Name: 不成熟，成熟和耐受性树突状细胞的生成与代谢不同表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学习从单核细胞生成耐受性和成熟树突状细胞的方法，用于免疫学研究和疫苗开发。该技术可高效体外制备大量树突状细胞，并分析其代谢特征与表面标志物表达。

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本工作由科学技术研究局核心资助（资助编号：J.E.C）支持。

本研究已获得机构审查委员会的批准（NUS-IRB 10-250）。
1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离&#160;
<ol>
	<li>试剂的制备
	<ol>
		<li>制备 PBS/EDTA：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤该溶液以实现灭菌。注意将 PBS/EDTA 储存于 4 °C，使用前恢复至室温。</li>
		<li>制备染色缓冲液：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2% 胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤该溶液以实现灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从血锥中收集血液 
	注意：血锥含有医院血小板单采后收集的白细胞成分。若血液采集于肝素或 EDTA 管中，请以 1:1 比例用 PBS 稀释后进行步骤 1.3；若收到的是白细胞层（buffy coat），请以 1:2 比例用 PBS 稀释后进行步骤 1.3。
	<ol>
		<li>剪断血锥两端，使血液流入 50 ml 离心管中。注意血锥通常含有 10 ml 血液。</li>
		<li>使用含有 30 ml PBS/EDTA 的钝头注射器冲洗血锥，并将冲洗液收集至 50 ml 离心管中。</li>
		<li>用 PBS/EDTA 进一步稀释血液，最终体积为 80 ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）16
	<ol>
		<li>将 15 ml Ficoll 分装至 4 个新的 50 ml 离心管中。</li>
		<li>使用 25 ml 血清移液管将 20 ml 稀释后的血液缓慢加至 Ficoll 液面上方。注意将 50 ml 离心管倾斜约 45° 角，并小心避免扰动两相界面。</li>
		<li>在 20 °C 条件下，以 805 × g 离心 30 分钟，离心过程中不启用刹车。</li>
		<li>移除血浆层，并用巴斯德移液管收集位于血浆层下方的 PBMC 环状层。将四管 PBMC 合并至两个 50 ml 离心管中。注意避免收集 PBMC 层下方的透明层。</li>
		<li>每管 PBMC 加入 PBS/EDTA 至终体积 50 ml，然后在 20 °C 条件下，以 548 × g 离心 10 分钟，启用刹车。</li>
		<li>吸除上清液，每管沉淀用 25 ml 染色缓冲液重悬，并合并至一个 50 ml 离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 367 × g 离心 5 分钟，启用刹车。</li>
		<li>吸除上清液，沉淀用 10 ml 染色缓冲液重悬。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过磁性分离法富集单核细胞17
<ol>
	<li>确定细胞数量
	<ol>
		<li>取 20 µl PBMC 细胞悬液，与 20 µl 台盼蓝混合，使用细胞计数仪计数活细胞数量。</li>
		<li>将细胞悬液在 367 × g 条件下，4 °C 离心 10 分钟，使用刹车。</li>
		<li>完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 80 µl 染色缓冲液中，浓度为每 80 µl 含 107 个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性标记
	<ol>
		<li>每 107 个细胞加入 20 µl CD14 微珠，充分混匀后于 2 - 8 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>每 107 个细胞加入 1 ml 染色缓冲液洗涤细胞，然后在 367 × g 条件下，4 °C 离心 10 分钟，使用刹车。</li>
		<li>完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于染色缓冲液中，浓度为每 50 µl 含 107 个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性分离
	<ol>
		<li>对于最多 2 × 108 个总细胞，使用中等尺寸的分选柱。 
		注意：根据总细胞数量以及数据表中推荐的 CD14+ 细胞数量，选择合适的分选柱和磁性分离器。</li>
		<li>将分选柱置于合适的磁性分离器的磁场中，并用 500 µl 染色缓冲液冲洗分选柱以进行预处理。</li>
		<li>将细胞悬液通过移液器加至分选柱上，用 15 ml 离心管收集未标记的穿柱细胞。</li>
		<li>在分选柱下方更换新的 15 ml 离心管，并用 500 µl 染色缓冲液洗涤分选柱 3 次。每次加洗涤缓冲液前，确保分选柱储液腔已完全排空。</li>
		<li>将分选柱从磁性分离器上取下，放置于一个新的 15 ml 离心管上。</li>
		<li>向分选柱中加入 1 ml 染色缓冲液，立即用套件中提供的推杆用力插入分选柱，将磁性标记的细胞快速洗脱下来。</li>
		<li>使用洗脱所得组分，在新的分选柱上重复步骤 2.3.2 至 2.3.6，以提高 CD14+ 细胞的纯度。注意：在步骤 3.2 的培养过程中，微珠将自动从细胞上解离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 树突状细胞向不同活化状态的分化&#160;
<ol>
	<li>试剂制备（所有试剂的内毒素水平必须低于 0.1 EU/ml）
	<ol>
		<li>制备细胞培养基：RPMI 1640 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 非必需氨基酸（NEAA）和 0.05 mM 2-巯基乙醇（2ME）。使用 0.2 µm 滤器过滤该溶液以实现无菌化。</li>
		<li>制备细胞因子：在无菌条件下，分别用细胞培养级水将 IL-4 和 GM-CSF 重悬至浓度为 0.25 mg/ml。将细胞因子分装至 200 µl 微量离心管中，于 -80 °C 保存。</li>
		<li>制备维生素 D3 储存液：在无菌条件下，用细胞培养级水将维生素 D3 重悬至浓度为 100 mM。将维生素 D3 分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>制备地塞米松储存液：在无菌条件下，用细胞培养级水将地塞米松重悬至浓度为 10 mM。将地塞米松分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>制备 LPS：在无菌条件下，用细胞培养级水将脂多糖（LPS）重悬至浓度为 1 mg/ml。将 LPS 分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成不同类型的 moDCs
	<ol>
		<li>将四组 CD14+ 单核细胞以 0.3–0.5 × 106/ml 的浓度接种于 6 孔板中，每孔培养基体积为 2 ml，培养基中含 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4。注意此为第 0 天。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 的组织培养箱中孵育。</li>
		<li>在第 4 天，从培养物中移除 850 µl 培养基，于 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 ml 含有 2 倍浓度（即 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4）的细胞培养基中，然后将该细胞悬液加回原培养孔中。注意：加入的 2 倍浓度 GM-CSF 和 IL-4 在 1 ml 培养基加回后最终稀释为 1 倍浓度。</li>
