热火预防应激在大鼠不利影响枯草芽孢杆菌应变

我们描述了一种通过有益细菌口服预处理来预防大鼠热应激影响的方案。该方案可以修改并用于各种给药途径和不同化合物的分析。

本实验的总体目标是评价枯草芽孢杆菌 BSB3 菌株对热应激后并发症的预防效果。这种方法可以帮助回答预防热应激不利影响的关键问题。这种技术的主要优点是它可用于评估减轻热应激并发症的不同方法。

演示此程序的是 Ludmila Globa。以及我们实验室的助理研究员 Oleg Pusovyy。首先，从在营养琼脂平板上过夜生长的枯草芽孢杆菌 BSB3 的单个菌落开始。

在烧瓶中接种 10 毫升营养肉汤。在 37 摄氏度下培养培养物过夜。根据此处显示的配方准备 500 毫升孢子形成培养基。

并在 121 摄氏度下高压灭菌 20 分钟。让培养基冷却至 50 摄氏度，然后加入以下无菌溶液。在无菌柜中，将制备好的培养基在室温下冷却至 40 摄氏度 20 分钟。

并将 25 毫升倒入 20 个无菌培养皿中。让培养基凝固过夜。接下来，将 0.5 毫升枯草芽孢杆菌 BSB3 培养物涂布到孢子形成培养基板的表面。

将板在 37 摄氏度下孵育 5 天，直到孢子形成 90%。然后使用高分辨率显微镜检查相亮孢子。要收获细菌，请在板中加入 1 毫升 PBS，并使用无菌细胞铺展器从表面刮除细菌。

将悬浮液储存在 4 摄氏度，直到需要为止。通过在孢子形成培养基板上接种 0.1 毫升适当稀释的细菌悬浮液并在 37 摄氏度下孵育 18 至 24 小时来确认细菌的活力。使用菌落计数器对细菌菌落进行计数，并计算测试悬浮液中细菌的滴度。

然后在 PBS 中制备终浓度为每毫升 1 倍 10 至第 8 个 CFU 的细菌悬浮液。用枯草芽孢杆菌 BSB3 或 PBS 口服强饲法治疗大鼠两天后，然后细分动物并测量体温，将第 1 组和第 2 组的大鼠在室温下放置 25 分钟。将第 3 组和第 4 组的动物置于 45 摄氏度和 55% 相对湿度的气候室中 25 分钟。

再次测量每只大鼠的直肠温度后，将所有动物置于室温下四小时。然后，在对动物实施安乐死、收集躯干血液并根据文本方案分离器官后，将每个器官样本放入预先称重的无菌管中并称重。向每管中加入无菌 PBS，以获得每体积稀释 1 至 10 重量的样品，并使用无菌玻璃组织匀浆器生成均匀的组织悬浮液。

接下来，使用无菌 PBS 对每个样品进行连续稀释。然后将 0.1 毫升所有稀释液铺在 MacConkeys 和 5% 血琼脂的表面。和含有血红素和维生素 K1 的布鲁氏菌血琼脂。孵育板后，使用菌落计数器对每组板上的菌落进行计数。

将结果表示为每克组织的集落形成单位 （CFU） 的数量。根据文本方案准备和染色小肠切片后，使用高分辨率显微镜测量肠绒毛和总粘膜壁厚度。分析每只大鼠的至少 4 个样本，并对每个样本进行至少 20 次测量。

为了对血液样本进行高分辨率光学显微镜检查，使用隔振平台作为显微镜系统的基础，并带有摄像机和计算机来记录实时图像。根据文本协议校准测试图像后，将每只大鼠的 7 微升新鲜抽取的血液放在载玻片上，并添加盖玻片。然后拍摄并记录每个样品中 72 x 53.3 平方微米的 10 个图像帧。

最后，使用实时提供高分辨率直视光学图像的软件，测量囊泡的浓度。热应激前后动物的平均体温分别为 36.7 正负 07 摄氏度和 40.3 正负 0.17 摄氏度。大鼠受热导致绒毛高度和总粘膜厚度的显着抑制。

然而，在应激前用 BSB3 菌株处理，可以保护肠道免受高温的有害影响。对于细菌从肠道的易位，分析了肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏。如此处所示，仅在来自受热 PBS 处理大鼠的肠系膜淋巴结和肝脏的样品中以 1.7 倍 10 至三加或负 4.6 倍十至每克组织 2 CFU 的浓度分离细菌。

另一方面，所有来自接受 BSB3 菌株的对照和热应激动物的测试样品都是无菌的。热应激大鼠 IL 1β 、 IL-6 、 TNFalpha 或干扰素 γ 细胞因子水平无变化。然而，热处理前PBS处理的动物的IL-10和LPS水平升高。

因此，枯草芽孢杆菌 BSB3 预处理阻止了热处理后血清中 IL-10 和 LPS 的升高。最后，在热应激前接受 PBS 的大鼠血液中发现游离囊泡浓度显着增加，但在 BSB3 处理的动物中未发现。重要的是要记住使用热原材料进行血液采集和精确度，以将血清液体保持在零下 20 摄氏度，反复冻融，并在分析细菌易位时遵循无菌程序。

遵循此程序，例如在热应激后施用细菌，以回答有关热应激并发症的其他问题。