外源添加的RNA（可选）</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水（含线性丙烯酰胺）</td>
			<td>加至总体积 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">第2.3步：用于选择性去除的RNase H反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>每反应体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x RNase H反应缓冲液&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水（含线性丙烯酰胺）</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>耐热RNase H（5 U/&#181;l)</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">步骤 2.4：选择性耗竭后的 DNase 反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>每反应体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DNase 缓冲液</td>
			<td>7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水（含线性丙烯酰胺）</td>
			<td>44.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂（20 U/&#181;l)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase I (2.72 U/&#181;l)&#160;</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总反应体积（含 RNase H 反应）</td>
			<td>75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">步骤 3.1：&#160; cDNA合成，随机引物杂交</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>每反应体积（&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>去除rRNA/载体的RNA</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 &#181;g 随机引物</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第3.2步：第一链cDNA合成反应</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x 第一链反应缓冲液</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M DTT</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP 混合液</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase 抑制剂（20 U/&#181;l)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>逆转录酶（最后添加）</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积（含上述 RNA）</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">步骤 3.3：第二链 cDNA 合成反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNase水</td>
			<td>43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x 第二链反应缓冲液</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTP 混合液</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DNA连接酶（10 U/μL）&#181;l)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DNA聚合酶I（10 U/&#181;l)</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNase H（2 U/μL）&#181;l)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积（含1st 链反应</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>步骤 4.2：&#160; 标签化反应</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>扩增子片段化混合液（ATM）</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tagment DNA 缓冲液（TD）</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积（含 cDNA）</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第4.3步：文库PCR反应</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR预混液（NPM）</td>
			<td>7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index 1 引物（i7）</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index 2 引物（i5）</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总反应体积（含经标签化处理的cDNA）</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第4.3.2步：文库PCR反应条件</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 &#176;C，3 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 &#176;C，30秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">最多18个循环——95℃下10秒 &#176;C，55℃下30秒 &#176;C，72℃下30秒 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 &#176;C，5 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#176;C，永远</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：反应体系设置与缓冲液。 包含所有缓冲液和反应混合物成分的逐步说明表格。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td>序列 (5' 至 3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebola KGH FW</td>
			<td>GTCGTTCCAACAATCGAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebola KGH RV</td>
			<td>CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebola KULESH FW</td>
			<td>TCTGACATGGATTACCACAAGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebola KULESH RV</td>
			<td>GGATGACTCTTTGCCGAACAATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lassa SL FW</td>
			<td>GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lassa SL RV</td>
			<td>AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA FW</td>
			<td>TCCTTTAACGAGGATCCATTGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA RV</td>
			<td>CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：qRT-PCR引物序列。 用于检测宿主（18S rRNA）和病毒（埃博拉病毒和拉沙病毒）含量的引物。“KGH”指塞拉利昂的凯内马政府医院，埃博拉病毒引物在此进行了测试2。“Kulesh”为设计该引物组的研究人员14。
表3：核糖体RNA（rRNA）去除寡核苷酸。195条长度为50个核苷酸&#160;、与人类rRNA互补的序列，用于选择性去除步骤6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种快速且广泛适用的方法，用于对来自人类临床分离物的病毒样本进行无偏倚的RNA测序。