		<li>在第 5 天，向其中两组培养物中每毫升培养基加入 1 µl 维生素 D3 储存液和 1 µl 地塞米松储存液，以生成耐受性 moDCs。注意，维生素 D3 的终浓度为 100 nM，地塞米松的终浓度为 10 nM；第 5 天无需添加 GM-CSF 和 IL-4。</li>
		<li>在第 6 天，向所有组别中加入 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4。</li>
		<li>在第 6 天，向仅用 GM-CSF 和 IL-4 处理的一组中加入 1 µg/ml LPS，以生成成熟 moDCs。</li>
		<li>在第 6 天，向一组耐受性 moDCs 中加入 1 µg/ml LPS，以生成 LPS 耐受性 moDCs。</li>
		<li>在第 7 天，通过 PBS 加 EDTA 冲洗培养皿收集不同类型 moDCs，用于流式细胞术或其他研究。注意仅收集非贴壁细胞。需注意，由 CD14+ 单核细胞生成的未成熟 moDCs、成熟 moDCs、耐受性 moDCs 和 LPS 耐受性 DCs 的得率分别约为 90%、50%、60% 和 60%，且因供血者和 FBS 批次不同而有所差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流式细胞术
<ol>
	<li>moDCs 细胞表面标志物表征
	<ol>
		<li>通过移液将细胞从培养皿中脱离。用 PBS/EDTA 洗涤细胞一次，并将细胞重悬于 1.5 ml 微量离心管中，每 50 µl 染色缓冲液含 5 × 105 个细胞。</li>
		<li>将 0.5 × 106 个细胞分装，与以下抗体在 4 °C 避光孵育 30 分钟：PerCP 标记的 HLADR（1:100）、PE 标记的 CD80（1:50）、PE 标记的 CD83（1:25）、PE 标记的 CD86（1:50）、APC 标记的 CD11c（1:50）、PE 标记的 CD14（1:50）、PE 标记的 BDCA3（1:50）以及 APC 标记的 ILT3（1:25）。以同型对照的 PerCP 标记单克隆抗体（MAb，1:20）、PE 标记单克隆抗体（MAb，1:11）和 APC 标记单克隆抗体（MAb，1:11）作为阴性对照。</li>
		<li>使用流式细胞仪检测表面标志物的表达水平18。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>moDCs 线粒体膜电位分析
	<ol>
		<li>通过将 94.1 µl 二甲基亚砜（DMSO）加入 50 µg 冻干的红色氯甲基-X-玫瑰胺（Red CMXRos）中，配制 1 mM 的储备液。</li>
		<li>将 2 × 105 个 moDCs 与 100 nM Red CMXRos 在 1 ml Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中于 37 °C 孵育 30 分钟，使用 15 ml 管进行操作。</li>
		<li>向细胞中加入 2 ml PBS/EDTA，室温下以 300 × g 离心 5 分钟，重复两次。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 300 µl 含 2% FCS 的 PBS/EDTA 溶液中，用于流式细胞术分析。注意使用 PE 通道检测 Red CMXRos 信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>T 细胞标志物表征&#160;
	<ol>
		<li>取 50 µl 含 1.2 × 106 个经 CFSE 标记的同种异体 CD4+ T 细胞（来自步骤 5.6），与 PerCP 标记的 CD3（1:200）、PE/Cy7 标记的 CD4（1:400）以及 APC/Cy7 标记的 CD25（1:100）在 4 °C 避光孵育 30 分钟。使用商业试剂盒对 T 细胞进行染色，加入 Foxp3-Alexa Fluor 647（1:50），室温避光孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 异体反应研究
<ol>
	<li>根据制造商说明书，将18 µl DMSO加入冻干的CFSE中，制备5 mM的CFSE储备液。</li>
	<li>从PBMC中纯化CD4+ T细胞
	<ol>
		<li>取20 µl PBMC细胞悬液，与20 µl台盼蓝混合，使用细胞计数仪测定活细胞数量。</li>
		<li>将细胞悬液在4 °C条件下以367 × g离心10分钟，开启刹车。</li>
		<li>完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于5 ml聚苯乙烯管中的染色缓冲液中，浓度为每1 ml含5 × 107个细胞。</li>
		<li>按每毫升细胞加入50 µl人CD4+ T细胞富集混合液。充分混匀后于室温（15–25 °C）孵育10分钟。</li>
		<li>涡旋磁性颗粒30秒，按每毫升细胞加入100 µl磁性颗粒。充分混匀后于室温孵育5分钟。</li>
		<li>向细胞悬液中加入染色缓冲液，总体积达2.5 ml。通过轻柔吹打2–3次混匀管内细胞。将管子放入磁架中，孵育5分钟。</li>
		<li>将磁架连同管子翻转，倾倒出悬液（含T细胞）至新的5 ml聚苯乙烯管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定细胞数量，并将1.2 × 106个CD4+ T细胞与5 µM CFSE在1 ml PBS中于37 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>向细胞中加入相当于初始染色体积5倍的细胞培养基（按步骤3.1.1制备），孵育5分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于细胞培养基中，浓度为每75 µl含2 × 105个细胞。</li>
	<li>将75 µl含2 × 105个CFSE标记的CD4+ T细胞加入至96孔U型底板中的每孔moDC培养体系中，每孔含75 µl细胞培养基，并分别含有0、2.5 × 103、5 × 103、10 × 103、20 × 103和40 × 103个moDC。在37 °C、5% CO2条件下于组织培养箱中培养6天。</li>
	<li>用移液器将CD4+ T细胞转移至15 ml离心管中，于4 °C以300 × g离心5分钟。收集上清液用于细胞因子分析，将细胞沉淀重悬于2 ml PBS/EDTA中，再次于4 °C以300 × g离心5分钟。</li>
</ol>
6. 细胞因子分析19
<ol>
	<li>按照步骤 5.5 所述，收集同种反应研究中的上清液。</li>
	<li>人细胞因子/趋化因子磁珠分析试剂的制备
	<ol>
		<li>为制备单个磁珠小瓶（试剂盒中包含）的抗体偶联磁珠混合瓶，将各抗体磁珠小瓶中的磁珠各取 60 µl 加入混合瓶（试剂盒中包含），并用磁珠稀释液（试剂盒中提供）定容至终体积 3 ml，充分涡旋混匀 1 分钟。</li>
		<li>为制备质控品，将质控品 1 和质控品 2（试剂盒中包含）用 250 µl 去离子水重悬。</li>
		<li>为制备洗涤缓冲液，将 30 ml 的 10 倍浓缩洗涤缓冲液（试剂盒中包含）与 270 ml 去离子水混合稀释。</li>
		<li>为制备人细胞因子标准品，将人细胞因子标准品（试剂盒中包含）用 250 µl 去离子水重悬，得到浓度为 10,000 pg/ml 的溶液。
		<ol>
			<li>在 1.5 ml 微量离心管中，将 50 µl 10,000 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液（试剂盒中提供）中，配制成 2,000 pg/ml 工作标准品。再取 50 µl 2,000 pg/ml 人细胞因子标准品加入另一管含 200 µl 分析缓冲液的 1.5 ml 微量离心管中，配制成 400 pg/ml 工作标准品。</li>
