Name: 清醒、无拘无束的小鼠静脉输液同时记录肾交感神经活动和血压的新方法。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 了解清醒、自由活动小鼠肾交感神经活动与血压同步记录的新方法。该技术消除麻醉干扰，为心血管自主神经研究提供可靠的生理学评估手段。

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S.M.H. 获得加拿大卫生研究院（CIHR）和心脏 &amp;#38; 加拿大卒中基金会（HSFC）和阿尔伯塔创新健康解决方案（AiHS）；J.E.H. 获得美国国家心肺血液研究所（National Heart, Lung and Blood Institute）PO1HL-51971 项目资助。

所有实验操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》，并经密西西比大学医学中心机构动物护理与使用委员会批准。
1. 动物与饲养
<ol>
	<li>实验小鼠（24 - 35 g）到达机构实验动物设施后。</li>
	<li>在整个实验方案各阶段，为小鼠提供标准啮齿类动物饲料和自来水，可自由取食和饮用，饲养环境温度和湿度需严格控制。</li>
</ol>
2. 可植入RSNA电极的定制化制备
注意：应在预定手术前至少提前几天制备可植入的肾交感神经活动（RSNA）电极，以留出足够的时间进行固化和灭菌（如下所述）。
<ol>
	<li>用刀片（最好使用#11刀片）裁剪三段等长的绝缘不锈钢多股导线，每段250 mm（裸线直径0.0254 mm，涂层后直径0.14 mm）。用刀片刮除每段导线一端约15 mm的绝缘层，以暴露底层金属。
	<ol>
		<li>仅将两个导线的裸露端各焊接一个单芯公针连接器（黄铜材质，镀金），以制成双极电极引线（图1A）。第三根导线的末端保持裸露，作为接地线使用。</li>
		<li>将一段短的（约2.0–2.5 cm）直径为1.6 mm的热缩管套在针形连接器和导线上，完全覆盖导线与针形连接器之间新焊接的接头。 
		注意：插入放大器头级的针形连接器尖端必须保持裸露。</li>
		<li>用小镊子或止血钳夹住导线，置于热风枪上方加热，使热缩管收缩，从而对针形连接器与导线之间的连接处进行电气绝缘。对第二根导线/针形连接器重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裁剪一段200 mm长的聚乙烯管（PE 90；内径0.86 mm，外径1.27 mm）。将三根导线（两根引线+一根接地线）聚拢，将未处理的一端插入PE 90管中，并一起穿至管子的开口端（图1B）。 
	注意：PE 90管作为护套，用于固定和保护电极引线及接地线。
	<ol>
		<li>识别出接地线，并将其从PE 90护套中稍微多拉出一点，以便与双极电极引线区分开。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 电极尖端的构建
<ol>
	<li>使用解剖显微镜观察电极导线未受干扰的末端。将电极的三根松散导线穿过一段5 mm长的较小聚乙烯管（PE 10，内径0.28 mm，外径0.61 mm），以将电极导线固定在一起。
	<ol>
		<li>将一段1.5 mm长的PE 10管穿入三根电极导线中。将此管向前推进，使其距离初始的5 mm长PE 10管2.0 mm。</li>
		<li>将第二段1.5 mm长的PE 10管穿到两个双极电极引线的尖端，以覆盖并绝缘尖端，并将其与接地导线分离（图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用剪刀修剪导线多余的长度。</li>
	<li>使用一滴液体型氰基丙烯酸酯胶水将各段PE 10管粘接到电极导线上。在胶水瓶口安装一支钝化的25号针头，以提高操作控制性并减少溢出。
	<ol>
		<li>将针头尖端置于PE 10管与导线的连接处，然后挤出少量胶水，并观察胶水是否涂覆在PE管内部。</li>
		<li>让胶水充分固化过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于记录的电极尖端的精细制备
<ol>
	<li>使用 #11 手术刀片剥离双极电极尖端和接地导线尖端的绝缘涂层。切勿扰动或损伤内部的多股导线，否则会影响肾交感神经活动（RSNA）信号的质量。</li>
	<li>用弯头镊子夹住已制备的电极，使其位于 5.0 mm 和 1.5 mm 的 PE 10 固定点之间，并将导线弯折成 90° 角（图 1D）。 
	注意：此操作应使双极电极导线位于接地导线之上，从而处于最佳位置以托住神经束。</li>
</ol>
5. 锚定基座的构建
<ol>
	<li>通过截取一段长 3 cm 的聚乙烯管（内径 2.70 mm，外径 4.00 mm），制作一个基座，用于在电极引线暴露后将其稳定固定于小鼠肩胛中部区域。
	<ol>
		<li>用镊子夹住聚乙烯管，并在热风枪上加热一端。将加热后的管端垂直按压在冷却的金属表面，形成一个圆滑的凸缘或&#34;法兰&#34;。</li>
		<li>将此基座穿入已制备的电极上，使法兰朝向电极尖端。 
		注：PE 90 套管与基座组合可在电极引线从动物体内引出后提供保护。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 植入式电极制备完成后的灭菌
<ol>
	<li>将制备完成的电极单独包装在灭菌袋中，并在植入前进行臭氧灭菌（TSO3）。 
	注意：关于灭菌袋的具体类型和灭菌程序，请咨询当地医院的灭菌部门，不同机构之间可能存在差异。</li>
</ol>
7. 麻醉与手术准备
<ol>
	<li>手术开始前20分钟给予镇痛药物（美洛昔康，2 mg/kg，皮下注射）。将小鼠放入充满100%医用级氧气的诱导室中。调节蒸发器设置，以每次0.5%的增幅逐步增加异氟烷麻醉剂浓度，直至达到4%。通过轻压前肢和后肢的脚趾或足垫，评估其反射反应，并结合呼吸频率减慢情况，判断麻醉深度。
	<ol>
		<li>当动物达到手术麻醉平面且不再出现脚趾夹捏反射时，将其转移至手术台，并通过鼻罩维持1.5%至2%的异氟烷麻醉。在整个手术过程中定期重复检测脚趾夹捏反射，并持续监测呼吸频率。在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。</li>
		<li>始终使用凝胶填充式等温加热垫及配套手术台维持动物正常体温。将等温垫存放于37°C水浴中，并在手术过程中根据需要及时更换，以维持生理体温。</li>
		<li>在麻醉诱导后立即皮下注射格隆溴铵（50–70 µg/kg），以预防气道分泌物过度产生。在手术过程的中点（步骤9.1）再次给予相同剂量的格隆溴铵。</li>
		<li>所有手术操作均须在无菌条件下进行。确保所有手术器械在预定手术前已进行高压灭菌。按以下方法清洁手术区域（7.2.1），并在整个手术过程中保持无菌状态。
		<ol>
