不成熟，成熟和耐受性树突状细胞的生成与代谢不同表型

未成熟的树突状细胞可以选择性分化为耐受性或成熟的树突状细胞，以调节免疫力和耐受性之间的平衡。这项工作提出了一种从未成熟单核细胞衍生的树突状细胞 （moDC）、体外耐受性和代谢表型不同的成熟 moDC 产生的方法。

该方案的总体目标是从单核细胞中产生耐受性和成熟的树突状细胞，用于实验或疫苗开发。该方法通过提供研究树突状细胞的发育、成熟和抗原呈递的模型，可以帮助回答免疫学领域的关键问题。该技术的主要优点是它能够在体外产生大量树突状细胞用于实验。

通过将 20 微升先前制备的外周血单核细胞或 PBMC 细胞悬液与 20 微升三班蓝混合来开始单核细胞富集，以使用细胞仪计数活细胞的数量。然后，离心细胞悬液。完全吸出上清液，并将细胞沉淀重悬至浓度为 80 μL 的染色缓冲液，用于 10 至第 7 个细胞。

每 10 个细胞向第七个细胞中加入 20 微升 CD-4 微珠。充分混合，并在 4 摄氏度下孵育细胞 15 分钟。每 10 个细胞用 1 毫升染色缓冲液洗涤细胞至第 7 个细胞，然后离心细胞。

完全吸出上清液，然后重悬细胞沉淀。获得一个中等色谱柱，最大为 10 到 8 个总细胞的 2 倍，并将色谱柱置于分离器的磁场中。接下来，用 500 μL 染色缓冲液冲洗色谱柱。

将细胞悬液移液到柱上，并将通过柱的未标记细胞收集在 15 mL 试管中。在色谱柱下更换一根新的 15 mL 试管，并用 500 μL 染色缓冲液洗涤色谱柱 3 次。在两次洗涤之间添加新的染色缓冲液之前，请确保色谱柱储液槽是空的。

从分离器中取出色谱柱，并将其放在新的 15 mL 试管上。将 1 mL 染色缓冲液移液到色谱柱上，然后立即将柱塞用力推入色谱柱，冲洗出磁性标记的细胞。然后，在新色谱柱中使用图示部分重复磁性分离步骤，以提高 CD14 plus 细胞的纯度。

在 6 个孔板中接种 4 组浓度为 0 点 3 至 0 点的 5 倍 10 至 6 的 CD14 加单核细胞，每毫升细胞培养基中的 IL-4 为 10 至 6 倍。在 37 摄氏度和 5% CO2 的组织培养箱中孵育细胞。第 4 天，从培养物中取出 850 μL 培养基，然后离心。

吸出上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 细胞培养基中。将细胞混合物重新加入培养物中。第五天，每 1 升培养基中加入 1 微升维生素 D3 原液和 1 微升地塞米松原液到其中两组中，以产生耐受性 moDC。

第 6 天，向所有套装中添加每毫升 200 纳克的 GMCSF 和 200 纳克/毫升的 IL-4。将每毫升 1 微克 LPS 添加到仅用 GMCSF 和 IL-4 处理的一组中，以生成成熟的 moDC。将每毫升 1 微克 LPS 添加到一组耐受性 moDC 中，以生成 LPS 耐受性 moDC。

最后，在第 7 天，用 PVS EDTA 冲洗培养皿，收获不同类型的 moDC。通过在第 0 天、第 4 天和第 6 天将 GMCSF 和 IL-4 添加到纯化的 CD-14 plus 单核细胞中来产生未成熟的 moDC。在 GMCF 和 IL-4 后添加维生素 D3 和地塞米松导致未成熟的 moDC 分化为耐受性 moDC。

添加 LPS 以诱导未成熟的 moDC 成熟为成熟的 moDC。并用 LPS 刺激耐受性 moDCs 以验证对成熟的抗性。对 DC 表面标志物的分析表明，成熟的 moDC 表达最高水平的成熟标志物 HLA-DR 、 CD80 、 CD83 和 CD86。

相反，与未成熟和成熟的 moDC 相比，致耐受性 moDC 表现出 CD14 、 BDCA3 和免疫球蛋白样转录物的表达增加。使用红色 CMXRos 来反映肌壳共生体活性，观察到与其他 moDC 分化亚型相比，耐受性 moDC 具有更高的肌壳共生体活性。开发后，这项技术为免疫学领域的研究人员探索树突状细胞的代谢特征以开发疫苗和免疫疗法铺平了道路。