临床样本中RNA病毒的无偏深度测序

本文概述了一种新一代RNA测序方案，可实现对从宿主样本中采集的病毒基因组进行从头组装及宿主内变异检测。

本实验的总体目标是从临床样本中直接制备RNA病毒的测序文库，以实现病毒监测和进化研究。该方法可解答病毒基因组学与进化领域的关键科学问题，例如RNA病毒在宿主内及宿主间如何发生突变，以及其在人群中的传播机制。该技术的主要优势在于其无偏倚性。该方法在文库构建过程中无需已知病毒序列信息，因此可用于对任何病毒进行测序。该技术的应用前景包括检测和防控诸如拉沙热等病毒性疾病，因为我们所开发的诊断方法和治疗手段在根本上都依赖于病毒的基因组序列。选择性耗竭实验将由Adrianne Gladden进行演示。展示cDNA合成的是Sarah Winnicki，展示DNA文库构建的是Dolo Nosamiefan。首先，按照文本方案中表一的说明，使用无核酸酶水和线性丙烯酰胺载体配制5X杂交缓冲液和10X RNase H反应缓冲液。在置于冰上的金属块中的96孔PCR板内，通过混合先前提取并经过DNase处理的病毒RNA、核糖体RNA去除寡核苷酸以及寡核苷酸(dT)，建立杂交反应。注意：本方案中的所有反应均在条状管中配制并分装，以便与多通道移液器配合使用。轻轻但充分地涡旋混匀反应液，然后在室温下以280 × g离心1分钟。在95°C下孵育2分钟，然后以每秒-0.1°C的速率缓慢降温至45°C。随后将PCR仪暂停在45°C。在冰上的金属块中配制RNase H反应混合液，然后将该溶液在45°C预热2分钟。将96孔板仍置于45摄氏度的热循环仪中，向杂交反应中加入预热的RNase H混合液。轻轻吹打6至8次以充分混匀，然后在45摄氏度下继续孵育30分钟，随后置于冰上。接下来，按照文本方案中表一的描述，在冰上的金属块中配制DNase反应混合液。将混合物加入到孔板中的RNase H反应体系中。轻轻涡旋混匀，然后在室温下以280 × g离心1分钟。将孔板在37 °C孵育30分钟，随后加入5 µL 0.5 M EDTA以终止反应。轻轻且充分涡旋混匀反应板后，在室温下以280 × g离心1分钟。按照制造商建议，使用1.8倍体积的RNA磁珠纯化反应体系，并用11 μL无核酸酶水洗脱。将去除了目标成分的RNA样本于-80 °C保存过夜。此步骤需特别小心，否则可能导致样品损失或降解。为进行 cDNA 合成，将去除核糖体 RNA 载体的 RNA 与随机引物按照文本方案在冰上的金属块中加入 96 孔 PCR 板内进行混合。轻轻涡旋振荡并离心后，在热循环仪中将混合物于 70 摄氏度加热 10 分钟。热变性后立即将RNA置于冰上的金属块中，持续1至5分钟。接着，在配制好第一链合成反应混合液后，将其加入到板中的RNA随机引物混合液中。然后涡旋混匀并离心，于22至25摄氏度孵育10分钟。将培养板置于空气培养箱中，在 55 摄氏度下孵育 60 分钟。然后将培养板放入置于冰上的金属块中以终止反应。接着，配制第二链合成反应混合液，并将其加入培养板中的第一链合成反应体系中。按照之前的方法涡旋并离心后，将反应在16摄氏度孵育两小时。将反应板置于冰上的金属块中，加入5微升0.5摩尔EDTA以终止反应，随后按之前方法混匀并离心。使用1.8倍体积的DNA磁珠纯化反应产物，并用9微升洗脱缓冲液（EB）洗脱样品。留取1 µL用于定量。为安全冷藏，可将双链cDNA在4 °C下保存过夜，或在-20 °C下长期保存。为构建DNA文库，将4 µL cDNA转移至96孔板中，并保留剩余cDNA，以便必要时进行第二次检测尝试。在冰上的金属块中操作，按照文本方案中表一的说明设置标签化反应。然后将混合物加入96孔板中的cDNA中。涡旋振荡并离心后，将反应板在55摄氏度孵育5分钟，随后置于10摄氏度保存。当温度降至10摄氏度时，立即加入2.5 µL中和后的片段化缓冲液以终止反应。将板在280 ×g、室温下离心1分钟，随后在室温下孵育5分钟。现在按照文本方案中的描述，在冰上的金属块中设置PCR扩增反应。振荡并离心反应板后，进行 PCR 扩增。为制备文库，使用 EB 将各样本体积补至 50 µL。加入 0.6 倍体积的 DNA 磁珠纯化反应产物，并用 15 µL EB 洗脱。将文库混合，混合时各文库的摩尔浓度最低为 1 nM 或更高。如果文库浓度低于1纳摩尔，则向文库池中加入少量文库。最后，按照视频前面所述方法，使用0.7倍体积的DNA磁珠对文库池进行纯化，然后用15微升EB缓冲液洗脱样本。按照文字版实验方案进行分析。如图所示，本视频中描述的方案在所有含有至少一百万个18S核糖体RNA拷贝的样本中，将独特的拉沙病毒内容富集了至少五倍。该图表说明，通过去除聚(rA)载体可减少文库中A和T的同聚物序列，从而获得更纯净的样本，并确保测序读段质量更高。最后，此图显示，来自病毒含量较低的临床样本的最终文库通常具有较宽的片段分布范围，从150到1000个碱基对不等。一旦掌握，该技术若操作得当，可在三天内完成。在进行该操作时，需牢记大多数临床样本中的核酸材料极少，因此样品损失、污染以及 RNA 降解是常见问题。采用此方法后，还可进行RNA测序等其他实验，以回答更多科学问题，例如宿主如何响应病毒感染。该技术自建立以来，为西非地区病毒监测领域的研究人员追踪埃博拉病毒、拉沙病毒以及其他流行病原体的传播路径奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何直接从临床样本中制备RNA病毒的测序文库，从而开展病毒监测和进化研究。请注意，操作病毒病原体可能具有极高的危险性。在进行本实验操作时，必须始终采取适当的个人防护装备并遵守相应的生物安全等级规定。

