具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

本实验方案的总体目标是从单核细胞诱导生成耐受性成熟树突状细胞，用于实验研究或疫苗开发。该方法可通过提供研究树突状细胞发育、成熟及抗原呈递过程的模型，帮助解答免疫学领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于能够在体外高效诱导产生大量树突状细胞用于实验研究。

开始单核细胞富集：将20微升先前制备的外周血单个核细胞（PBMC）悬液与20微升台盼蓝混合，使用细胞计数仪计数活细胞数量。随后，离心细胞悬液。彻底吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于80微升染色缓冲液中，使细胞浓度为10的7次方个细胞。

每10的7次方个细胞中加入20微升CD-4微珠。充分混匀，并在4摄氏度下孵育细胞15分钟。每10的7次方个细胞用1毫升染色缓冲液洗涤细胞，然后离心细胞。

完全吸除上清液，并重悬细胞沉淀。对于最多 2 × 10⁸ 个总细胞，获取一个中等大小的柱子，并将其置于分离器的磁场中。接着，用 500 µL 染色缓冲液冲洗柱子。

用移液器将细胞悬液加入柱中，并收集流穿柱子的未标记细胞至一个15毫升离心管中。在柱子下方更换一个新的15毫升离心管，用500微升染色缓冲液洗涤柱子三次。每次洗涤之间，确保柱子的储液腔在加入新的染色缓冲液前已完全排空。

从分离器上取下色谱柱，置于新的15毫升离心管上。用移液器将1毫升染色缓冲液加入色谱柱中，并立即用力推动柱塞，将磁标记的细胞快速冲洗出来。然后，将流出组分转移至新的色谱柱，重复磁性分离步骤，以提高CD14阳性细胞的纯度。

将四组CD14阳性单核细胞以每毫升细胞培养基含0.3至0.5 × 10⁶个细胞的浓度接种于6孔板中，并加入IL-4。将细胞置于37°C、含5% CO₂的组织培养孵箱中孵育。第4天，从培养物中移除850 µL培养基，并进行离心。

吸弃上清液，并将沉淀重悬于一毫升细胞培养基中。将细胞混合物重新加入培养物中。在第五天，向其中两组培养物中每升培养基加入一微升维生素D3储备液和一微升地塞米松储备液，以生成耐受性单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）。

第6天，向所有组中加入200纳克/毫升的GMCSF和200纳克/毫升的IL-4。向其中一组仅用GMCSF和IL-4处理的细胞中加入1微克/毫升的LPS，以生成成熟的moDCs。向一组耐受性moDCs中加入1微克/毫升的LPS，以生成LPS诱导的耐受性moDCs。

最后，在第7天，用PVS EDTA冲洗培养皿以收获不同类型的moDCs。未成熟moDCs的制备方法是在第0、4和6天向纯化的CD14阳性单核细胞中添加GM-CSF和IL-4。在添加GM-CSF和IL-4之后，再加入维生素D3和地塞米松，可诱导未成熟moDCs分化为耐受性moDCs。

加入LPS以诱导未成熟moDCs向成熟moDCs的分化。同时，用LPS刺激耐受性moDCs以验证其对成熟过程的抵抗能力。对DC表面标志物的分析显示，成熟moDCs表达最高水平的成熟标志物HLA-DR、CD80、CD83和CD86。

相反，与未成熟和成熟 moDCs 相比，耐受性 moDCs 表现出 CD14、BDCA3 和免疫球蛋白样转录本的表达水平升高。使用红色 CMXRos 标记以反映线粒体活性，发现耐受性 moDCs 的线粒体活性高于其他分化的 moDC 亚型。该技术建立后，为免疫学领域的研究人员探索树突状细胞的代谢特征以开发疫苗和免疫疗法奠定了基础。