Name: HPLC-基于化验，以监测外核苷酸/核苷代谢的人类慢性淋巴细胞白血病细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学习使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）定量分析慢性淋巴细胞白血病细胞中的嘌呤代谢，以测定腺苷生成并研究肿瘤微环境。该方法操作简便、可重复性强，适用于原代细胞培养。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由意大利癌症研究协会（IG #12754）资助。

CLL 血液样本的获取遵循机构指南和《赫尔辛基宣言》。
1. 从慢性淋巴细胞白血病患者血液样本中分离白血病淋巴细胞
<ol>
	<li>用肝素钠抗凝管（绿色管帽）采集血样17。</li>
	<li>用室温 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）将全血按 1:3 比例稀释。</li>
	<li>通过密度梯度离心法从血样中纯化外周血单个核细胞（PBMC）。
	<ol>
		<li>在 15 ml 离心管中加入 5 ml 密度梯度离心介质（例如，Ficoll），小心加入 10 ml 稀释后的血液。立即在室温下以 1,500 × g 离心 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用连接真空泵的玻璃巴斯德吸管吸去部分上清液，用 5 ml 吸管收集密度梯度介质与稀释血浆界面之间的 PBMC 白膜层。转移至 50 ml 离心管中，加入 PBS 洗涤（终体积 50 ml），在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用玻璃巴斯德吸管吸去上清液，将沉淀重悬于 50 ml PBS 中，并用血细胞计数板计数细胞。</li>
	<li>按照标准免疫染色流程，使用抗 CD19 和抗 CD5 抗体对 PBMC 进行染色，通过流式细胞术检测 PBMC 亚群组成18。 
	注意：慢性淋巴细胞白血病（CLL）淋巴细胞为 CD19+/CD5+。</li>
	<li>使用流式细胞仪检测 CD19+/CD5+ 细胞百分比18。根据步骤 2 中所述 B 细胞阴性分离操作说明，从 CD19+/CD5+ 白血病细胞比例 ≥95% 的患者中纯化 B 淋巴细胞19。</li>
</ol>
2. 通过负向分离法纯化白血病B细胞
<ol>
	<li>将 107 个 PBMCs/ml 重悬于含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA、pH 7.4 的 PBS（分离缓冲液）中。</li>
	<li>每 107 个细胞加入 10 µg 小鼠单克隆抗-CD3、-CD14 和 -CD16 一抗，4 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>用分离缓冲液洗涤细胞，4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于分离缓冲液中，浓度为 107 个 PBMCs/ml。</li>
	<li>在与细胞孵育前，将羊抗小鼠 IgG 磁珠在瓶中充分重悬。每 107 个细胞转移 100 µl 磁珠至一新管中。</li>
	<li>加入 1 mL 分离缓冲液，将管置于磁力架上 1 分钟。用 5 ml 移液器弃去上清液。</li>
	<li>将管从磁力架上取下，用 100 µl 分离缓冲液重悬洗涤后的磁珠。</li>
	<li>将 107 个细胞与 100 µl 磁珠在 4 °C 下轻柔倾斜并旋转孵育 30 分钟。</li>
	<li>将管置于磁力架上 2 分钟，用 5 ml 移液器将含有 CD19+/CD5+ 未结合细胞的上清液转移至新管中。</li>
	<li>分离程序结束后，取 100 µl 细胞与抗-CD19 和 -CD5 抗体染色，用于流式细胞术分析，4 °C 孵育 30 分钟。用 3 ml 含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞，弃去多余上清液，再次通过流式细胞术检测 B 细胞纯度19。 
	注意：若 B 细胞纯度低于 95%，需进行额外的阴性分选步骤。</li>
</ol>
3. 标准品和抑制剂储备液的配制
<ol>
	<li>配制 AMP 溶液时，称取 0.00345 g AMP，溶于 5 ml 无血清培养基中，配制成 2 mM 的 AMP 标准溶液。</li>
	<li>为制备ADO，称取0.00265 g ADO，溶于5 ml无血清培养基中，配制成2 mM的ADO标准溶液。</li>
	<li>配制 INO 时，称取 0.00268 g INO，溶于 5 ml 无血清培养基中，制成 2 mM 的 INO 标准溶液。</li>
	<li>准备一个 400 µM 将1 ml 2 mM的AMP、ADO和INO储备液与4 ml无血清培养基混合，配制成终体积为5 ml的溶液。
	<ol>
		<li>进行1:4稀释，每份样品均作此处理 400 µM 标准溶液以获得一个 100 µM 通过移液进行浓度测定 500 µl 的 400 µM 溶液中 1,500 µl 无血清培养基（最终体积 2 ml）。</li>
		<li>在无血清培养基中对每种化合物进行系列稀释，以获得以下浓度： 100 µM - 50 µM - 25 µM - 10 µM - 5 µM - 2.5 µM - 1 µM - 0.5 µM - 0.25 µM. 
		注意：例如，用移液器吸取 1 ml 的 100 µM 1 ml 无血清培养基中的溶液（1:2 稀释），以获得 50 µM 浓度，并继续进行后续稀释步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制10 mM的APCP PBS溶液作为储备液；分装后于-20 °C保存。 30 °C.</li>
	<li>制备 EHNA 盐酸盐、dCF 和双嘧达莫的 10 mM 储存液，分别溶于二甲基亚砜（DMSO）中；分装后于 -20 °C 保存。30 °C.</li>
</ol>
4. 编程HPLC方法
<ol>
	<li>通过将 0.770 g 乙酸铵溶解于 2 L 双重去离子水中，配制 7 mM 的乙酸铵缓冲液（缓冲液 A）。用盐酸调节 pH 至 3.0。</li>
	<li>准备一个玻璃瓶，装入至少 2 L 用于高效液相色谱的超纯乙腈（缓冲液 B），并将保护柱和色谱柱连接至高效液相色谱仪。 
	注意：使用过程中，色谱柱和缓冲液均保持在室温。</li>
	<li>登录高效液相色谱软件，点击“浏览项目”按钮。进入“文件”菜单，选择“新建方法”，然后选择“仪器方法”。</li>
	<li>按照 表 1 设置色谱柱平衡方法。设定流速为 1.00 ml/min，并设置紫外检测器在 260 nm 处检测。保存仪器方法，然后再次从“文件”菜单中选择“新建方法”，接着选择“方法集”。选择之前保存的仪器方法，并以相同名称保存当前方法集。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间</td>
			<td>流速 (ml/min)</td>
			<td>%A</td>
			<td>%B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.24</td>
			<td>1.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.22</td>
			<td>1.00</td>
			<td>2</td>
			<td>98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18.65</td>
			<td>1.00</td>
			<td>2</td>