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

临床样品RNA病毒的无偏深度测序

Virochip 是一种泛病毒微阵列，旨在基于保守序列同源性，同时检测所有已知病毒以及新病毒。本文演示如何运行 Virochip...

使用泛病毒微阵列检测技术（Virochip）对临床样本进行病毒病原体筛查

对病毒载量低于检测下限（50-75 拷贝/ml）的个体，其血浆中 HIV-1 RNA 水平的定量以及单个 HIV-1 基因组的测序均较为困难。本文介绍如何利用一种实时 PCR 检测方法提取并定量血浆病毒 RNA，该方法可稳定检测低至 0.3 拷贝/ml 的 HIV-1...

对标准临床检测方法无法检出病毒载量的HIV感染者进行HIV-1 RNA的扩增与定量

采用综合征性犬和马呼吸道PCR检测面板，描述了基于纳米级PCR技术对DNA和RNA病原体进行高通量检测的方法。...

基于纳米级PCR技术对动物样本中呼吸道病原体的高通量检测

本文介绍了一种鉴定具有双链DNA基因组植物病毒的新方法。我们采用标准方法从感染的叶片中提取DNA和RNA，并进行高通量测序。生物信息学工具将测序结果组装成重叠群，识别代表病毒基因组的重叠群，并将这些基因组归类到相应的分类群中。...

结合粗提病毒颗粒中的DNA分析与感病叶片中的RNA分析以发现新病毒基因组

纳米孔测序是一种新型技术，可在偏远地区和资源匮乏的环境中实现低成本测序。本文介绍了一种适用于此类条件的全血 mRNA...

使用纳米孔测序技术对全血 mRNA 进行测序

我们此前已验证了一种基于扩增子的乌苏图病毒（USUV）全基因组测序方案，该方案在纳米孔测序平台上进行。本文中，我们对所使用的方法进行了更详细的描述，并确定了纳米孔R10流通池的错误率。...

以乌苏图病毒为例验证全基因组纳米孔测序

一项公民科学项目旨在招募圣迭戈居民，以采集环境样本用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。项目开发了一个多语言的基于网络的平台，通过用户友好的移动设备界面提交数据。实验室信息管理系统支持采集数千份地理分布多样的样本，并实现对结果的实时追踪。...

对城市环境进行拭子采样——从环境储存库中采样与检测 SARS-CoV-2 的流程

本方案旨在定量废水中和空气样本中的SARS-CoV-2...

废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量与全基因组表征

本文介绍了一种利用纳米孔技术对狂犬病病毒（RABV）基因组进行快速且经济高效的表征工作流程。该工作流程旨在支持基于基因组信息的本地化监测，提供有关流行RABV谱系及其在区域系统发育树中位置的信息，以指导狂犬病防控措施的制定。...

利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

绝对定量RNA测序（AQRNA-seq）是一种用于量化生物混合物中所有小RNA分布的技术。本文展示了AQRNA-seq的文库构建和数据处理步骤，用于量化在饥饿诱导的休眠期间Mycobacterium bovis...

AQRNA-seq用于小RNA定量

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。...

利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

学习无偏深度测序技术用于临床样品中RNA病毒的基因组分析。该方法采用随机引物cDNA合成和RNase H选择性去除技术，无需先验序列知识即可实现拉沙病毒和埃博拉病毒等病原体的快速检测与进化研究。

临床样本中RNA病毒的无偏深度测序

探索更多视频