			<li>取 50 µl 400 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液中，配制成 80 pg/ml 工作标准品。再取 50 µl 80 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液中，配制成 16 pg/ml 工作标准品。</li>
			<li>取 50 µl 16 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液中，配制成 3.2 pg/ml 工作标准品。0 pg/ml 工作标准品仅含 200 µl 分析缓冲液于 1.5 ml 微量离心管中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移液器将 200 µl 分析缓冲液（试剂盒中提供）加入滤板的每孔中，以预润湿滤板（试剂盒中包含）。密封后将滤板置于平板振荡器上，室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>吸除分析缓冲液，向相应孔中加入 25 µl 各标准品或质控品。</li>
	<li>向背景孔、标准品孔和质控孔中各加入 25 µl 细胞培养基（按步骤 3.1.1 制备）。</li>
	<li>向样品孔中加入 25 µl 分析缓冲液，并向相应的样品孔中加入 25 µl 样品。</li>
	<li>涡旋混匀含有抗体偶联磁珠的混合瓶，向每孔加入 25 µl 混合磁珠。密封后于 4 °C 在平板振荡器上振荡孵育过夜。</li>
	<li>吸除液体，每孔加入 200 µl 洗涤缓冲液，吸除液体，重复洗涤 2 次。</li>
	<li>向每孔加入 25 µl 检测抗体（试剂盒中提供）。密封后于平板振荡器上室温振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>向含有 25 µl 检测抗体的各孔中加入 25 µl 链霉亲和素-藻红蛋白（Streptavidin-Phycoerythrin，试剂盒中提供）。密封后于平板振荡器上室温振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除液体，按步骤 6.8 所述方法洗涤平板。</li>
	<li>向所有孔中每孔加入 150 µl 鞘液（Sheath Fluid），并在平板振荡器上重悬磁珠 5 分钟。</li>
	<li>使用 3D 系统20检测磁珠的荧光强度。采用五参数对数-逻辑曲线拟合方法分析中位荧光强度数据，以计算样品中细胞因子/趋化因子的浓度21。</li>
</ol>
7. 实时氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）测定
<ol>
	<li>试剂/材料的准备
	<ol>
		<li>制备OCR培养基：在检测培养基中添加25 mM葡萄糖和1 mM丙酮酸钠（pH 7.35）。通过0.2 µm滤膜过滤对该溶液进行灭菌。请注意，该培养基不添加胎牛血清（FBS），因为FBS中的成分复杂，且不同批次之间存在差异。</li>
		<li>制备ECAR培养基：在基础培养基中添加2 mM L-谷氨酰胺（pH 7.35）。通过0.2 µm滤膜过滤对该溶液进行灭菌。请注意，该培养基不添加碳酸氢盐、葡萄糖、丙酮酸和FBS。需注意FBS具有缓冲能力，会干扰ECAR读数。</li>
		<li>制备用于OCR检测的化合物：用630 µl OCR培养基重悬寡霉素，配制成100 µM的储存液，并用OCR培养基稀释至16 µM的工作浓度。用720 µl OCR培养基重悬羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP），配制成100 µM的储存液，并用OCR培养基稀释至4.5 µM的工作浓度。用540 µl OCR培养基重悬鱼藤酮/抗霉素A，配制成50 µM的储存液，并用OCR培养基稀释至10 µM的工作浓度。</li>
		<li>制备用于ECAR检测的化合物：用3 ml ECAR培养基重悬葡萄糖，配制成100 mM的储存液，并稀释至80 mM的工作浓度。用720 µl ECAR培养基重悬寡霉素，配制成100 µM的储存液，并稀释至18 µM的工作浓度。用1.5 ml ECAR培养基重悬2-脱氧-D-葡萄糖，配制成1,000 mM的储存液。</li>
		<li>在测量前一天，向每孔检测板中加入200 µl校准剂，并于37 °C、无CO2条件下储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时OCR检测
	<ol>
		<li>收集moDCs，并将每种类型的moDCs以每150 µl OCR培养基含60 × 103个细胞的浓度重悬于OCR培养基中。</li>
		<li>将60 × 103个细胞/孔接种至多聚-D-赖氨酸包被的96孔平底板中，在37 °C、无CO2培养箱中孵育1小时。注意：使用50 µl浓度为50 ng/ml的多聚-D-赖氨酸对板进行包被，孵育1小时后用无菌水洗涤，并在室温下干燥2小时后使用。</li>
		<li>向所有孔的加样口A中加入25 µl OCR培养基；向所有孔的加样口B中加入含16 µM寡霉素的25 µl OCR培养基；向所有孔的加样口C中加入含4.5 µM FCCP的25 µl OCR培养基；向所有孔的加样口D中加入含10 µM鱼藤酮/抗霉素A的25 µl OCR培养基。注意：寡霉素在孔中的终浓度为2 µM，FCCP为0.5 µM，鱼藤酮/抗霉素A为1 µM。</li>
		<li>将板放入细胞外通量分析仪中，同时对所有moDCs进行完整的OCR检测，分为四个连续阶段：基础呼吸（加样口A加入培养基后）、线粒体复合体V抑制（加样口B加入药物后）、最大呼吸诱导（加样口C加入药物后）和电子传递链抑制（加样口D加入药物后）22。注意：两次加样之间有3个循环，每次测量间隔6分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时ECAR检测
	<ol>
		<li>收集moDCs，并将每种类型的moDCs以每150 µl ECAR培养基含60 × 103个细胞的浓度重悬于ECAR培养基中。</li>
		<li>将6 × 104个细胞/孔接种至多聚-D-赖氨酸包被的96孔平底板中，在37 °C、无CO2培养箱中孵育1小时。</li>
		<li>向所有孔的加样口A中加入25 µl ECAR培养基；向所有孔的加样口B中加入含10 mM葡萄糖的25 µl ECAR培养基；向所有孔的加样口C中加入含18 µM寡霉素的25 µl ECAR培养基；向所有孔的加样口D中加入含1,000 mM 2-脱氧-D-葡萄糖的25 µl ECAR培养基。注意：葡萄糖在孔中的终浓度为10 mM，寡霉素为2 µM，2-脱氧-D-葡萄糖为100 mM。</li>
		<li>将板放入细胞外通量分析仪中，同时对所有moDCs进行完整的ECAR检测，分为四个连续阶段：基础呼吸（加样口A加入培养基后）、糖酵解诱导（加样口B加入药物后）、最大糖酵解诱导（加样口C加入药物后）和糖酵解抑制（加样口D加入药物后）22。</li>
		<li>采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较事后检验分析统计学差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jolles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paul+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paul Langerhans.</a> J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
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<li>Hemmi, H., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+and+the+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">TLR signalling and the function of dendritic cells.</a> Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).</li>
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<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).</li>
