Name: 定点自旋标记和五聚体配体门控离子通道的EPR光谱研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 了解定点自旋标记和EPR光谱技术用于研究五聚体配体门控离子通道的方法。该技术适用于多种膜蛋白，可在生理相关脂质环境中分析蛋白质动态变化。

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我们非常感谢Chakrapani实验室现任和前任成员对本文手稿的仔细审阅和宝贵意见。 本研究得到了美国国立卫生研究院基金（1R01GM108921）、美国心脏协会（NCRP科学家发展基金12SDG12070069）以及SC的资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

电子顺磁共振（EPR）波谱技术已被证明是在近天然环境中定量膜蛋白构象变化的一种无与伦比的结构研究方法。该方法使我们得以窥见蛋白质动态的分子细节，而这些细节在X射线晶体学和冷冻电子显微镜获得的高分辨率结构中往往被掩盖。然而，必须考虑该方法的技术局限性，这些局限性可能影响其在其他体系中的普遍适用性，同时也需注意实验过程中可能出现的潜在障碍。下文将讨论其中一些方面，并提供推荐的故障排除策略。
在涉及大量突变扰动的技术中，常见的问题之一是蛋白质产量低以及寡聚稳定性差。当研究对象为离子通道等复杂的多亚基膜蛋白时，这一问题尤为突出。因此，在开展大规模定点突变之前，优化蛋白质的这两个生化特性至关重要。我们发现，在 BL21 细菌的 C41 和 C43 菌株中，毒性 GLIC 突变体的表达耐受性更佳。3,36 此外，将诱导后的温度降低至 15 - 18 ºC，IPTG 浓度减少至 100 μM，并在诱导过程中添加 5% 甘油，似乎有助于降低蛋白质聚集，这可能是通过减缓蛋白质表达速率和减少错误折叠程度实现的。在某些位点（特别是在通透途径中）引入半胱氨酸突变已被证明会增加通道的组...

在过去十年中，由于获得了该家族多个成员的大量高分辨率结构，人们对五聚体配体门控离子通道（pLGIC）的结构理解取得了突飞猛进的发展。推动该领域当前进展的关键因素包括：原核生物pLGIC通道的发现1-3、真核膜蛋白表达方面的重大进展4-6，以及结构解析方法的巨大突破7。这些结构清晰地揭示了pLGIC三维结构整体上的保守性。然而，目前仍有两个主要方面相对滞后，即这些通道样品的功能表征以及通道功能的机制性描述。
门控构象变化十分复杂，沿通道长度方向可跨越60 Å的距离，且这些转变过程受到膜脂的广泛调控。特别是，阴离子脂质、胆固醇和磷脂已被证明可调节pLGIC的功能8-11。尽管这些脂质成分在通道功能中的确切作用仍不清楚，但要全面理解门控的分子机制，必须在通道的天然环境中对其进行研究。定点自旋标记（Site-Directed Spin Labeling, SDSL）和电子顺磁共振（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）波谱技术是研究重建体系中蛋白质动态特性的首选方法。EPR波谱技术不受分子尺寸（如核磁共振NMR）或样品光学性质（如荧光光谱）的限制，因此能够在天然脂质条件下对全长蛋白进行检测。该技术具有极高的灵敏度，且样品需求量极低（在皮摩尔量级）。这两个优势使该技术特别适用于研究难以大量表达（超过毫克量级）的大型膜蛋白。
电子顺磁共振（EPR）波谱技术结合定点自旋标记方法由Wayne Hubbell及其同事开发，现已适用于多种蛋白质类型的研究。12-24 EPR数据已被用于研究蛋白质的二级结构、构象变化、膜插入深度以及蛋白质-蛋白质/蛋白质-配体相互作用。
该方法通过定点突变在目标位点引入半胱氨酸替换。为确保位点特异性标记，需将天然存在的半胱氨酸替换为其他氨基酸例如，丝氨酸）以构建无半胱氨酸的模板。迄今为止，最常用的自旋标签是巯基特异性的MTSL：（1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯啉-3-甲基）甲烷硫代磺酸酯，该标签通过二硫键桥与蛋白质连接。由于其高度特异性、相对较小的尺寸（略大于色氨酸）以及连接区的柔韧性，该自旋标签即使在深埋的半胱氨酸位点也表现出优异的反应活性。此外，为了最大化反应效率，蛋白质的标记反应在去污剂溶解的形式下进行。通过尺寸排阻色谱去除过量未结合的自旋标签后，将蛋白质重组至具有明确脂质组成的脂质体或双层膜模拟系统中。通常情况下，半胱氨酸突变在蛋白质的大多数区域均可良好耐受，且自旋探针相对较小的体积对蛋白质的二级和三级结构扰动极小。为确保修饰后的蛋白质保留野生型功能，可通过膜片钳测量技术对标记并重组后的通道蛋白进行功能研究。
标记的功能蛋白随后进行光谱测量，这些测量主要提供三种信息：12,14,15,20,22,23,25-27 通过线型分析获得的自旋探针动力学信息；探针对顺磁性弛豫试剂的可及性；以及距离分布。27 电子顺磁共振（EPR）距离可通过两种不同方法测定。第一种基于连续波（CW）技术，利用自旋标记物之间偶极相互作用引起的谱线展宽（距离范围为 8 - 20 Å）来确定距离。28,29 第二种为脉冲式EPR方法，可将距离测量范围扩展至70 Å。30-34 在双电子-电子共振（DEER）技术中，通过分析自旋回波幅度的振荡来确定距离及距离分布。在此过程中，自旋回波受到偶极相互作用频率的调制。综合这些参数，可用于确定蛋白质拓扑结构、二级结构元件以及蛋白质构象变化。

