利用光稳定性氰基染料合成波长位移DNA杂交探针

本实验的总体目标是可视化一种染料标记的DNA链向另一种染料标记DNA链的能量转移。该方法有助于解决分子生物学领域的一些关键问题，例如通过实时监测活细胞中siRNA的加工过程和完整性来研究RNA干扰。

该技术的主要优势在于能够轻松监测荧光的扩展和颜色变化，从而获得明确的结果，因此可消除假阳性结果。开始此操作时，按照文本方案中的说明，将相应的试剂加入一个20毫升的圆底烧瓶中，烧瓶需配备磁力搅拌子和回流冷凝管。

然后，加入0.06毫升哌啶，将反应混合物加热至80摄氏度，持续4小时。待反应液冷却至室温后，通过过滤收集析出的沉淀物。

用乙醚洗涤三次。接着，向上清液中加入100 mL乙醚，并通过过滤收集析出的沉淀。

用乙醚洗涤三次后，将沉淀物与第一次过滤得到的固体合并。使用连接至DNA合成仪的计算机，输入所需的DNA序列和偶联方法。按照制造商说明书中的提示进行操作。

接下来，将装有经修饰的可控倾注玻璃柱（即修饰了第一面一微摩尔的柱子）安装到合成仪中。现在，启动DNA合成仪开始合成。在DNA链合成完成后，按照文本方案中指示，向经二乙基化的炔烃修饰的DNA样品中加入适当的试剂。

将样品在 60 摄氏度下孵育 1.5 小时。然后，将样品转移至 10 毫升离心管中。冷却至室温后，向 DNA 样品中加入 150 微升 0.05 摩尔的 EDTA 二钠盐溶液和 450 微升 0.3 摩尔的醋酸钠溶液。

随后，向样品中加入 10 毫升乙醇，并在 -32 °C 下保存 16 小时。接下来，在 1,000 × g 条件下离心样品 15 分钟。离心结束后，弃去上清液。

用两毫升预冷的80%乙醇洗涤所得的DNA沉淀。然后使用冷冻干燥机在减压条件下干燥沉淀。通过高效液相色谱法纯化粗制DNA沉淀。通过检测260纳米波长处的吸收值，并在459纳米处监测染料一（Dye one）来监控色谱运行过程。

或针对染料二选择 542 纳米。收集在两个波长通道均显示吸收的组分。进行单链吸收光谱测定时，记录仅含 200 毫摩尔氯化钠和 50 毫摩尔磷酸钠缓冲液的空白测量。

接下来，将先前制备的DNA1溶液转移至1厘米光程的石英玻璃比色皿中，记录其吸光度，然后测定染料吸收的最大值。

进行单链荧光光谱测定时，使用染料一的激发波长，记录仅含200毫摩尔氯化钠和50毫摩尔磷酸钠的空白测量值。随后，将装有DNA1溶液的比色皿放入光谱仪中，记录荧光光谱。

为进行双链荧光光谱测量，将含有 DNA1 与 DNA2 溶液双链的比色皿放入光谱仪中。随后使用染料一的激发波长记录荧光光谱。为更清楚地理解所记录光谱的含义，可使用手持式紫外灯照射比色皿进行观察。

观察荧光颜色从单链DNA到双链DNA的变化。记录的吸收光谱显示，单链DNA1在465纳米处有吸收峰，单链DNA2在546纳米处有吸收峰。DNA1与DNA2退火形成的双链在469纳米和567纳米处均出现吸收峰。

两个吸收峰均表现出红移现象，而光谱的微小变化则是由双螺旋DNA结构内染料分子间激子相互作用所致。相应的荧光光谱显示，单链DNA1的发射峰最大值位于537纳米。

单链DNA2在607纳米处有发射峰，而退火形成的DNA1与DNA2双链在615纳米处有发射峰。DNA1与DNA2双链中，尽管选择性激发染料一（Dye one），但仅观察到染料二（Dye two）的发射最大值，表明能量可从染料一高效转移至染料二。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过将带有炔基标记的 DNA 链与 A 侧基团进行数次催化反应，从而对 DNA 进行合成后的修饰。