<li>Paavonen, J., Lehtinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+human+papillomavirus+and+other+sexually+transmitted+agents+in+the+etiology+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer.</a> Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).</li>
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<li>Al-Hello, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enterovirus+strain+isolated+from+diabetic+child+belongs+to+a+genetic+subcluster+of+echovirus+11%2C+but+is+also+neutralised+with+monotypic+antisera+to+coxsackievirus+A9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9.</a> J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).</li>
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本文介绍了一种从单核细胞体外生成未成熟moDCs、耐受性moDCs和成熟moDCs的方法。以下段落将详细讨论本方案中的关键步骤。需要注意的是，本方案以人外周血作为起始材料，操作时应遵循处理人源血液的通用安全规范。尽管从技术上讲，也可从人类骨髓中获取树突状细胞24，但由于外周血比骨髓更容易获得，因此更倾向于使用外周血中的细胞进行体外树突状细胞分化。在外周血所含的各类细胞中，造血CD34+干细胞和单核细胞常用于体外生成树突状细胞。造血CD34+干细胞在GM-CSF和TNF-α的培养条件下，可分化为CD1a+和CD14+亚群，随后进一步分化为类似朗格汉斯细胞和树突状细胞。相反，单核细胞则在GM-CSF和IL-4的培养条件下生成未成熟的moDCs。目前有多种方法可用于从外周血中富集单核细胞，例如通过贴壁法、离心淘析法以及商品化分离试剂盒25, 26。贴壁法的优点是对细胞损伤最小且相对经济，但可能影响细胞纯度，并且需要额外步骤将细胞从培养皿上解离下来以用于后续实验。离心淘析法是一种根据细胞大小和密度进行分离的技术，其优势在于细胞活力高，且分离后的单核细胞可直接用于后续实验；但该技术受限于离心淘析仪的可及性，并且无法有效分离沉降参数相似的不同细胞群体（如T细胞和单核细胞）。市面上的分离试剂盒通常利用磁性微珠对单核细胞群进行正向选择或负向选择。某些方案更倾向于采用负向选择法进行单核细胞分离，因为所获得的单核细胞保持“未接触”状态（即未与标记物或微珠结合）。在本方案中，使用CD14磁珠对人外周血单个核细胞（PBMCs）中的单核细胞进行正向选择。CD14缺乏胞内结构域，抗体与CD14结合不会触发信号转导。此外，磁珠在培养后会从单核细胞上脱落，因此不会干扰后续的分化过程。同时，CD14在大多数单核细胞上高表达，在中性粒细胞和部分髓系树突状细胞上弱表达，因此该分离方法所获得的细胞纯度高于其他方法17。
血液单核细胞可分化为树突状细胞（DCs）或巨噬细胞，而单核细胞的分化命运在很大程度上取决于细胞因子环境。本文通过向人外周血单核细胞添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）来生成moDCs。GM-CSF是单核细胞存活所必需的，而IL-4对巨噬细胞分化具有抑制作用；联合使用GM-CSF和IL-4相比单独使用任一种细胞因子，可获得更高比例的未成熟moDCs27。此外，也有其他方案通过向外周血单核细胞添加肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素α（IFN-α）和白细胞介素13（IL-13）来生成moDCs28,29,30。GM-CSF与IL-4的组合在20世纪90年代得到优化，现已成为一种公认的标准方案，可用于生成可塑性的未成熟DCs，这些DCs可进一步分化为免疫原性或耐受性moDCs，并极化为促进Th1、Th2或Th17反应的moDCs。
通过添加维生素D3和地塞米松，可将未成熟moDCs分化为耐受性moDCs。目前已有多种生成耐受性DC的方法，例如通过抑制核因子-κB（NF-κB）、激活β-连环蛋白、使用维生素D3、地塞米松和雷帕霉素31,32,33,34,35,9,36,37。尽管已有报道显示单独使用维生素D3或地塞米松均可在DC上诱导耐受效应，但联合使用维生素D3和地塞米松对同种异体增殖的抑制作用强于单独用药。因此，现有的耐受性DC制备方案被优化为联合使用维生素D3和地塞米松。该方法目前已被广泛接受为具有治疗潜力的人源耐受性DC模型。还需注意的是，配制后的维生素D3和地塞米松保存期限较短。
在本方案中，添加脂多糖（LPS）作为树突状细胞（DC）成熟的诱导剂。未成熟 moDCs 也可通过促炎性因子混合物（肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和前列腺素E2）或促炎性细胞因子（TNF-α 和干扰素γ（IFN-Γ））诱导其成熟。促炎性因子混合物可诱导生成具有较强共刺激和迁移功能的成熟 moDCs，但其产生的 IL-12 水平相对较低38。单独使用 TNF-α 或 IFN-Γ 无法诱导出稳定的树突状细胞表型39。LPS 通过刺激 Toll 样受体 4（TLR4），介导 NF-kB 和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的活化，从而诱导 DC 成熟。由 LPS 诱导的 DC 成熟表现为 DC 成熟标志物（CD83、CD86、HLA-DR）的上调，并促进 IL-12p70 的产生。此外，该步骤还可进一步优化，将 LPS 与 TLR3 激动剂联用，以生成适用于临床癌症疫苗的成熟 DCs。本文显示，耐受性 DCs 在 LPS 处理后对成熟具有抵抗性。这类类似半成熟状态的 DCs 不具有免疫原性，且不释放促炎性细胞因子40。
该方案的局限性在于分化过程。从第0天到第7天共需8天时间，难以适用于高通量分析。需要对该方案进行改进，以缩短分化周期，同时获得大量处于不同状态的活细胞。其次，本方案通过添加细胞因子诱导树突状细胞生成，而这些细胞因子无法长期维持树突状细胞群体。此外，所用细胞因子的浓度远高于 在体内 并可能导致通路的偏倚性发育，这些通路在生理上并不完全等同于 体内 DCs。例如 体外 DC前体的培养物已被证实可对GM-CSF产生反应，但GM-CSF并非正常DC分化所必需的细胞因子 在体内41然而，细胞因子刺激可能是生成大量树突状细胞的一种有效方法 体外 用于实验。利用本方案所获得的细胞可进一步进行免疫荧光染色、流式细胞术、同种反应研究及代谢研究等多种分析，从而提升了该方法的实用性。这些 体外 DCs 可作为研究 DC 发育、成熟及抗原提呈的良好模型，此前由于 DC 数量稀少，相关研究难以开展 在体内 DCs
树突状细胞（DCs）在调节免疫应答与免疫耐受之间的平衡方面具有独特能力，使其成为治疗癌症和自身免疫性疾病极具前景的候选手段42,43,44,45。本方案中生成的免疫原性DC可用于提高针对感染性疾病和肿瘤的疫苗疗效；而耐受性DC则可用于控制异常的T细胞应答，并预防移植后的排斥反应。免疫与耐受之间的精细平衡在很大程度上取决于DC的分化状态。DC的分化是一个受多种信号通路和代谢命运共同调控的协调性细胞程序。不同分化状态的DC在生物能量和生物合成需求方面存在差异；例如，与静息状态的DC相比，活化的DC需要更强的能量代谢适应能力，以支持其存活和迁移。值得注意的是，已知可诱导耐受性DC的维生素D3、地塞米松和雷帕霉素也被报道能够影响DC的代谢。本文利用细胞外通量分析仪对不同分化状态的moDCs的能量代谢进行了表征，结果显示耐受性moDCs具有最高的代谢可塑性，而LPS诱导的成熟过程会降低这种可塑性。合成代谢支持DC的成熟过程，而分解代谢则影响耐受性DC的功能46。本方案生成的DC可用于评估调控DC代谢状态是否是调节免疫与耐受治疗效果的关键。综上所述，我们提供了一种用于生成未成熟、耐受性和成熟moDCs的实验方案，这对于研究DC的免疫调节功能至关重要。