<table><tbody><tr><td>定点突变与半胱氨酸突变</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PfuUltra HF 反应缓冲液</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England BioLabs Inc&amp;lrm;</td><td>N0447L</td><td>每种 dNTP 10 mM</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA 聚合酶</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/μL</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&amp;lrm;</td><td>R0176S</td><td>20,000 U/mL</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC 培养基</td><td>New England BioLabs Inc&amp;lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>表达与纯化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基硫代-&amp;beta;-半乳糖苷）</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM（正十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷）</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>直链淀粉树脂</td><td>New England BioLabs Inc&amp;lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>麦芽糖</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>空的聚丙烯层析柱</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>定点自旋标记</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL（1-氧基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-3-甲基）甲烷硫代磺酸盐</td><td>Toronto Research Chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-乙酰氧基-2,2,5,5-四甲基-&amp;Delta;3-吡咯啉-3-甲基) 甲烷硫代磺酸盐</td><td>Toronto Research Chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>重组</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大豆磷脂酰胆碱脂质</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>生物珠（聚苯乙烯珠）</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher chemicals</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素马来酰亚胺</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明马来酰亚胺</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.coli&lt;/em&gt; 极性脂质提取物</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EPR 测量</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPX 塑料毛细管</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA（乙二胺-N,N'-二乙酸）</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

位点定向自旋标记与五聚体配体门控离子通道的电子顺磁共振光谱研究

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

离子通道门控是由刺激驱动的蛋白质运动协调过程，可导致通道在关闭态、开放态和失敏态之间发生构象转变。这些转变的基础在于蛋白质固有的柔性，而这种柔性受到膜脂质组成的关键调控。为了更好地理解通道功能的结构基础，有必要在生理性的膜环境中研究蛋白质的动力学行为。电子顺磁共振（EPR）波谱技术是表征功能状态之间构象转变的重要工具。与核磁共振（NMR）和X射线晶体学相比，EPR所提供的信息本质上分辨率较低。然而，与其他技术不同的是，EPR对蛋白质的分子量没有上限要求，样品需求量显著更少，更重要的是，蛋白质不受晶体晶格力的限制。因此，EPR特别适用于研究大型蛋白质复合物以及在重建体系中的蛋白质。本文将以一种来自Gloeobacter violaceus（GLIC）的原核质子门控五聚配体门控离子通道（pLGIC）为例，介绍位点特异性自旋标记和膜重建的一般实验方案。本文将描述稳态连续波（CW）和脉冲式（双电子-电子共振，DEER）EPR技术的联合应用，以实现对通道动力学的全面定量表征。