			<td>98</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 平衡色谱柱方法。 色谱柱平衡过程中溶剂变化的示意图。缓冲液A：7 mM 乙酸铵，pH 3.0。缓冲液B：乙腈。
<ol start="5">
	<li>重复步骤 4.3，编程运行表 2 中指定的样品方法。设置流速为 1.00 mL/min，并编程紫外检测器在 260 nm 处读数。保存仪器方法，并重复步骤 4.4 中所述相同程序以保存方法集。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间</td>
			<td>流速 (ml/min)</td>
			<td>%A</td>
			<td>%B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1.00</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.74</td>
			<td>1.00</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.71</td>
			<td>1.00</td>
			<td>15</td>
			<td>85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17.00</td>
			<td>1.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20.00</td>
			<td>1.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：样品运行方法。用于检测嘌呤类化合物的高效液相色谱（HPLC）测定中溶剂变化的示意图。缓冲液A：7 mM乙酸铵，pH 3.0。缓冲液B：乙腈。
<ol start="6">
	<li>点击“运行样品”按钮，从“文件”菜单中选择“新建样品集方法”。</li>
	<li>选择“空白”选项，并输入样品瓶编号（在自动进样器中的编号）、样品名称和进样体积（50 µl）。在“方法集”列中选择之前保存的方法集，并输入总运行时间（min）。 
	注意：每次样品运行前，需在“方法集”列中输入平衡色谱柱的方法（表 1），并输入总运行时间（min）。</li>
</ol>
5. 每种化合物标准校准曲线的生成
<ol>
	<li>按照 Table 1 和 Table 2 中所述方法，分别注入50 µl空白溶液（特定无血清培养基，不含腺苷脱氨酶）及各标准样品。
	<ol>
		<li>每次进样前采用平衡柱法（Table 1），并设置 Table 2 中描述的梯度条件，以获得良好的峰分离效果。有关AMP、ADO和INO在此HPLC条件下的报道保留时间，请参见 Table 3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>保留时间</td>
			<td>λmax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>8.00 min</td>
			<td>260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INO</td>
			<td>11.00 min</td>
			<td>260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADO</td>
			<td>11.90 min</td>
			<td>260</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：嘌呤类化合物的保留时间。 AMP、ADO和INO的典型保留时间。紫外检测器设定在260 nm处进行检测。
<ol start="2">
	<li>使用HPLC软件中的“process”按钮，然后选择“integrate”选项，测定不同浓度下AMP、ADO和INO的峰面积。或者，可手动选择每个峰的起始点和终点。</li>
	<li>将各标准品的峰面积对其标称浓度作图，得到九点校准曲线（100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25 µM）。</li>
	<li>计算AMP、ADO和INO的直线方程：y = mx + b， 
其中x为µM浓度，y对应峰面积。</li>
</ol>
<img alt="ADO 浓度与峰面积关系图，呈线性关系；表格数据，光谱分析。" src="/files/ftp_upload/54124/54124fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 内标标准曲线的建立。 ADO 的代表性校准标准曲线及所得相对方程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54124/54124fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
6. 抑制剂预处理及与底物（AMP）孵育
<ol>
	<li>为检测AMP消耗以及在未抑制CD73、ADA和核苷转运体条件下的ADO与INO生成情况，将步骤1和2中分离纯化的2 × 106个CD19+/CD5+慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞重悬于250 µl无血清培养基中，并接种至48孔板（或1.5 ml微量离心管）中。</li>
	<li>为阻断CD73酶活性，将APCP储备液（10 mM）以1:1,000比例稀释于培养基中，使终浓度为10 µM。将2 × 106个CLL细胞重悬于含APCP的250 µl培养基中，在细胞培养箱中37 °C预孵育60分钟。</li>
	<li>为阻断ADO向INO的转化，将EHNA盐酸盐和/或dCF储备液（均为10 mM）以1:1,000比例稀释于无血清培养基中，使终浓度为10 µM。将2 × 106个CLL细胞重悬于含EHNA和/或dCF的250 µl培养基中，在细胞培养箱中37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>为阻断核苷转运体介导的ADO摄取，将双嘧达莫（dipyridamole）储备液（10 mM）以1:1,000比例稀释于无血清培养基中，使终浓度为10 µM。将2 × 106个CLL细胞重悬于含双嘧达莫的250 µl培养基中，在细胞培养箱中37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>分别配制APCP、EHNA、dCF和双嘧达莫的单一体系溶液，均以1:1,000比例稀释于400 µM AMP溶液中。</li>
	<li>加入250 µl的400 µM AMP或含抑制剂的AMP溶液，使AMP终浓度为200 µM。设置无底物的对照组作为空白样品。</li>
	<li>在37 °C孵育30至60分钟。 
	注意：AMP的最佳浓度及孵育时间已通过实验确定。</li>
	<li>孵育结束后，将500 µl上清液收集至预冷的微量离心管（置于冰上），立即在4 °C以17,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中，立即置于-80 °C保存，或直接进行HPLC检测前的样品处理。</li>
</ol>
7. 高效液相色谱样品制备
<ol>
	<li>使用 0.2 µm 注射器滤器将上清液过滤至新的 1.5 ml 微量离心管中。过滤时使用 1 ml 注射器。</li>
	<li>如果高效液相色谱系统配有自动进样器，请准备用于高效液相色谱的玻璃小瓶，并对少量样品使用 0.1 ml 微量插件。</li>