			<li>佩戴口罩、高压灭菌的隔离服和无菌一次性手套。使用70%乙醇清洁所有大型设备，如鹅颈灯、解剖显微镜和手术台。在手术过程中定期用70%乙醇擦拭外科手套，以确保无菌。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用小型动物电推剪去除小鼠左侧腰部、腹侧颈部区域以及背部肩胛中部区域的毛发，随后使用脱毛膏（敏感皮肤配方）进一步处理。
	<ol>
		<li>用手术清洁液（10%聚维酮碘）与70%乙醇交替清洗上述两个手术区域共三次，最后再用手术清洁液进行一次终末处理，完成手术区域准备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. RSNA 电极的手术植入
<ol>
	<li>将小鼠置于右侧卧位，头端朝向术者左侧，暴露动物的左侧 flank。使用手术刀（#11）在肩胛中部区域的皮肤上做一个5 mm的切口。 
	注意：此处为RSNA电极导线引出的位置。
	<ol>
		<li>进行第二次切口（&#60;在左侧腹壁皮肤上，于脊柱垂直方向、肋笼后方2 mm处做一个20 mm的切口。从该切口处通过皮下隧道将一支13G不锈钢针穿至背部出口处的切口。 
		注意：将针的锋利边缘锉平，使其成为光滑、无切割性的边缘。</li>
		<li>将已灭菌的可植入RSNA电极（步骤2-6）穿过13G针头。向后退出13G针头，使电极尖端置于左侧腹侧腹肌表面。将电极导线的一段留置于皮下，其余部分从背部切口引出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将电极尖端移至一侧。在8.1.1步骤中皮肤切口正下方的腹肌处做一切口。使用小棉签沿背部肌肉分离脂肪和结缔组织，暴露左肾。
	<ol>
		<li>使用显微牵开器打开手术视野并牵开肾脏。切勿牵拉肾神经血管束，以免造成肾神经的不可逆损伤，从而无法记录到有效的肾交感神经活动（RSNA）信号。 
		注意：钢制微型牵开器可由标准回形针和一段4-0丝线制成。&#160;确保这些拉钩与手术器械一同灭菌，以维持无菌技术。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在高倍解剖显微镜辅助下观察肾脏神经血管束。辨认肾神经束，其通常（但并非总是）沿肾动脉和肾静脉走行。使用精细的直头镊子将神经束从周围组织中分离出来。 
	注意：肾神经束呈不透明状，具有 &#34;绳索状&#34; 反光外观，与呈透明状的淋巴管不同，具有独特性。
	<ol>
		<li>尽量减少对神经束的操作。切勿触碰、牵拉或夹起神经束。避免损伤供应神经的细小血管及肾淋巴管，否则将影响神经的存活，并导致淋巴液持续积聚在神经/电极周围，从而干扰甚至完全消除神经信号。</li>
		<li>保持肾神经束完整，这将有助于维持神经的长期存活性，并确保神经与电极之间保持稳定接触（例如，切断的神经可能随着时间推移和机体自然活动而从电极上滑脱）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将RSNA电极尖端插入腹部。调整其位置，使双极电极尖端与地线垂直于肾神经血管束。进一步调节电极位置，确保地线与下方组织接触良好，同时电极不压迫肾血管，以免影响肾血液循环（图1D）。</li>
	<li>用弯头镊子抬起肾神经束。将电极尖端滑入神经下方，使神经与两根导线直接接触。
	<ol>
		<li>将一小片石蜡膜插入神经/双极导线与第三根（接地）导线之间（图1D）。 
		注意：植入前将石蜡膜在70%乙醇中浸泡消毒24小时，并用无菌生理盐水冲洗。</li>
		<li>使用小型吸水尖头棉签清除神经/电极周围的血液或液体，因为残留于神经或电极导线周围的任何液体都会阻碍或消除神经信号。</li>
		<li>如有需要，可快速检测RSNA信号的质量（设置方法见下文）。 
		注意：此操作必须迅速完成，因为暴露于空气中会使神经干燥，从而影响其活性。</li>
		<li>将双组分硅胶弹性体涂抹于神经/电极单元，确保硅胶在神经下方及周围充分铺展，实现完全的电绝缘（即不仅在神经上方滴加少量硅胶）。 
		注意：确保电极尖端也涂有硅胶。接地导线应保持与下方组织接触，因此弹性体无需在该导线下方积聚。避免使用过量的硅胶弹性体，否则可能阻碍肾脏血流，或随着时间推移因身体自然活动而脱落。</li>
		<li>等待硅胶弹性体完全固化1-2分钟，然后小心地掀起硅胶的外边缘 &#34;球状&#34; 用镊子夹取并涂抹少量液体配方外科粘合剂。 
		注意：切勿使用过量胶水，以免影响血液循环或扩散至神经，从而损害其活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用不连续的可吸收缝线（5-0）缝合腹部切口。用相同的缝线材料以类似方式缝合表层皮肤。</li>
</ol>
9. 血压遥测仪的植入
<ol>
	<li>将小鼠仰卧位重新放置，使其头端朝向手术者。根据需要调整麻醉面罩。此时给予第二次剂量的格隆溴铵（见7.1.3）。</li>
	<li>使用手术刀（#11）在颈部区域的皮肤上做一正中切口，切口从动物下颌下方开始，延伸至肋骨上方。分离腺体组织以暴露下方的颈部肌肉。暴露左侧颈总动脉，并将其与周围组织分离。 
	注意：操作时需格外小心，避免损伤迷走神经，否则可能导致术后死亡率升高。
	<ol>
		<li>将三段6-0丝线从动脉下方穿过。将第一根缝线尽可能靠头端放置，并打结以闭塞血管。第二根缝线置于血管中段，打结但保持松紧适度。最后一根缝线尽可能靠尾端放置，同样打结但保持松紧适度。</li>
		<li>将最靠头端的缝线提起，并用一小段脐带胶带固定于麻醉面罩上。使用显微蚊式钳夹住最靠尾端的缝线并向尾侧牵拉，以限制血管内的血流。</li>
		<li>使用精细弹簧剪刀在血管壁上尽可能靠头端处做一个小切口。将小鼠血压遥测导管插入血管，并向尾端推进至尾侧缝线处。
		<ol>
			<li>结扎中间的缝线以暂时固定导管，松开尾侧牵拉后继续推进导管10 mm。随后将缝线围绕导管打结，以确保其固定到位。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将遥测仪主体沿右侧腹侧皮下隧道引导至皮下囊袋中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 颈静脉导管的植入与体外固定
<ol>
	<li>使用小号棉签暴露右侧颈静脉。将两根6-0丝线穿过血管周围。
	<ol>
		<li>将第一根缝线尽可能靠头侧放置，并打结以阻断血管；将第二根缝线尽可能靠尾侧放置，并轻轻牵拉以阻止血管内血流。</li>
		<li>使用精细弹簧剪刀在血管壁上做一小切口，位置应尽可能靠近头侧缝线。用加热拉伸过的导管（外径1.02 mm，拉伸至外径0.64 mm）插入静脉，导管预先充满无菌生理盐水。 
		注意：确保使用手术刀片将导管尖端切割成圆滑斜面，以防止穿破血管。记录导管内液体体积（死腔体积）以供参考（见下文步骤14.4–14.6）。
		<ol>