自旋标记GLIC突变体的生化表征
按照上述方案操作，通常每升培养液可获得 10 - 12 mg 的 GLIC-MBP 融合蛋白。尽管该产量在不同突变体间可能存在差异，特别是对于蛋白内部埋藏位点的突变，产量可能会显著降低。在此类情况下，可能需要扩大培养体积。为操作方便，HRV3C 蛋白酶对融合蛋白的切割反应通常过夜（O/N）进行。通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分析样品，我们发现该切割反应在 30 - 60 分钟内即可完成（图 1A）。经凝胶过滤层析纯化后，GLIC 主要以五聚体形式洗脱，保留体积为 11.3 ml；MBP 组分在 15 ml 处洗脱，聚集体在柱的空体积处洗脱（约 7.0 ml）。自旋标记物则在洗脱末期出现（约 24 ml）（图 1B）
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本文介绍了用于电子顺磁共振研究的五聚体配体门控通道的定点自旋标记和重组方法。该方案可适用于任何膜蛋白。此处描述的重组方法也可用于在特定脂质体系中进行宏观和单通道电流的膜片钳测量。

离子通道门控是由刺激驱动的蛋白质运动协调过程，可导致通道在关闭、开放和失敏状态之间发生转换。

本方案的总体目标是展示一种五聚体配体门控通道蛋白的纯化、定点自旋标记及重组，以用于电子顺磁共振研究。在生理相关环境中研究膜蛋白的动力学对于全面理解这种膜转运蛋白的工作机制至关重要。鉴于这些需求，我认为定点自旋标记与电子顺磁共振（EPR）技术尤为适用。该技术的主要优势在于其不受蛋白质大小的限制。因此，如果您希望研究大分子蛋白质的动力学特性或在膜中重建的蛋白质，定点自旋标记结合电子顺磁共振（EPR）光谱技术将是首选方法。通过定点诱变在GLIC基因中引入单个半胱氨酸突变。按照文本方案所述，制备GLIC半胱氨酸突变体的过夜培养物。接着，向高压灭菌的TB培养基中加入100毫升无菌磷酸钾缓冲液。然后，加入无菌葡萄糖、卡那霉素以及10毫升过夜培养物。在37摄氏度、250 rpm条件下于摇床中孵育。加入50毫升甘油，并继续振荡培养，直至600纳米处的光密度达到1.0至1.2。用200微摩尔IPTG诱导细胞后，将摇床转速调回250 rpm，并在18摄氏度下继续孵育约16小时。在1 L离心瓶中收集细胞，于4 °C条件下以8500 ×g离心15分钟。倒出上清液，按照文本方案所述称量含有细胞沉淀的离心瓶。每1 L培养物用150 mL预冷的缓冲液A重悬细菌沉淀。在4摄氏度的冷室中，通过细胞破碎仪对细胞进行匀浆处理。重复该过程三次，以确保大部分细菌被裂解。随后在14,000 ×g 条件下离心15分钟。然后，用移液器吸出上清液并转移至洁净的离心管中。将上清液在168,000 × g条件下离心一小时后，小心倾倒上清液，避免扰动膜沉淀。收集来自一升培养液的膜沉淀，并将其重悬于含有10%甘油的缓冲液A中，最终体积为50毫升。向膜悬液中加入 0.5 克 DDM，并在 4°C 下温和摇动孵育两小时。膜蛋白溶解后，于 168,000 × g 离心一小时，去除裂解液中的细胞碎片。在此期间，准备 amylose 树脂。用移液器将三毫升树脂转移至一个空的聚丙烯层析柱中。用10倍柱体积的水洗涤树脂三次，然后用10倍柱体积的缓冲液A（含0.5毫摩尔DDM）洗涤。离心后，用移液器小心吸去上清液，并转移至一个洁净的50毫升锥形管中。进行分批结合时，将预平衡的淀粉树脂加入锥形管中。在4°C条件下旋转孵育混合物两小时，使提取的蛋白质与淀粉树脂结合。随后，将整个悬液通过层析柱，并收集穿流液。将GLIC蛋白用10毫升缓冲液A稀释，缓冲液A中除含有0.5毫摩尔的DDM和0.5毫摩尔的TCEP外，还含有40毫摩尔的麦芽糖。TCEP可防止半胱氨酸侧链发生氧化。收集全部洗脱液。