	<li>用微量移液器或玻璃巴斯德吸管转移至少 100 µl 样品至玻璃小瓶中。注意转移过程中避免产生气泡，并用螺旋盖密封小瓶。</li>
	<li>样品现已准备好用于反相高效液相色谱分析。</li>
</ol>
8. 嘌呤的高效液相色谱检测
<ol>
	<li>点击“运行样品”按钮；从“文件”菜单中选择“新建样品集方法”。</li>
	<li>选择“空白”选项，并注明：进样瓶编号（在自动进样器中）、样品名称、进样体积（50 µl).</li>
	<li>选择平衡柱方法以及所述的运行样品方法 表1 和 表2分别用于后续所有空白样和样品的运行。 
	注意：设置平衡柱方法（表1每次运行样品前。</li>
	<li>注射 50 µl 空白（无血清培养基）及各样品的</li>
	<li>测定各样品中嘌呤的浓度，通过在所述保留时间处获取峰面积来定量 AMP、ADO 和 INO 表3.
	<ol>
		<li>选择“process”按钮，然后选择“integrate”选项。或者，可手动选择每个单峰的起始点和终止点以获取面积测量值。该操作通过在峰的起始点与终止点之间划线来完成。</li>
		<li>确定 µM 浓度，应用标准曲线所得方程计算： y = mx + b，其中 x 代表 µM 浓度和 y 是从未知样品中测得的峰面积。 
		注：文中报道了 ADO 校准标准曲线的一个示例 图2，其中： x = (y 区域 - 981.02) / 40026</li>
	</ol>
	</li>
	<li>考虑到 2 x 106 细胞用 0.500 ml 培养基重悬，计算 µmoleAMP、ADO 和 INO 的消耗和/或生成量（由 10 个）6 CLL 细胞按以下比例应用： 
	µmoles ：1,000 ml = x µmoles：0.250 ml 
	注意：该 µmole1,000 ml 中的 s 数量 µmole升中的 s 与 的等效 µM 浓度和 x 是 µmole核苷或核苷酸的产量由10产生6 细胞
	<ol>
		<li>最后，转换 µmoles 转换为每10个单位消耗和/或产生的 nmol 数6 CLL 细胞： 
		纳摩尔 = µmole×1,000</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, M., Wiznerowicz, E. B., Lappas, C. M., Linden, J., Worthington, M. T., Ernst, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Critical+role+for+A2A+adenosine+receptors+in+the+T+cell-mediated+regulation+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis.</a> J Immunology. 177 (5), 2765-2769 (2006).</li>
<li>Nemeth, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptor+activation+ameliorates+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptor activation ameliorates type 1 diabetes.</a> FASEB J. 21 (10), 2379-2388 (2007).</li>
<li>Fan, M., Jamal Mustafa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adenosine+in+airway+inflammation+in+an+allergic+mouse+model+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of adenosine in airway inflammation in an allergic mouse model of asthma.</a> Int Immunopharmacol. 6 (1), 36-45 (2006).</li>
<li>Csoka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A2B+adenosine+receptors+protect+against+sepsis-induced+mortality+by+dampening+excessive+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A2B adenosine receptors protect against sepsis-induced mortality by dampening excessive inflammation.</a> J Immunol. 185 (1), 542-550 (2010).</li>
<li>Peart, J. N., Headrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosinergic+cardioprotection%3A+multiple+receptors%2C+multiple+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenosinergic cardioprotection: multiple receptors, multiple pathways.</a> Pharmacol Ther. 114 (2), 208-221 (2007).</li>
<li>Ohta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A2A+adenosine+receptor+protects+tumors+from+antitumor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13132-13137 (2006).</li>
<li>Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B., Pacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptors%3A+therapeutic+aspects+for+inflammatory+and+immune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (9), 759-770 (2008).</li>
<li>Cronstein, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%2C+an+endogenous+anti-inflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Adenosine, an endogenous anti-inflammatory agent.</a> J Appl Physiol (1985). 76 (1), 5-13 (1994).</li>
<li>Molina-Arcas, M., Casado, F. J., Pastor-Anglada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+transporter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Vasc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nucleoside transporter proteins.</a> Curr Vasc Pharmacol. 7 (4), 426-434 (2009).</li>