			<li>将导管向前推进约8 mm进入静脉。通过将丝线围绕血管和导管打结，并在接口处滴加少量凝胶型氰基丙烯酸酯胶水，固定导管。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠置于左侧卧位。使用13G不锈钢针头将静脉导管从颈部皮下穿行至背部肩胛间区引出。</li>
	<li>将小鼠重新置于仰卧位。用间断缝合关闭颈部切口。</li>
	<li>将动物置于俯卧位。将一个小的皮下固定钮穿入静脉导管。用缝线将固定钮固定于皮下。将配套的不锈钢弹簧套入静脉导管，并将其固定在皮肤钮上，以保护导管。</li>
</ol>
11. 固定外置电极导线
<ol>
	<li>使用组织粘合剂将保护电极引线的聚乙烯基座固定在下方肌肉上。用缝线将覆盖的皮肤缝合在凸缘上，以提供进一步支撑。</li>
</ol>
12. 术后恢复
<ol>
	<li>对所有切口涂抹抗生素软膏。</li>
	<li>给予镇痛药物。在恢复期间，若动物出现疼痛或痛苦迹象，可根据需要追加给予镇痛药物。</li>
	<li>将小鼠置于铺有木屑垫料和纸巾的代谢笼中进行恢复。持续监测动物状态，在其恢复意识并能维持胸卧位之前不得无人看管。此时可引入环境丰富化物品以及食物和水（ad libitum）。</li>
	<li>将电极导线在笼外盘绕，直至实验开始时使用。</li>
	<li>在恢复期的前24小时内，将笼子放置于温热垫上。将不锈钢弹簧和静脉导管连接至旋转接头/输注系统，用于在恢复期间持续输注生理盐水（0.5 mL/hr）。</li>
	<li>由于体外化的导管和电极导线的特性，需确保动物单独饲养于专用笼具中。</li>
</ol>
13. 记录血压和肾交感神经活动的实验设置
<ol>
	<li>在不锈钢台面的防震台上安装一个简易法拉第笼。 
	注意：该法拉第笼可使用木制框架和铝制筛网构建。将台面/法拉第笼接地，以消除任何电噪声。</li>
	<li>将血压遥测接收器放置在法拉第笼内。</li>
	<li>将遥测接收器连接至相应的压力输出适配器，并将该适配器连接至数据采集系统，以在线记录血压。</li>
	<li>将两个与电极雄性插针（镀金黄铜）相匹配的雌性插针连接器焊接到一对带屏蔽层的PVC绝缘电缆的末端。将该成对电缆的另一端焊接到香蕉插头上，并将香蕉插头连接至前置放大器头级（10倍放大）。</li>
	<li>将该前置放大器连接至差分放大器。调节设置，使神经信号放大10,000倍。滤波器设置如下：低频截止为100 Hz，高频截止为1,000 Hz。</li>
	<li>术后48至72小时，将含有小鼠的饲养笼放置在法拉第笼内的遥测接收器上。开启遥测探头以记录血压信号。 
	注意：术前一周内，将饲养笼置于该装置中使小鼠适应环境，效果最佳。</li>
	<li>解开电极引线，将双极电极的插针连接器插入上述（13.4）所述的对应雌性插针连接器，开始记录肾交感神经活动（RSNA）。</li>
	<li>使用计算机同步显示并在线记录血压信号，同时输注生理盐水或感兴趣的溶液。数据记录采样率至少为每秒2500个样本。</li>
</ol>
14. 样本实验方案及RSNA信号验证
<ol>
	<li>确保小鼠在饲养笼内舒适，无束缚，并可自由获取食物和水。遵循机构动物护理指南，确认小鼠外观和行为正常。</li>
	<li>将小鼠饲养在与记录肾交感神经活性（RSNA）相同的温湿度受控房间内。确保静脉输注按上述方法持续进行。</li>
	<li>将动物置于上述记录装置后，至少给予30分钟稳定时间，然后记录一小时的基础血压和RSNA数据。记录期间应确保动物安静休息，因为自然活动会伴随交感神经张力升高。若动物在记录过程中发生移动，需在数字轨迹上直接标注，以便分析时排除该时段数据。</li>
	<li>通过缓慢注射一剂硝普钠（2.5 µg/g 体重，溶于25 µL生理盐水中）至输液管路，测试压力感受性反射反应。随后用约50 µL生理盐水缓慢冲洗管路，确保清除导管死腔。记录血压和RSNA持续2至5分钟。</li>
	<li>缓慢注射一剂去氧肾上腺素（20 µg/g 体重，溶于25 µL生理盐水中）。用约50 µL生理盐水冲洗，确保清除导管死腔。继续记录血压和RSNA 10至15分钟。</li>
	<li>为验证神经信号的节后性质，缓慢注射一剂神经节阻断剂六甲溴铵（50 µg/g 体重，溶于25 µL生理盐水中）至输液管路。用约50 µL生理盐水冲洗，确保清除导管死腔。继续记录数分钟。</li>
	<li>将给予六甲溴铵后残留的神经活动作为背景噪声的估计值，用于后续RSNA数据分析（见下文）。</li>
	<li>使用过量异氟烷（逐步增量给药，从0.5%增至5%）处死小鼠，并继续记录RSNA 30分钟。注意：剩余信号也可用作RSNA分析中的背景噪声估计值。</li>
</ol>
15. 数据分析
<ol>
	<li>使用数据采集软件分析原始血压和肾交感神经活动（RSNA）信号轨迹。
	<ol>
		<li>使用该软件对原始RSNA信号进行数字积分和全波整流。积分设置选择&#34;绝对积分&#34;；时间常数衰减设为0.1秒6。</li>
		<li>针对实验方案的每个阶段，分析积分后的RSNA信号（以µV·s为单位显示）。排除动物发生移动时的记录片段。分别对实验的基线期和实验期各取至少3次测量值。</li>
		<li>分别在达到最低和最高血压水平时分析RSNA，对应硝普钠或去氧肾上腺素的作用，以评估压力感受性反射敏感性。</li>
		<li>对实验方案各阶段的上述单个测量值取平均，得到一个代表值。</li>
		<li>通过计算RSNA相对于基线的百分比变化来量化RSNA反应，基线设定为100%7。根据需要完成统计学分析。 
		注意：在本示例中，RSNA对硝普钠和去氧肾上腺素反应的统计学分析采用Student's t 检验；当P值&#60;0.05时认为差异具有统计学意义。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍、演示并验证了一种新颖的方法，可在清醒、自由活动并舒适地待在自家笼具中的小鼠身上，对其进行靶向性的肾交感神经活性（RSNA）评估。在手术植入动脉压遥测仪、留置静脉输注导管以及定制的双极RSNA电极后，小鼠术后恢复，并静养48至72小时。在整个实验过程中（包括实验阶段），小鼠始终舒适地待在自家笼具中，可自由获取食物、饮水，并享受环境丰富化措施。所有后续的实验操作均由研究者远程完成，不会对动物造成干扰。就RSNA信号的质量与解读而言，该方法完全避免了麻醉、手术创伤以及束缚状态和其他来自身体与心理应激的不良且不可避免的生理干扰。因此，这些通常会影响交感神经活动测量结果解读的严重混杂因素得以有效消除。
所有小鼠均健康状况良好，术后24小时即表现出明亮、活跃、反应灵敏、进食、饮水、理毛以及嬉戏和探索等典型行为。无论是否成功记录到有效的肾交感神经活动（RSNA）信号，所有动物均表现出这些特征，并积极参与所提供的环境丰富化措施。尽管据报道，植入遥测探针后完全恢复正常血压所需的恢复时间可能长达4–7天9，但动脉压恢复至正常水平所需时间要短得多...