使用离心浓缩器将洗脱的蛋白质浓缩至每毫升四到六毫克。加入HRV 3C蛋白酶，并在4°C下孵育过夜。进行位点定向自旋标记时，首先向蛋白酶消化后的样品中加入十倍摩尔过量的MTSL自旋标记物，使GLIC单体与MTSL的摩尔比为1:10。孵育一小时后，加入五倍摩尔过量的顺磁自旋标签，再孵育一小时。将样品通过预先用缓冲液A和0.5毫摩尔DDM平衡的尺寸排阻快速蛋白液相色谱（FPLC）柱，以分离切割下来的MBP标签、过量的游离自旋标签与GLIC五聚体。使用离心浓缩器将蛋白质溶液浓缩至终浓度约为8至10毫克/毫升，并置于冰上保存。样品现已准备好进行重组。制备脂质体时，先用5毫升氯仿冲洗一个洁净的25毫升圆底烧瓶，并在通风橱中用氮气流吹干烧瓶。然后，将10毫克大豆卵磷脂转移至烧瓶中，并在持续的氮气流下干燥脂质。当氯仿完全蒸发后，将烧瓶置于真空环境中一小时，以确保彻底干燥。随后，向干燥的脂质中加入1毫升重悬缓冲液A，并剧烈涡旋烧瓶，使脂质沉淀充分悬浮。为制备小单层囊泡，将脂质悬浮液置于冰浴超声仪中进行超声处理，直至囊泡溶液变得基本透明且无可见团块为止。向此混合物中加入 DDM，使其终浓度为 4 毫摩尔，并在室温下孵育 30 分钟。为重组蛋白质，将纯化的蛋白质加入脂质混合物中。将样品在 4 摄氏度下轻轻旋转孵育 1 小时后，用缓冲液 A 将样品稀释至 15 毫升。使用带有疏水孔的聚苯乙烯珠去除悬浮液中残留的去垢剂。加入80毫克洁净的磁珠，并将脂质体悬浮液在4摄氏度下于旋转混合仪中孵育过夜。次日，使用柱式滤器将脂质体转移至25毫升超速离心管中，以去除磁珠，并进一步将样品稀释至25毫升。将样品在168,000 × g条件下离心2小时后，倾去上清液，并用100微升缓冲液B重悬沉淀。为进行连续波电子顺磁共振（EPR）波谱分析，首先将脂质体悬浮液转移至200微升离心管中，并通过离心获得沉淀样品。弃去上清液后，样品即可用于EPR测量。尽可能移除脂质体样品中的缓冲液。为进行缓冲液置换，用移液器将20 µL脂质体沉淀转移至微量离心管中。加入180微升缓冲液D，在42摄氏度孵育5分钟。离心样品，用移液器吸除上清液，并重复该步骤三次，以确保完全的缓冲液置换。透气性塑料毛细管适用于光谱线型和溶剂可及性的测量。将毛细管轻触沉淀的蛋白脂质体，吸入样品后用骨蜡封住末端。图中显示的是通过凝胶过滤色谱法对自旋标记的GLIC突变体进行的生化表征，样品为MBP标签经蛋白酶切后的自旋标记GLIC。色谱峰对应于GLIC五聚体和游离的MBP。SDS 聚丙烯酰胺凝胶显示了凝胶过滤前未切割的单体 GLIC-MBP 融合蛋白，以及从凝胶过滤中分离出的 MBP 和 GLIC 组分。采用基于 FRET 的检测方法监测 GLIC 在不同膜脂中重建后的聚集状态。FRET 测量在样品过夜重建后以及经过多次冻融循环后进行。在从重建的asolectin囊泡中分离出的膜内向外式膜片上，通过快速溶液交换装置施加pH跳变可激活GLIC。可见通道在约10毫秒内被激活，并以1至3秒的时间常数发生脱敏。在通道激活过程中可观察到结构重排。在此处，孔道衬 lining M2 螺旋某一位置的连续波电子顺磁共振谱在 pH 变化时表现出信号强度和谱线形状的位移。电子顺磁共振波谱法是一种无与伦比的结构方法，可用于在天然环境中测量膜蛋白的构象变化，并揭示那些在高分辨率X射线结构或冷冻电镜结构中难以观察到的蛋白质动态的分子细节。使用该技术时，必须牢记，突变往往会导致蛋白质低聚态稳定性的降低和不稳定。因此，您可能需要制定策略来应对这些问题。将这些电子顺磁共振（EPR）研究的结果与功能测量相结合，可为我们提供更完整的结构-功能关系研究视角，未来的技术发展旨在利用这一强大方法，在更复杂的脂质环境下研究更为复杂的人体通道蛋白。

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