<li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+generation+catalyzed+by+CD39+and+CD73+expressed+on+regulatory+T+cells+mediates+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression.</a> J Exp Med. 204 (6), 1257-1265 (2007).</li>
<li>Linden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+leukocyte+function+by+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of leukocyte function by adenosine receptors.</a> Adv Pharmacol. 61, 95-114 (2011).</li>
<li>Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation+and+cancer%3A+a+leading+role+for+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine.</a> Nat Rev Cancer. 13 (12), 842-857 (2013).</li>
<li>Antonioli, L., Csoka, B., Fornai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+and+inflammation%3A+what%27s+new+on+the+horizon%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Adenosine and inflammation: what's new on the horizon.</a> Drug Discov Today. 19 (8), 1051-1068 (1051).</li>
<li>Chiorazzi, N., Rai, K. R., Ferrarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia.</a> N Engl J Med. 352 (8), 804-815 (2005).</li>
<li>Abousamra, N. K., Salah El-Din, M., Hamza Elzahaf, E., Esmael, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectonucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase-1+%28E-NTPDase1%2FCD39%29+as+a+new+prognostic+marker+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (E-NTPDase1/CD39) as a new prognostic marker in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leuk Lymphoma. 56 (1), 113-119 (2015).</li>
<li>Serra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73-generated+extracellular+adenosine+in+chronic+lymphocytic+leukemia+creates+local+conditions+counteracting+drug-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD73-generated extracellular adenosine in chronic lymphocytic leukemia creates local conditions counteracting drug-induced cell death.</a> Blood. 118 (23), 6141-6152 (2011).</li>
<li>Chen, L. S., Keating, M. J., Gandhi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+methods+affect+cellular+protein+integrity%3A+implications+for+clinical+trial+biomarkers+and+ZAP-70+inn+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blood collection methods affect cellular protein integrity: implications for clinical trial biomarkers and ZAP-70 inn CLL.</a> Blood. 124 (7), 1192-1195 (2014).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
<li>Deaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD38+and+ZAP-70+are+functionally+linked+and+mark+CLL+cells+with+high+migratory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential.</a> Blood. 110 (12), 4012-4021 (2007).</li>
<li>Sachsenmeier, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+ectonucleotidase+assay+suitable+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of a novel ectonucleotidase assay suitable for high-throughput screening.</a> J Biomol Screen. 17 (7), 993-998 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可用于评估纯化的人白血病细胞培养上清液中CD39/CD73腺苷代谢系统的活性。通过该高效液相色谱（HPLC）方法，可追踪并定量测定由CD73依赖性酶促反应生成的腺苷（ADO），以及其随后被CD26/ADA依赖性途径降解为肌苷（INO）的过程。使用酶抑制剂有助于对实验流程进行控制，并设置内部对照。本方案的优点与创新之处在于：i）适用于处于培养状态的活细胞；ii）所需培养基用量少；iii）样品前处理极为简便。
我们的系统由一个分离模块组成，该模块配备四元低压混合泵、在线真空脱气装置和自动进样器。AMP、ADO 和 INO 的色谱分离是在基于硅胶的反相色谱柱上实现的，该色谱柱用于极性化合物的保留。二元流动相系统由缓冲液 A（7 mM 乙酸铵溶于双去离子水中，用盐酸调节 pH 至 3.0）和缓冲液 B（乙腈）组成。
该HPLC方法灵敏、可靠且可重复，适用于不同的细胞培养模型，包括贴壁细胞和悬浮细胞。该方法也可用于比较不同的培养条件，例如常氧（21% O2）与低氧（1-3% O2）...