树突状细胞（DC）最早由 Paul Langerhans（即 Langerhans 细胞）于19世纪末首次描述，Jolles 1 引用了相关文献，随后 Ralph Steinman 和 Zanvil Cohn 于1973年对其进行了表征，并确认其为专职的抗原呈递细胞 2。DC 广泛分布于外周血及机体大多数组织中，尤其在暴露于外界环境的组织中含量丰富，例如皮肤（以 Langerhans 细胞形式存在）、鼻腔、肺、胃和肠道黏膜，这使其能够接触外源性抗原。未成熟 DC 具有内吞能力，但刺激 T 细胞的能力相对较弱 3。未成熟 DC 表达多种模式识别受体（PRRs），可识别病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）4。危险信号的激活促使 DC 向免疫原性表型成熟，而自身分子则导致 T 细胞无应答及凋亡 5。免疫原性 DC 的特征是主要组织相容性复合体（MHC）分子和共刺激表面分子表达上调，并具备激活初始 T 细胞的能力 6,7。
未成熟的树突状细胞也可在维生素D3代谢产物1a,25(O)作用下向诱导调节性T细胞（Treg）或耐受性状态分化。2D3 以及某些免疫抑制剂，如白细胞介素-10（IL-10）、地塞米松和雷帕霉素 8-9耐受性树突状细胞的特征是表达含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs）的表面受体和配体。在耐受性树突状细胞中，含有ITIMs的ILT家族成员ILT3和ILT4的信号转导可抑制同种异体增殖，并促进Foxp3的表达+ 调节性T细胞扩增 10,11这些耐受性树突状细胞的独特特性使其具有强大的效能 体内即诱导对移植的同种异体移植物产生持久耐受性，并抑制自身免疫性疾病的发展。因此，耐受性树突状细胞可被视为一种成熟极化型树突状细胞亚型，其功能在于抑制免疫激活。
目前，人类外周血中的树突状细胞主要有两种亚群：浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DCs）和髓系树突状细胞（myeloid DCs）12。循环中的树突状细胞数量稀少，占人类血液白细胞的比例不足2%，这为分离出足够数量的树突状细胞以研究其免疫调节功能带来了困难。为克服这一问题，通常采用单核细胞来源的树突状细胞作为体外（in vitro）研究树突状细胞功能的模型。这些体外（in vitro）培养的树突状细胞在受体表达和功能方面与体内（in vivo）的树突状细胞相似。其他实验室已对体内（in vivo）树突状细胞与体外（in vitro）生成的单核细胞来源树突状细胞（moDCs）进行了详细的比较研究13,14,15。另有报道指出，moDCs与CD1c+树突状细胞在抗原呈递和T细胞诱导功能方面具有等效性15。
本文介绍了一种从外周血单核细胞生成未成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs），并进一步将其分化为免疫原性或耐受性树突状细胞的方法。这些单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）通过其表面标志物、细胞因子谱、免疫调节功能及代谢状态进行表征。免疫原性和耐受性树突状细胞可分泌不同的细胞因子，从而分别促进同种异体T细胞或调节性T细胞的扩增。本文采用多重技术平台进行细胞因子谱分析，即将细胞培养上清与抗体偶联的编码微球共同孵育，并在小型分析仪中读取结果。树突状细胞的代谢状态则通过细胞外通量分析仪进行检测，该仪器可测量氧消耗率（反映细胞呼吸作用）和细胞外酸化率（反映树突状细胞的糖酵解通量）。这些生物能量代谢速率的测定为追踪树突状细胞发育与功能所依赖的细胞代谢变化提供了有效手段。