随着大量基因工程小鼠模型的建立，利用小鼠开展多领域生物医学研究的兴趣持续增长。总体而言，技术进步已跟上小鼠在生理学研究中日益广泛的应用步伐，目前已有大量专为小鼠设计的微型化设备，可用于测量其关键生理参数。尽管用于清醒大鼠直接测量自主神经张力的遥测设备已问世十余年，但目前尚无适用于清醒小鼠的微型化神经活动评估设备。研究人员通常通过间接方法来克服这一限制，例如检测血浆或尿液儿茶酚胺水平、进行药理学自主神经阻断，或对血压/心率波动进行频谱分析1。
尽管这些方法提供了有价值的信息，但其结果仅能反映整体自主神经张力的全局图像，而无法揭示孤立神经群体对所研究现象的具体贡献。另一种方法是直接记录特定神经的活动，该方法已在麻醉小鼠中实施，但存在诸多问题。在手术后数小时内，维持麻醉小鼠的血压在生理范围内极为困难。事实上，在这类实验中，血压常常未被报告，或仅显示在极低水平（例如60–80 mmHg，而清醒小鼠通常为&#62;100 mmHg）2。由于麻醉小鼠模型中心血管系统的脆弱性，加之血压与交感神经张力之间存在相互依赖关系，往往难以对自主神经活动进行有意义的评估3,4。
为解决这一局限性，我们开发了一种可在清醒、自由活动的小鼠中直接记录肾交感神经活动（RSNA）的新方法，小鼠在其饲养笼内不受干扰地进行实验。本文详细描述了成功实施该技术所需的手术操作及实验方案。该方法使研究者能够在记录RSNA的同时，通过遥测技术同步监测动脉血压，并具备在不干扰小鼠状态的前提下静脉输注感兴趣药物的能力。
术后24小时，小鼠行为正常，无疼痛或痛苦表现。实验记录可在术后48至72小时开始，期间小鼠舒适地静卧于其饲养笼内，可自由获取食物、水和环境丰富化设施。本文展示了清晰的肾交感神经活动（RSNA）信号，并演示了该神经群对动物正常身体活动（如进食和理毛）的特征性反应，以及系统血压的药理学调节反应。通过神经节阻断进一步验证了RSNA信号的质量和特异性。本论文包含最初发表的该技术描述的视听补充材料5。