腺苷（ADO）是一种嘌呤核苷，其腺嘌呤分子通过糖苷键连接到核糖糖基上。当存在于细胞外环境时，它可通过抑制免疫系统的过度反应来保护细胞免受损伤。这一作用已在多种疾病模型中得到证实，例如结肠炎1、糖尿病2、哮喘3、脓毒症4和缺血性损伤5。ADO的主要功能之一是抑制肿瘤微环境中的免疫应答，从而促进肿瘤的免疫逃逸6。因此，参与ADO生成及其信号传导的机制具有重要的治疗研究价值7。
在正常生理条件下，组织微环境中的腺苷（ADO）水平相对较低，且明显低于免疫细胞的检测阈值。然而，在缺氧、缺血、炎症、感染、代谢应激以及肿瘤转化过程中，ADO水平会迅速升高8。细胞外ADO水平的升高作为对组织损伤信号的响应，具有双重功能：一方面以自分泌和旁分泌方式报告组织损伤，另一方面引发可普遍视为细胞保护性的组织反应。
细胞外腺苷（ADO）可通过多种机制生成，包括通过核苷转运蛋白介导从细胞内区室释放，或因腺苷脱氨酶功能受损导致降解受阻而积累。导致细胞外ADO水平升高的主要途径涉及一系列外核苷酸酶的作用，这些酶是膜结合的外切酶，可通过磷酸水解死亡或濒死细胞释放的核苷酸来生成ADO。该途径依次由CD39（外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1）和CD73（5'-核苷酸酶）催化完成：CD39将细胞外的腺苷5'-三磷酸（ATP）或腺苷5'-二磷酸（ADP）转化为腺苷5'-单磷酸（AMP），随后CD73将AMP转化为ADO910。
细胞外的腺苷（ADO）通过与四种跨膜腺苷受体（即 A1、A2A、A2B 和 A3）结合，引发其生理反应。每种受体对腺苷的亲和力不同，并具有特定的组织分布。所有这些受体均具有七个跨膜结构域，并与细胞内 GTP 结合蛋白（G 蛋白）偶联，可激活（Gs 蛋白）或抑制（Gi 蛋白）腺苷酸环化酶活性，进而影响细胞内 cAMP 的生成。因此，在生理反应过程中，细胞质中 cAMP 水平的变化会影响细胞内蛋白激酶的活性11。在生理条件下，细胞外腺苷浓度低于 1 µM，可非选择性地激活 A1、A2A 和 A3 受体。然而，A2B 亚型的激活则需要更高的核苷浓度，通常出现在病理生理条件下。另一种可能是，腺苷通过腺苷脱氨酶（ADA）和定位于细胞膜表面的 ADA 复合蛋白 CD26 被降解为肌苷（INO）。此外，腺苷也可通过平衡性核苷转运蛋白（ENT）被细胞摄取，并由腺苷激酶磷酸化为 AMP12,13。
本实验方案旨在描述一种反相高效液相色谱法（RP-HPLC）的分析方法，用于在单次运行中定量检测人淋巴细胞产生的底物AMP以及产物ADO和INO。我们最初的研究经验来源于慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的细胞，这类患者的特征是存在大量成熟的CD19+/CD5+ B淋巴细胞，这些细胞组成性地表达CD3914,15。我们发现约30%的CLL患者表达CD73外切酶，且该表型与不良预后相关16。这群共表达CD39和CD73的白血病细胞亚群能够从ADP和/或AMP主动生成细胞外ADO。用已知的CD73酶活性抑制剂α,β-亚甲基-ADP（APCP）预孵育CD73+的CLL细胞，可完全阻断细胞外ADO的合成，从而证实CD73是该级联反应中的限速酶16。
慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞还表达腺苷脱氨酶（ADA）及其结合蛋白CD26，二者共同介导腺苷（ADO）转化为肌苷（INO）。通过使用特异性ADA抑制剂，如盐酸赤式-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤（EHNA）和脱氧辅酶F（dCF），可阻断细胞外ADO向INO的降解。此外，预先使用ADA抑制剂联合核苷转运体阻断剂双嘧达莫，可增强细胞上清液中ADO的累积。
随后，我们将该方案扩展至来源于其他谱系的细胞，包括T淋巴细胞和髓系细胞，证实了CD73依赖性的腺苷（ADO）生成。这些结果表明，该HPLC方案具有高度的通用性，可适用于不同的细胞谱系及不同的培养条件（图1）。
<img alt="腺苷代谢示意图，显示酶CD39、CD73、ADA/CD26及细胞转运通路。" src="/files/ftp_upload/54124/54124fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 细胞外腺苷（ADO）生成相关酶系统的示意图。 腺苷5'-三磷酸（ATP）和/或腺苷5'-二磷酸（ADP）可被CD39降解为腺苷5'-单磷酸（AMP），后者再由CD73转化为核苷腺苷（ADO）。ADO在细胞外生成后，可通过核苷转运蛋白（ENT）重新进入细胞，或转化为肌苷（INO），或与不同类型的P1腺苷受体结合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54124/54124fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>人血</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td>Millipore</td><td></td><td>双去离子水</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>纯化的抗-CD3、-CD14、-CD16 抗体</td><td>实验室自制</td><td></td><td>小鼠单克隆抗体</td></tr><tr><td>PE 标记的抗-CD19 抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>120-014-229</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗-CD5 抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-574</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 羊抗小鼠 IgG 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>11031</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Amresco</td><td>E404-200TABS</td><td>片剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>ID bio</td><td>1000-70</td><td>标准级</td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td></td><td></td><td>PBS 含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA，pH 7.4</td></tr><tr><td>AIM V 无血清培养基</td><td>GIBCO</td><td>12055-091</td><td>液体（研究级）</td></tr><tr><td>腺苷 5&amp;rsquo;-二磷酸（ADP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>腺苷 5&amp;rsquo;-单磷酸（AMP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>腺苷（ADO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>肌苷（INO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;,&amp;beta;-亚甲基-ADP（APCP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8386</td><td>CD73 抑制剂</td></tr><tr><td>EHNA 盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E114</td><td>腺苷脱氨酶抑制剂</td></tr><tr><td>脱氧辅酶霉素（dCF）</td><td>Tocris</td><td>2033</td><td>腺苷脱氨酶抑制剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>双嘧达莫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9766</td><td>核苷转运体抑制剂</td></tr><tr><td>乙腈（CHROMASOLV Plus）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9688</td><td>7 mM，pH 3.0</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L</td><td>最低浓度 37%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker 细胞计数器</td><td>VWR</td><td>631-0920</td><td>血细胞计数板</td></tr><tr><td>DynaMag-15 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>12301D</td><td>Dynal 磁珠分离器</td></tr><tr><td>微量离心安全锁扣管</td><td>Eppendorf</td><td>030-120-0086</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>PET 离心管</td><td>Corning</td><td>430053/430304</td><td>15 &amp;ndash; 50 ml</td></tr><tr><td>Minisart RC4 注射式滤器</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>17821</td><td>膜孔径 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>短螺纹小瓶</td><td>VWR</td><td>548-0029</td><td>1.5 ml/玻璃</td></tr><tr><td>微量内插管</td><td>VWR</td><td>548-0006</td><td>0.1 ml/玻璃</td></tr><tr><td>螺旋盖</td><td>VWR</td><td>548-0085</td><td>9 mm/聚丙烯蓝色</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 色谱柱</td><td>Waters</td><td>186001344</td><td>5 &amp;micro;m，4.6 mm × 150 mm</td></tr><tr><td>Atlantis dC18 保护柱</td><td>Waters</td><td>186001323</td><td>5 &amp;micro;m，4.6 mm × 20 mm</td></tr><tr><td>Waters Alliance 2965 分离模块</td><td>Waters</td><td></td><td>HPLC 分离模块</td></tr><tr><td>Waters 2998 光电二极管阵列（PDA）检测器</td><td>Waters</td><td></td><td>紫外检测器</td></tr><tr><td>Waters Empower2 软件</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