<table><tbody><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>PBMC 分离</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Becton, Dickinson</td><td>302832</td><td>PBMC 分离</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>PBMC 分离</td></tr><tr><td>15 ml Falcon 管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>PBMC 分离</td></tr><tr><td>50 ml Falcon 管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>PBMC 分离</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PBMC 分离</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>17597</td><td>PBMC 分离</td></tr><tr><td>MACs 试剂盒</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td>单核细胞富集</td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-102</td><td>单核细胞富集</td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070103</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>磷酸盐&lt;br/&gt; 缓冲液</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11140-040</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15575</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-868</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-924</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>维生素 D3</td><td>Sigma</td><td>D1530</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D2915</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>l2755</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PerCP 标记的 HLADR&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE 标记的 CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE 标记的 CD83&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>556855</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE 标记的 CD86&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>APC 标记的 CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE 标记的 CD14&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-242</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE 标记的 BDCA3&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-514</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>APC 标记的 ILT3&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-5139-73</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>同型对照&lt;br/&gt; PerCP 标记的单克隆抗体</td><td>BioLegend</td><td>400250</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>同型对照&lt;br/&gt; PE 标记的单克隆抗体</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-835</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>同型对照&lt;br/&gt; APC 标记的单克隆抗体</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-836</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>BD LSR II 流式细胞仪</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD LSR II&amp;nbsp;</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>cytofix/cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>APC/CY7 标记的 CD25</td><td>BD pharmingen</td><td>557753</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PE/CY7 标记的 CD4</td><td>Biolegend</td><td>300512</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PerCP 标记的 CD3</td><td>Biolegend</td><td>300428</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>EasySep 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td>同种反应研究</td></tr><tr><td>EasySep 磁力架&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td>同种反应研究</td></tr><tr><td>Cell Trace CFSE 细胞增殖试剂盒</td><td>Molecular probes</td><td>C34554</td><td>同种反应研究</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14025092</td><td>同种反应研究</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的 FoxP3</td><td>BD Biosciences</td><td>560889</td><td></td></tr><tr><td>Milliplex MAP 人&lt;br/&gt; 细胞因子/趋化因子&lt;br/&gt; 磁珠检测面板</td><td>Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td>细胞因子分析</td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>细胞因子分析</td></tr><tr><td>Luminex 鞘液&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td>细胞因子分析</td></tr><tr><td>FLEXMAP 3D 系统配 xPONENT 软件</td><td>Luminex Corporation</td><td>FLEXMAP 3D</td><td>细胞因子分析</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Cell Signalling</td><td>9082</td><td>线粒体活性</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>线粒体活性</td></tr><tr><td>XF 检测缓冲液（OCR）</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102352-000</td><td>代谢适应</td></tr><tr><td>葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>代谢适应</td></tr><tr><td>XF 基础缓冲液（ECAR）</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>代谢适应</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>代谢适应</td></tr><tr><td>校准液</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000&amp;nbsp;</td><td>代谢适应</td></tr><tr><td>XF 线粒体应激检测试剂盒</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103015-100</td><td>代谢适应</td></tr><tr><td>XF 糖酵解应激检测试剂盒</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103020-100</td><td>代谢适应</td></tr><tr><td>Seahorse&amp;nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td>代谢适应</td></tr></tbody></table>