<table><tbody><tr><td>特氟龙涂层不锈钢多股绞合线</td><td>A-M Systems</td><td>793200</td><td>直径0.001英寸，裸露；直径0.0055英寸，涂覆</td></tr><tr><td>#11 手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>ALMM9011</td><td></td></tr><tr><td>电烙铁和焊料</td><td></td><td></td><td>任何适用的型号或品牌</td></tr><tr><td>雄性微型针式连接器</td><td>A-M Systems</td><td>520200</td><td>镀金黄铜</td></tr><tr><td>雌性微型针式连接器</td><td>A-M Systems</td><td>520100</td><td>镀金黄铜</td></tr><tr><td>热缩管</td><td>Radio Shack</td><td>型号：278-1610 |&amp;nbsp;目录编号：2781610</td><td>1.6 mm 直径</td></tr><tr><td>聚乙烯90（PE90）管</td><td>VWR</td><td>CA-63018-703</td><td>内径 0.86 mm；外径 1.27 mm</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>Leica M80</td><td>任何品牌或型号均可适用</td></tr><tr><td>聚乙烯10（PE10）导管</td><td>Braintree Scientific</td><td>PE10&amp;nbsp;50 英尺</td><td>内径 0.28 mm；外径 0.61 mm</td></tr><tr><td>超级胶水液体</td><td>Loctite</td><td>n/a</td><td>液体配方；任何适用品牌均可</td></tr><tr><td>超级胶水凝胶</td><td>Loctite</td><td>n/a</td><td>凝胶配方；任何适用品牌</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>科学用品</td><td>BB31695-PE/13</td><td>用于底座，内径 2.7mm；外径 4.0mm</td></tr><tr><td>医院消毒灭菌服务 &amp;amp; 臭氧灭菌包</td><td></td><td></td><td>联系当地医院消毒供应中心</td></tr><tr><td>异氟烷麻醉</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase等温加热垫 &amp;和手术台</td><td>Braintree Scientific</td><td>39OP</td><td>将加热垫保持在37℃恒温环境中&amp;deg;C 水浴；相应的手术台必不可少</td></tr><tr><td>格隆溴铵</td><td>Amdipharm Mercury Company Limited</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器系统 &amp;和流量计</td><td>Braintree Scientific</td><td>VP I</td><td>包含医用级氧气供应</td></tr><tr><td>组织剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14173-12</td><td></td></tr><tr><td>精细弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>小型棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23400100</td><td></td></tr><tr><td>精细直头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>#5，杜蒙生物学吸头 FST</td></tr><tr><td>斜口镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>#5/45 杜蒙特FST</td></tr><tr><td>小型吸收探针</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-03</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR701605&amp;nbsp;ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil 2 组分硅胶聚合物</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>KWIK-SIL</td><td>从 WPI 购买额外的专用吸头</td></tr><tr><td>5-0 Polysorb 缝合线</td><td>泰科医疗</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>6-0 丝线缝合线</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S&amp;nbsp;104</td><td>Deknatel 品牌，线轴</td></tr><tr><td>放射遥测探针</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>TA11-PAC10</td><td></td></tr><tr><td>放射遥测接收器</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PhysioTel RPC-1</td><td></td></tr><tr><td>环境压力参考</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>4月1日</td><td></td></tr><tr><td>压力输出适配器</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>R11CPA</td><td></td></tr><tr><td>Rena 脉冲管路</td><td>Braintree Scientific</td><td>RPT-040</td><td></td></tr><tr><td>输液旋转接头</td><td>Instech Solomon</td><td>375/D/22</td><td></td></tr><tr><td>旋转支撑臂 &amp;和装片</td><td>Instech Solomon</td><td>SMCLA</td><td></td></tr><tr><td>聚砜按钮&amp;nbsp;</td><td>Instech Solomon</td><td>LW62S/6</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢弹簧</td><td>Instech Solomon</td><td>PS62</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond 外科粘合剂</td><td>3M</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>三重抗生素软膏</td><td>Fougera</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8通道数据采集系统 &amp;和软件</td><td>ADInstruments</td><td>PowerLab 8/35</td><td></td></tr><tr><td>PVC绝缘电缆</td><td>Belden</td><td>PVC音频连接线 32 AWG</td><td></td></tr><tr><td>前置放大头stage</td><td>Dagan Corporation</td><td>Model 4002</td><td></td></tr><tr><td>差分放大器</td><td>Dagan Corporation</td><td>EX4-400</td><td></td></tr><tr><td>硝普钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>去甲肾上腺素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6126-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl 无菌生理盐水</td><td>贝克顿·迪金森</td><td></td><td>联系当地医院供应商</td></tr><tr><td>六甲季铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0879-5G</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢顶防震台</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>自行设计定制；使用放置于台面上的实心钢板亦可</td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>定制设计并自主构建</td></tr><tr><td>小型动物毛发修剪器</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>药店，适合男士使用的胡须修剪器</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Veet 品牌，敏感肌配方</td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘</td><td>普渡产品</td><td>Betadiene</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>钢制微型牵开器</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>自制。将一个钢制回形针弯曲 &amp;amp; 使用4-0丝线形成牵开线</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>精细科学工具</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>热风枪</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-201-27</td><td></td></tr></tbody></table>