本方法描述了一种灵敏、特异、可靠且可重复的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）检测方法，该方法已开发并验证，用于定量检测在不同培养条件下由纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞产生的细胞外嘌呤核苷酸和核苷。腺苷5'-单磷酸（AMP）、腺苷（ADO）和肌苷（INO）的色谱分离在室温下于基于硅胶的反相色谱柱上进行，该色谱柱可用于极性化合物的保留。该方法采用由7 mM乙酸铵和乙腈组成的二元流动相，流速为1.00 ml/min。使用设定在260 nm波长的光电二极管阵列紫外检测器监测洗脱液。通过生成标准校准曲线，计算出每种嘌呤化合物分析定量的方程。随后进行系统控制、数据采集与分析。应用本方案时，AMP、INO和ADO的洗脱时间分别为7、11和11.9分钟，每个样品的总运行时间为20分钟。该方案可适用于不同类型的细胞和细胞系（包括悬浮和贴壁细胞），并以培养基作为基质。其优点在于样品前处理简便快速，且仅需少量上清液即可完成分析。此外，使用无血清培养基可省略乙腈蛋白沉淀步骤，避免对嘌呤化合物最终浓度造成影响。该方法的一个局限性在于每次单一样品运行前均需进行色谱柱平衡运行，导致实验总运行时间延长，因而不适用于高通量筛选应用。