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

免疫反应源于非特异性识别抗原的先天免疫系统与特异性识别抗原的适应性免疫系统之间复杂的相互作用。免疫系统始终处于维持对自身分子耐受与快速应对病原体之间的动态平衡。树突状细胞（DCs）是一类强大的专业抗原呈递细胞，能够连接先天免疫系统与适应性免疫系统，并在自身与非自身之间调节适应性免疫应答的平衡。根据不同的成熟信号，未成熟的树突状细胞可被选择性地刺激分化为免疫原性树突状细胞或耐受性树突状细胞。免疫原性树突状细胞可为抗原特异性T细胞提供增殖信号，促进其克隆扩增；而耐受性树突状细胞则通过诱导抗原特异性T细胞的删除或调节性T细胞的克隆扩增来调控免疫耐受。由于这一独特特性，树突状细胞作为治疗癌症和自身免疫性疾病的治疗剂备受关注。树突状细胞可被负载特定抗原 体外 并注入人体以引发特异性免疫反应，包括免疫原性和耐受性免疫反应。本研究提供了一种生成方法 体外 从单核细胞、未成熟的单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）、耐受性moDCs以及成熟moDCs，这些细胞在表面标志物表达、功能和代谢表型上存在差异。

单核细胞纯化与树突状细胞分化
通过外周血密度离心（图1A）从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞，随后通过CD14+阳性选择磁分离法（图1B）进行纯化，并在含GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养，以获得未成熟树突状细胞（图2A）。在使用GM-CSF和IL-4处理后，添加维生素D3和地塞米松，可诱导未成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）分化为耐受性moDCs（图2B）。添加LPS以诱导未成熟moDCs成熟为成熟moDCs（图2C），并用LPS刺激耐受性moDCs以验证其抵抗成熟的能力（图2D）。本研究所用血液样本均来自已签署知情同意书的健康供者。
moDC 表型鉴定
通过流式细胞术进行表面标志物表征
DC表面标志物分析显示，与LPS处理的耐受性moDC、耐受性moDC及未成熟moDC相比，成熟moDC表达的成熟标志物HLA-DR、CD83和CD86水平最高（图3）。这些结果表明，在LPS刺激后，耐受性moDC相较于未成熟moDC对成熟具有抵抗性。此外，LPS处理的耐受性moDC和耐受性moDC相较于未成熟和成熟moDC，CD14、BDCA3（CD141）及免疫球蛋白样转录物（ILT）3的表达水平升高。本研究中所生成的耐受性moDC与既往报道一致23。
moDCs 的功能表征
诱导成熟的moDCs具有免疫原性，并释放促进CD4+ T细胞增殖的细胞因子。我们通过检测共培养T细胞的增殖情况，评估了不同moDC亚型的免疫原性。与成熟moDCs相比，耐受性moDCs免疫原性较弱，表现为CD4+ T细胞的同种增殖反应较低（图4A）。耐受性moDCs在与CD4+ T细胞进行同种反应共培养时，其特征是干扰素-γ（IFN-γ）和IL-12p40分泌水平低，而IL-10分泌水平高（图4B）。此外，在成熟moDCs与同种特异性CD4+ T细胞的共培养体系中，增加耐受性moDCs的数量，可提高CD25high Foxp3+ 调节性T细胞的频率（图4C）。
线粒体活性分析
Red CMXRos 用于反映线粒体活性，以分析 moDCs 中的线粒体膜电位水平。与其它分化的 moDC 亚型相比，耐受性 moDCs 表现出更高的线粒体活性（图 5A）。接下来，使用生物分析仪评估不同 moDC 亚型的线粒体氧消耗率（OCR）。OCR 测量可提供高分辨率的代谢特征信息，包括但不限于基础呼吸、备用呼吸能力、质子泄漏和非线粒体呼吸。OCR 的测定为评估细胞应对压力的能力提供了手段。通过依次添加三种不同的化合物，对细胞代谢进行扰动。第一次注射为寡霉素（ATP 偶联剂），可抑制电子传递链（ETC）的复合物 V，从而抑制 ATP 合成。此步骤可区分用于 ATP 合成的耗氧比例与用于克服线粒体内膜质子泄漏的耗氧比例。第二次注射为 FCCP（ETC 加速剂），其通过将氢离子跨线粒体膜运输（而非经由复合物 V 的质子通道）来破坏 ATP 合成。线粒体膜电位的崩溃导致能量和氧气被迅速消耗，但不生成 ATP。FCCP 处理可用于计算细胞的备用呼吸能力。在应激条件下维持备用呼吸能力对细胞存活至关重要。该能力由多种因素决定，包括底物的可利用性以及参与 ETC 的酶的功能状态。第三次注射为鱼藤酮（复合物 I 抑制剂）和抗霉素 A（复合物 III 抑制剂）的组合。该组合可关闭线粒体呼吸，导致因线粒体功能受损而观察到 OCR 下降（图 5C）。耐受性 moDCs 的基础 OCR 水平高于成熟 moDCs（图 5D）。此外，耐受性 moDCs、LPS 耐受性 moDCs 和未成熟 moDCs 的备用呼吸能力均高于成熟 moDCs（图 5E）。
moDCs 的代谢表征
由于乳酸和质子在糖酵解过程中从细胞中释放出来，我们通过实时分析细胞外酸化率（ECAR）来评估moDCs的糖酵解活性（图6B）。在存在葡萄糖的情况下，所有moDCs的糖酵解速率均较基础状态升高，其中成熟moDCs的糖酵解速率高于未成熟moDCs（图6D）。与LPS处理的moDCs相比，耐受性moDCs和未成熟moDCs表现出更高的最大糖酵解水平（在葡萄糖存在下由寡霉素诱导）（图6B）。耐受性moDCs和未成熟moDCs的糖酵解能力高于成熟moDCs（图6E）。与它们较高的糖酵解速率相反，成熟moDCs的糖酵解储备最低（图6F）。
<img alt="使用离心和磁珠柱进行血液分层和CD14细胞分离的示意图。" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：外周血单核细胞的纯化。 (A) 每50 ml离心管中，将25 ml血液小心地铺在15 ml Ficoll液面上，随后进行离心。经密度梯度离心后，外周血单个核细胞（PBMCs）富集于血浆层下方的界面层。 (B) 将PBMCs与连接有单克隆人CD14抗体（亚型：小鼠IgG2a）的微珠共同孵育，然后加载到置于分离器磁场中的分离柱上，以分离CD14+单核细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="moDC 分化阶段的显微镜图像：未成熟、耐受性、成熟、LPS-耐受性。" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：moDCs 的形态学表征。（A） 在第 0、4 和 6 天向纯化的 CD14+ 单核细胞中添加 200 ng/ml 的 GM-CSF 和 IL-4，以生成未成熟 moDCs；（B） 在第 5 天额外使用 100 nM 维生素 D3 和 10 nM 地塞米松刺激，生成耐受性 moDCs。在第 6 天，使用 1 µg/ml LPS 刺激未成熟 moDCs 和耐受性 moDCs，以生成 （C） 成熟 moDCs 和 （D） LPS-耐受性 moDCs。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD11c、CD14、BDCA3、ILT3 的流式细胞术直方图；免疫表型分析。" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3：通过流式细胞术进行表面标志物表征。 耐受性（绿色）、LPS诱导的耐受性（黑色）、未成熟（红色）和成熟（蓝色）单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）中表面标志物HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD11c、CD14、BDCA3和ILT3的表达水平。同型对照以灰色显示。每种细胞类型的直方图分别绘制，Y轴为细胞数量，X轴为荧光强度的对数，并进行叠加。所有直方图均代表四次独立实验的结果。此图已根据《免疫学杂志》（J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316，2015年6月1日）修改。经版权方许可复制和再版。版权所有 © 2015 美国免疫学家协会（The American Association of Immunologists, Inc.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<img alt="CD4+ 细胞增殖与 moDCs 的关系；图示免疫应答差异（A-D）；免疫学分析。" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：moDCs的功能表征。（A） CD4异体增殖频率的定量分析+ 与数量递增的耐受性（TOL；绿色）、LPS耐受性（L-TOL；黑色）、未成熟（IMM；红色）和成熟（MAT；蓝色）单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）共培养后诱导的T细胞。数据来自四项独立实验；均值 + 标准误（S.E.M.）。所有moDC组与成熟moDC组之间的统计学差异通过双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验进行分析。 （B） IFN-γ（左图）、IL-12p40（中图）和IL-10（右图）在CD4同种反应上清液中的细胞因子分析+ 与不同数量的耐受性（绿色）、未成熟（红色）或成熟（蓝色）单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）共培养的T细胞。数据来自六次独立实验；均值 ± 标准误（S.E.M.） （C） CD4+ T细胞异源增殖及调节性T细胞扩增受成熟moDC共培养诱导，并随耐受性moDC数量增加而变化。左侧Y轴，CD4+ T细胞增殖。右侧Y轴，CD25频率高 Foxp3+ 细胞门控于增殖性 CD4+ T细胞。数据来自三次独立实验；以均值±标准误表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较事后检验，分析耐受性moDCs存在与缺失之间的统计学差异。 (D) CD4+ T细胞同种增殖（左）及在成熟moDC数量递增条件下与耐受性moDC共培养诱导的CD25highFoxP3+细胞频率（右）。数据来自2至3次独立实验；均值±标准误。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Dunnett多重比较事后检验，分析成熟moDC存在与不存在组间的统计学差异。该图已根据原文修改 J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (2015年6月1日)。经版权许可复制并重新发表。 版权所有 2015。美国免疫学家协会，有限公司 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞呼吸分析；柱状图与折线图，OCR 数据，呼吸能力，药物抑制效应。" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：moDCs 线粒体活性的分析。（A） 通过流式细胞术分析获得 moDCs 中线粒体膜电位（Red CMXRos）水平。数据来自四项独立实验的合并结果。均值 ± 标准误（S.E.M）。（B） 实时线粒体呼吸的示意图。OCR 分析从基础呼吸开始，依次加入寡霉素（复合体 V 抑制剂）、FCCP（最大呼吸诱导剂）和鱼藤酮/抗霉素 A 混合物（电子传递链 [ETC] 抑制剂）后的变化。线粒体备用呼吸容量（SRC，即最大呼吸减去基础呼吸）由 OCR 曲线得出。（C） 使用依次添加寡霉素（Olig）、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A（Rot-AA）的方法，对耐受性（TOL，绿色）、LPS 耐受性（L-TOL，黑色）、未成熟（IMM，红色）和成熟（MAT，蓝色）moDCs 的线粒体 OCR（pmol/min）进行的代表性动力学研究。（D） moDCs 基础呼吸的 OCR 定量分析，以及 （E） moDCs 的备用呼吸容量。数据来自五项独立实验的合并结果。均值 ± 标准误（S.E.M）。本图改编自 J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316（2015 年 6 月 1 日）。经版权许可复制和再版。版权所有 2015。美国免疫学家协会（The American Association of Immunologists, Inc.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<img alt="细胞外酸化率分析；ECAR 图表；糖酵解速率、能力、储备比较。" src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 
图 6：moDCs 的代谢特征分析。（A） 实时糖酵解示意图。ECAR 分析始于基础 ECAR，其中细胞在无葡萄糖培养基中孵育，随后依次加入葡萄糖（诱导糖酵解）、寡霉素（诱导细胞最大糖酵解并抑制复合体 V）以及 2-脱氧-D-葡萄糖（抑制糖酵解）。糖酵解速率（糖酵解诱导值减去基础 ECAR）、糖酵解能力（最大糖酵解值减去基础 ECAR）和糖酵解储备（最大糖酵解值减去糖酵解诱导值）均从 ECAR 曲线中得出。（B） 通过依次添加葡萄糖（Gluc）、寡霉素（Olig）和 2-DG，对耐受性（TOL，绿色）、LPS 耐受性（L-TOL，黑色）、未成熟（IMM，红色）和成熟（MAT，蓝色）moDCs 进行糖酵解依赖性 ECAR（mpH/min）的代表性动力学研究。（C） 柱状图显示 moDCs 的基础 ECAR 水平，（D） 糖酵解速率，（E） 糖酵解能力，以及 （F） 糖酵解储备。数据来自三次独立实验；均值 ± 标准误差（SEM）。统计学差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验进行分析。此图改编自 J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316（2015 年 6 月 1 日）。经版权许可复制和再版。版权所有 2015。美国免疫学家协会（The American Association of Immunologists, Inc.） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外 具有不同代谢表型的耐受性与成熟moDCs。