清醒自由活动小鼠中同时记录肾交感神经活动和血压并进行静脉输注的新方法

Novel Approach for Simultaneous Recording of Renal Sympathetic Nerve Activity and Blood Pressure with Intravenous Infusion in Conscious, Unrestrained Mice.

肾交感神经在生理和病理生理过程中均发挥重要作用。在慢性肾病、高血压、心力衰竭、糖尿病和肥胖等众多研究领域中，评估肾交感神经活动（RSNA）具有重要意义。因此，明确交感神经系统的作用对于正确解读实验结果和理解疾病机制至关重要。传统上，RSNA的测量是在麻醉的啮齿类动物（包括小鼠）中进行的。然而，小鼠在麻醉和手术期间通常会出现持续数小时的系统性低血压和血流动力学不稳定。由于交感神经张力与心血管状态密切相关，这种非生理状态会干扰对RSNA的准确解读。为克服传统方法的这一局限性，我们开发了一种在清醒、自由活动的小鼠中测量RSNA的新方法。小鼠被长期植入遥测仪，用于连续监测血压，同时植入颈静脉输注导管和定制的双极电极，以直接记录RSNA。经过48至72小时的恢复期后，小鼠存活率为100%，且所有小鼠行为正常。在此时间点，80%的小鼠成功记录到RSNA，其中70%和50%的小鼠分别在术后4天和5天内获得可分析的信号。所有小鼠均记录到生理范围内的血压值（116±2 mmHg；n=10）。记录到的RSNA在进食和理毛行为期间增加，这与文献报道一致。此外，通过神经节阻断以及使用药理学试剂调节血压，进一步验证了RSNA信号的可靠性。本文描述了一种有效且可操作的方法，可用于在清醒、自由活动的小鼠中清晰记录RSNA。

按照所述实验方案，小鼠的存活率为100%——本研究中所有接受手术的小鼠均成功存活并顺利恢复。术后24小时内，所有小鼠行为正常，表现出典型的进食、理毛和探索行为，未见任何疼痛或痛苦迹象。术后48小时，在12只小鼠中有10只记录到了可验证且清晰的肾交感神经活性（RSNA）信号。该信号在术后72小时仍可在这些小鼠中维持，但在术后第4天仅在7只（70%）小鼠中记录到真实的RSNA信号，至术后第5天仅在5只（50%）小鼠中可检测到。尽管部分小鼠由于电噪声或心电图信号干扰而未能获得高质量的RSNA信号，但在实施安乐死前，这些动物均保持良好健康状态。
术后48小时清醒小鼠的平均动脉压为116±2 mmHg，相应的心率为596±22 bpm（n=10）。此时同步记录的血压和肾交感神经活动（RSNA）代表性样本显示，RSNA呈现出清晰可见且具有特征性的节律性爆发（图2）。在进食和理毛等正常活动期间，RSNA出现预期的典型升高，这些现象由实验人员直接观察并记录，同样可见（...