为评估一例代表性慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者新鲜纯化的外周血单个核细胞（PBMC）中白血病细胞的百分比（%），使用抗CD19和抗CD5抗体对细胞进行标记。图3左侧面板显示针对活细胞设置的选择性门控的流式细胞术散点图。图3展示了CLL患者PBMC在B细胞纯化前（中面板）和纯化后（右面板）的示例。
CD73+ CLL 细胞中嘌呤类化合物的 HPLC 定量分析示例如图 4A所示。AMP、INO 和 ADO 在 260 nm 处不同的保留时间可实现这些化合物的同步定量。当实验条件正确时，所有核苷酸和核苷的色谱峰均能实现良好的分离。以 200 µM AMP 作为起始底物浓度时，ADO 和 INO 的色谱峰清晰可见，其浓度处于标准曲线的检测范围内。然而，即使使用较低浓度的底物（e.g., 100 µM），也能获得理想的结...

本文所述方案是一种简便且可重复的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来检测在不同培养条件下慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的嘌呤代谢情况。

该方法描述了一种灵敏、特异、可靠且可重复的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）检测方法的建立与……

本实验的总体目标是利用反相高效液相色谱法，在不同培养条件下定量检测慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中的嘌呤代谢。该方法已被用于确定细胞在何时以及如何在细胞外环境中产生腺苷。这是一个关键问题，因为腺苷既具有细胞保护作用，又具有免疫抑制作用。此外，该方法需要大量的培养基，但其制备极为简便。我们最初是在研究肿瘤微环境中嘌呤代谢时萌生了这一方法的想法，当时我们意识到，必须拥有一种简便且可重复的方法，以利用原代细胞来检测这种代谢过程。用室温的1×磷酸盐缓冲液（PBS）将全血进行1:1至1:3稀释，此步骤旨在获得纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）淋巴细胞，随后用于检测细胞外嘌呤代谢。通过密度梯度离心法从血液样本中分离纯化外周血单个核细胞。首先在15毫升离心管中加入5毫升密度梯度离心介质。然后小心加入10毫升稀释后的血液。立即在室温下以1,500 × g离心20分钟。使用连接至真空泵的玻璃巴氏吸管吸出部分上清液。然后用5毫升移液管收集密度梯度离心介质与稀释血浆界面处的PBMC环，并将细胞转移至15毫升离心管中。用PBS洗涤细胞。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将1000万个PBMC重悬于1 mL分离缓冲液中。即含0.1% BSA和2毫摩尔EDTA、pH值调节至7.4的PPS。现在需要从PBMC制备物中纯化CLL淋巴细胞。然后加入10微克小鼠单克隆抗CD3、CD14和CD16一抗，于4摄氏度孵育30分钟。用分离缓冲液洗涤细胞后，在 4°C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，将 1000 万个 PBMC 重悬于 1 毫升分离缓冲液中。加入 100 µL 洗涤后的磁珠，于 4°C 轻柔重悬细胞并孵育 30 分钟。随后将试管置于磁力架上静置 2 分钟。用五毫升移液管将含有未结合细胞的上清液转移至新的离心管中。此步骤完成后，即可使用纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）淋巴细胞。为建立高效液相色谱（HPLC）系统，首先按照文本方案中的描述，分别配制两升缓冲液A和缓冲液B。然后，将保护柱和色谱柱连接至高效液相色谱仪（HPLC）。登录HPLC软件，点击浏览项目按钮。进入文件菜单，选择新建方法，然后选择仪器方法。按照文本方案中列出的步骤设置平衡柱方法。设定流速为 1.00 毫升每分钟，并将紫外检测器的检测波长设置为 250 纳米。保存该方法。重复此步骤，以设置文本方案中指定的运行样品方法。设定流速为 1.00 毫升每分钟，并将紫外检测器编程为在 260 纳米处读数。保存该方法。单击“运行样品”按钮，然后从“文件”菜单中选择“新建样品集方法”。选择空白选项，并输入自动进样器中样品瓶的编号、样品名称以及50微升的进样体积。选择方法集，在方法集列中选择已保存的方法集，并输入总运行时间（单位：分钟）。为每个样品运行在方法集列中输入平衡柱方法，并输入总运行时间。按照文本

