利用光稳定性氰基染料合成波长位移DNA杂交探针

本实验的总体目标是可视化一种染料标记的DNA链向另一种染料标记的DNA链的能量转移。该方法有助于解决分子生物学领域的一些关键问题，例如通过实时监测活细胞中siRNA的加工过程及其完整性来研究RNA干扰。

该技术的主要优势在于能够轻松监测荧光的扩展和颜色变化，从而获得明确的结果，因此可消除假阳性结果。开始此操作时，按照文本方案中的指示，将相应的试剂加入一个20毫升的圆底烧瓶中，烧瓶需配备磁力搅拌子和回流冷凝管。

然后，加入0.06毫升哌啶，并将反应混合物加热至80摄氏度，持续4小时。待反应混合物冷却至室温后，通过过滤收集生成的沉淀物。

用乙醚洗涤三次。接着，向上清液中加入100毫升乙醚。通过过滤收集所得沉淀物。

用乙醚洗涤三次后，将沉淀物与第一次过滤所得的分离固体合并。使用连接至DNA合成仪的计算机，输入所需的DNA序列和偶联方法。按照制造商提供的实验方案中的提示进行操作。

接下来，将含有经修饰的可控倾注玻璃的柱子（即修饰了第一面一微摩尔的柱子）安装到合成仪中。现在，启动DNA合成仪进行合成。在完成DNA链的后续处理后，按照文本方案中指示，向经二乙基化的炔烃修饰的DNA样品中加入适当的试剂。

将样品在 60 摄氏度下孵育 1.5 小时。然后，将样品转移至 10 毫升离心管中。冷却至室温后，向 DNA 样品中加入 150 微升 0.05 摩尔的 EDTA 二钠盐溶液和 450 微升 0.3 摩尔的醋酸钠溶液。

随后，向样品中加入10毫升乙醇，并在负32摄氏度下保存16小时。接下来，将样品以1000 × g离心15分钟。离心结束后，弃去上清液。

用两毫升预冷的80%乙醇洗涤所得的DNA沉淀。然后使用冷冻干燥机在减压条件下干燥沉淀。通过高效液相色谱法纯化粗制DNA沉淀。通过检测260纳米波长，并针对染料一检测459纳米波长来监测运行过程。

或者对于染料二使用542纳米。收集在两个波长通道均显示吸收的组分。对于单链吸收光谱测量，记录仅含200毫摩尔氯化钠和50毫摩尔磷酸钠缓冲液的空白测量值。

接下来，将先前制备的DNA1溶液转移至一个1厘米的石英玻璃比色皿中。记录其吸光度，然后确定染料吸收的最大值。

对于单链荧光光谱测量，使用染料一的激发波长，记录仅含200毫摩尔氯化钠和50毫摩尔磷酸钠的空白测量值。随后，将含有DNA1溶液的比色皿放入光谱仪中，记录荧光光谱。

为了进行双链荧光光谱测量，将含有DNA1与DNA2双链溶液的比色皿放入光谱仪中，然后使用染料一的激发波长记录荧光光谱。为了更好地理解所记录光谱的含义，可使用手持式紫外灯照射比色皿进行观察。

观察从单链DNA到双链DNA荧光颜色的变化。记录的吸收光谱显示，单链DNA1在465纳米处有最大吸收峰，单链DNA2在546纳米处有最大吸收峰。DNA1与DNA2退火形成的双链在469纳米和567纳米处均出现最大吸收峰。

两个吸收峰均显示出红移现象。而光谱上最微小的变化则是由双螺旋DNA结构内染料分子之间的激子相互作用所导致。相应的荧光光谱在单链DNA1中于537纳米处出现最大发射峰。

单链DNA2在607纳米处有发射峰，而退火后的DNA1与DNA2双链在615纳米处有发射峰。尽管选择性激发的是染料一，但DNA1与DNA2的双链仅显示出染料二的发射最大值，这证明能量能够从染料一高效地转移至染料二。

观看本视频后，您应能充分理解如何通过将带有炔基标记的 DNA 链与 A 侧基团进行数次催化反应，从而实现对 DNA 的合成后修饰。