麻醉小鼠表现出非生理性的全身血压，由于血压与自主神经系统之间存在密切关系，这使得无法对自主神经张力进行有意义的评估。因此，本文介绍了一种在清醒小鼠中同时记录肾交感神经活动和血压并进行静脉输注的新方法。

肾交感神经在生理和病理生理现象中均发挥重要作用。评估肾交感神经活性……

本项新型外科手术与实验方法的总体目标是在无麻醉干扰效应的情况下，评估清醒且自由活动小鼠的肾交感神经活性。鉴于近年来对小鼠模型日益增长的兴趣，该方法提供了一种可行的技术手段，可可靠地评估清醒小鼠的自主神经张力。该技术的主要优势在于，可在无麻醉或束缚等混杂因素影响的情况下，对清醒且舒适静息状态的小鼠进行神经活性评估。完成小鼠手术前准备后，将其置于右侧卧位，头端朝向术者的左侧。首先，用手术刀在背部中线区域做一个5毫米的切口。其次，在左侧腹侧背部皮肤上做一较大的切口，位置位于肋骨后方2毫米处，且与脊柱垂直。接着，将一根13号不锈钢针经皮下隧道引至背部出口处。然后，使用预先准备好的RSNA电极，将其穿过针头，并将针头回撤，使电极尖端位于左侧腹外侧肌表面。电极导线的一部分应延伸至皮肤下方。现在暴露左侧肾脏，移开电极尖端，并在腹肌上做一切口，位置正对皮肤切口。接着，使用微型牵开器打开手术视野，并牵开肾脏。使用器械将背部肌肉的脂肪和结缔组织分开，以暴露肾脏。切勿牵拉肾血管神经束，以免造成神经不可逆损伤，影响实验结果。为清晰观察肾血管神经束，请使用高倍物镜。它通常与肾血管相邻。现在使用精细的直头镊子非常小心地从周围组织中分离神经束。切勿触碰神经束或损伤供应神经的血管。在整个过程中，必须保持神经束的完整。接下来，将RSNA电极尖端插入腹腔。将电极尖端和接地线垂直置于肾神经血管束的位置。接地线必须与下方组织良好接触。然后用弯头镊子小心地提起肾神经束，将电极尖端滑入神经下方，并使神经直接接触两根导线，但切勿让电极压迫肾血管。接下来，在神经导线与接地线之间插入一小片灭菌的石蜡膜。然后使用小型吸水尖头棉签吸去血液和液体。为了对电极尖端进行电隔离，需在神经下方及周围小心涂抹适量的双组分硅酮弹性体。待其固化数分钟后，用镊子小心提起硅酮，并用少量液体外科粘合剂固定。然后用间断的可吸收50号缝线缝合腹部切口，并对覆盖的皮肤进行同样的缝合。下一节描述血压遥测仪的植入过程。首先将小鼠重新置于仰卧位，头端朝向手术者。根据需要调整麻醉，并给予第二次剂量的格隆溴铵。然后使用手术刀在颈部区域做正中切口，从下颌下方开始，延伸至肋笼上方。现在分离腺体组织，以暴露下方的颈部肌肉。小心操作，避免损伤迷走神经，暴露左侧颈总动脉，并将其从周围组织中分离。随后将三段6-0丝线缝合线穿过动脉下方，贯穿其暴露的全长。将其中一段缝线置于头侧并结扎，以阻断血管。在中间位置放置第二根缝线并松松结扎，再在尾侧位置放置第三根缝线并松松结扎。接着，牵拉最前端的缝线，并使用一小段脐带胶带将其固定在鼻罩上。然后用显微蚊式钳牵拉最尾端的缝线，以限制血流。现在使用精细的弹簧剪，在尽可能靠前的位置对血管壁进行小切口。通过切口插入遥测导管，并将其推进至尾端缝线处。收紧中间的缝线以固定导管。接下来，解除尾部牵拉，将导管向前推进 10 毫米。然后用缝线固定导管。最后将遥测仪主体沿右侧 flank 皮下隧道引至皮下囊袋，并继续进行颈静脉导管的植入操作。首先使用棉签暴露右侧颈静脉，然后将两根6-0丝线缝合线绕过该静脉。将其中一根置于较前（头侧）位置并打结以阻断静脉血流。将另一根线向远端尾侧放置，并轻轻牵拉以阻断血管内的血流。接下来，使用精细的弹簧剪刀在血管壁上做一小切口，切口位置应尽可能靠近头侧的缝合线。然后，用盛有生理盐水的加热拉伸导管插入静脉进行插管。现在将导管向前推进8毫米进入静脉，并用丝线缝合固定，再滴加少量凝胶状氰基丙烯酸酯以加固。接着将小鼠旋转至其左侧，使用13号针头将导管从颈部穿隧道至背部肩胛中线区域预先准备好的出口处。然后将小鼠重新置于仰卧位，用间断的5-0缝线缝合颈部切口。现在将动物置于俯卧位，并在静脉导管上套入一个小型不锈钢弹簧皮下按钮。用缝线将按钮固定于皮下。然后使用组织粘合剂将保护电极导线的聚乙烯基座固定在下方肌肉上。最后，在法兰上方的皮肤进行缝合，以提供额外支持。将小鼠饲养在与记录肾交感神经活性（RSNA）期间相同的温度和湿度条件下。在开始记录前，让小鼠在记录装置中至少稳定30分钟，随后记录一小时的基础血压和RSNA数据。确保在记录过程中小鼠处于安静休息状态，因为自然活动会伴随交感神经张力的升高。在记录期间，重要的是注意动物的活动情况。这些观察记录可直接标注在数字轨迹上。现在开始测量静脉注射底物后的反应。安乐死后，继续测量30分钟。按照所述方案，12只小鼠全部存活并恢复良好。术后24小时内，小鼠行为正常，无任何痛苦迹象。术后48小时，在12只小鼠中的10只记录到了可验证且清晰的肾交感神经活动（RSNA）信号。与正常活动（如进食和理毛）相关的RSNA典型升高现象均可观察到。到120小时时，仍有五只小鼠显示出高质量的肾交感神经活性（RSNA）信号。在为期五天的观察期间，血压和心率保持稳定，其数值与术后恢复10天内记录的数值无显著差异。为了验证RSNA是否与动脉压力感受性反射同步，对小鼠给予了硝普钠和去氧肾上腺素处理。肾交感神经活性（RSNA）在动脉压降低时通常会相应增加，而在动脉压升高时则几乎完全被抑制。此外，在使用六甲溴铵进行神经节阻滞后，RSNA被完全消除。该观察结果支持RSNA信号属于节后神经来源的特性。一旦掌握，该手术技术在正确操作的情况下可在三小时内完成。进行此操作时，务必始终牢记在处理肾神经时需格外小心，以保持其活性，便于后续记录。在此手术之后，可采用其他方法（如气流喷射应激）进一步评估清醒小鼠的自主神经张力。随着该技术的发展，研究人员得以深入理解自主神经系统在心血管生理学和病理生理学关键领域（如长期血压调控、高血压和肥胖）中的重要作用，从而开辟了新的研究前景。