hplc-based-assay-to-monitor-extracellular-nucleotidenucleoside

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

HPLC-基于化验，以监测外核苷酸/核苷代谢的人类慢性淋巴细胞白血病细胞

该视频介绍了使用溴脱氧尿苷（BrdU）对哺乳动物细胞进行逐步脉冲标记的实验方法，用于检测细胞增殖。通过BrdU的摄取，可以在特定时间点追踪处于合成期的细胞，而无需对细胞进行同步化处理。...

溴脱氧尿苷脉冲标记实验：一种细胞增殖检测技术

本视频介绍了一种定量反相高效液相色谱法（RP-HPLC），用于检测白血病癌细胞在细胞外环境中消耗AMP所产生的腺苷及相关嘌呤的代谢情况。该方案描述了一种灵敏、特异、可靠且可重复的反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测方法，该方法已针对纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞在不同培养条件下产生的细胞外嘌呤核苷酸和核苷的定量分析进行了开发和验证。...

细胞外嘌呤代谢：基于高效液相色谱法检测白血病细胞中腺苷生成与代谢的实验方法

本视频展示了一种用于研究类中性粒细胞在保护淋巴瘤细胞免受化疗药物细胞毒性作用中的功能的实验方法。通过建立由淋巴瘤细胞和类中性粒细胞组成的三维共培养体系，并将其暴露于化疗药物长春新碱（vincristine）中。类中性粒细胞与淋巴瘤细胞的直接接触可诱导后者抗凋亡蛋白的上调，从而促进淋巴瘤细胞在长春新碱存在条件下的存活。...

确定类中性粒细胞在淋巴瘤细胞对试验药物敏感性中的作用

中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。本文介绍了通过密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞，以及将人早幼粒细胞（HL60）沿粒细胞途径进行分化的方法；用于检测它们在淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。...

中性粒细胞分离与分析以确定其在淋巴瘤细胞对治疗药物敏感性中的作用

本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。...

利用基于甲基化CpG结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面DNA甲基化分析

本文展示了一种基于流式细胞术的定量测定人类自然杀伤细胞细胞毒活性的方法。...

基于流式细胞术的细胞毒性检测法用于评估人自然杀伤细胞活性

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的白血病类型。NFAT转录因子在多种细胞类型的发育和活化过程中发挥重要的调控作用。本文介绍了一种在人类CLL细胞中应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术的实验方案，用于鉴定NFAT2的新型靶基因。...

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因

本方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效制备细胞核与细胞质组分，并对其进行优化。这些样品可用于确定蛋白质的定位，以及在细胞受到刺激或药物处理后，蛋白质在细胞核与细胞质区室之间转运发生的变化。...

原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

本文介绍了一种在植物体内精确且可重复地定量核苷/核苷酸的方法。该方法采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。...

植物样品中核苷/核苷酸含量测定的HPLC-MS/MS样品制备方法

本文描述了一种基于磷酸化流式细胞术的方法，用于分析移植到小鼠体内并从骨髓穿刺液中获取的人急性髓系白血病细胞中 mTORC1、JAK/STAT5 和 MAPK 信号通路下游的信号传导。利用新一代光谱流式细胞仪，可同时高灵敏度地检测 p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6 和 p-ERK1/2...

急性髓系白血病患者来源异种移植模型的细胞内磷酸流式细胞术

学习使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）定量分析慢性淋巴细胞白血病细胞中的嘌呤代谢，以测定腺苷生成并研究肿瘤微环境。该方法操作简便、可重复性强，适用于原代细胞培养。

基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

探索更多视频