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科研

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Medicine

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清醒、无拘无束的小鼠静脉输液同时记录肾交感神经活动和血压的新方法。

神经元反应的电生理表征对于理解脑功能以及指导通路示踪染料的放置具有重要意义。然而，许多研究是在麻醉动物中进行的。为了在无麻醉条件下理解脑功能，我们建立了一种在清醒小鼠中记录神经元反应特性并注射染料的方法。...

清醒小鼠的制备以记录神经反应和注射示踪剂

本视频演示了一种研究大鼠动脉压力变化时肾交感神经（RSNs）活动的技术。首先将压力感应导管连接至股动脉，暴露肾交感神经。随后将神经提起并置于记录电极上，记录其电活动。接着注射血管收缩药物以升高血压，并监测肾交感神经活动的相应变化。...

记录大鼠动脉压力变化引起的肾交感神经活动反应

本视频展示了如何在小鼠中获取全身和肝脏血流动力学参数。整个监测过程包括获取小鼠的生命体征参数、全身血压、中心静脉压、肝总动脉血流速率、门静脉压力以及门静脉血流速率。...

小鼠全身及肝脏血流动力学参数的监测

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。...

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

本实验方案的目的是利用可植入式遥测设备，在清醒且自由活动的小鼠中评估其系统性血压。...

使用遥测技术对自由活动小鼠进行长期血压测量

测量中枢神经系统（CNS）干预所引发的交感神经和心血管反应的方法，对于推动神经科学研究具有重要意义。本方案旨在帮助科研人员测量和量化麻醉大鼠（非存活实验）中肾交感神经活动（RSNA）的急性变化。...

量化麻醉大鼠中枢神经系统干预后肾交感神经活动的急性变化

本文介绍了一种在实验大鼠中同步记录心电图和动脉内血压（BP）的实验装置，该方法可使用动物实验设施中的常规设备完成，适用于生理学或药理学研究，以探讨心血管医学中的致病机制或治疗机制。...

大鼠同步心电图记录与有创血压测量

压力感受性反射是自主神经系统在血压变化时调节心率的一种机制。本文介绍一种手术技术，用于在小鼠体内植入遥测发射器，以持续且同步地测量心电图和血压。该方法可用于测定自发性压力感受性反射敏感性，这是心血管疾病的重要预后指标。...

植入联合遥测心电图和血压发射器以测定清醒小鼠的自发性压力感受性反射敏感性

本方案描述了在清醒大鼠中通过植入式导管（充液导管或遥测装置）对肾血流量进行长期连续测量，同时记录血压的方法。...

清醒大鼠肾血流量的长期连续测量

本方案描述了一种在固定头部的小鼠脑干中获取体内高密度单神经元记录的方法。该方法用于在全身麻醉前和麻醉期间，测量腹外侧导水管周围灰质（即快速眼动（REM）睡眠期间不活跃的脑干区域）神经元的动作电位发放。...

固定头部小鼠脑干的急性单细胞多电极记录

了解清醒、自由活动小鼠肾交感神经活动与血压同步记录的新方法。该技术消除麻醉干扰，为心血管自主神经研究提供可靠的生理学评估手段。

清醒自由活动小鼠中同时记录肾交感神经活动和血压并进行静脉输注的新方法

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