免疫反应源于抗原非特异性的固有免疫系统与抗原特异性的适应性免疫系统之间复杂的相互作用。

本实验方案的总体目标是从单核细胞诱导生成耐受性成熟树突状细胞，用于实验研究或疫苗开发。该方法可通过提供研究树突状细胞发育、成熟及抗原呈递过程的模型，帮助解答免疫学领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于能够在体外高效诱导产生大量树突状细胞用于实验研究。开始单核细胞富集：将20微升先前制备的外周血单个核细胞（PBMC）悬液与20微升台盼蓝混合，使用细胞计数仪计数活细胞数量。随后，离心细胞悬液。彻底吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于80微升染色缓冲液中，使细胞浓度为10的7次方个细胞。每10的7次方个细胞中加入20微升CD-4微珠。充分混匀，并在4摄氏度下孵育细胞15分钟。每10的7次方个细胞用1毫升染色缓冲液洗涤细胞，然后离心细胞。完全吸除上清液，并重悬细胞沉淀。对于最多 2 × 10⁸ 个总细胞，获取一个中等大小的柱子，并将其置于分离器的磁场中。接着，用 500 µL 染色缓冲液冲洗柱子。用移液器将细胞悬液加入柱中，并收集流穿柱子的未标记细胞至一个15毫升离心管中。在柱子下方更换一个新的15毫升离心管，用500微升染色缓冲液洗涤柱子三次。每次洗涤之间，确保柱子的储液腔在加入新的染色缓冲液前已完全排空。从分离器上取下色谱柱，置于新的15毫升离心管上。用移液器将1毫升染色缓冲液加入色谱柱中，并立即用力推动柱塞，将磁标记的细胞快速冲洗出来。然后，将流出组分转移至新的色谱柱，重复磁性分离步骤，以提高CD14阳性细胞的纯度。将四组CD14阳性单核细胞以每毫升细胞培养基含0.3至0.5 × 10⁶个细胞的浓度接种于6孔板中，并加入IL-4。将细胞置于37°C、含5% CO₂的组织培养孵箱中孵育。第4天，从培养物中移除850 µL培养基，并进行离心。吸弃上清液，并将沉淀重悬于一毫升细胞培养基中。将细胞混合物重新加入培养物中。在第五天，向其中两组培养物中每升培养基加入一微升维生素D3储备液和一微升地塞米松储备液，以生成耐受性单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）。第6天，向所有组中加入200纳克/毫升的GMCSF和200纳克/毫升的IL-4。向其中一组仅用GMCSF和IL-4处理的细胞中加入1微克/毫升的LPS，以生成成熟的moDCs。向一组耐受性moDCs中加入1微克/毫升的LPS，以生成LPS诱导的耐受性moDCs。最后，在第7天，用PVS EDTA冲洗培养皿以收获不同类型的moDCs。未成熟moDCs的制备方法是在第0、4和6天向纯化的CD14阳性单核细胞中添加GM-CSF和IL-4。在添加GM-CSF和IL-4之后，再加入维生素D3和地塞米松，可诱导未成熟moDCs分化为耐受性moDCs。加入LPS以诱导未成熟moDCs向成熟moDCs的分化。同时，用LPS刺激耐受性moDCs以验证其对成熟过程的抵抗能力。对DC表面标志物的分析显示，成熟moDCs表达最高水平的成熟标志物HLA-DR、CD80、CD83和CD86。相反，与未成熟和成熟 moDCs 相比，耐受性 moDCs 表现出 CD14、BDCA3 和免疫球蛋白样转录本的表达水平升高。使用红色 CMXRos 标记以反映线粒体活性，发现耐受性 moDCs 的线粒体活性高于其他分化的 moDC 亚型。该技术建立后，为免疫学领域的研究人员探索树突状细胞的代谢特征以开发疫苗和免疫疗法奠定了基础。

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免疫学与感染

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本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。...

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

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从单核细胞生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞

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免疫调节药剂对树突状细胞与CD4+ T细胞相互作用的影响

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。...

用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

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小鼠骨髓来源的GM-CSF诱导类肺泡巨噬细胞和树突状细胞的生成与鉴定

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。...

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

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小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外...

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本文介绍了一种独特的综合性方案，可通过唾液酸酶处理，从分离的外周血单个核细胞（PBMCs）制备去唾液酸化的人单核细胞来源树突状细胞（mo-DCs）。此外，还描述了对mo-DCs进行表型和功能特征分析的方法，并评估唾液酸酶处理如何提高mo-DCs成熟水平的实验流程。...

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一种简单高效的人CD14+单核细胞诱导耐受性树突状细胞以筛选免疫调节剂的方法

学习从单核细胞生成耐受性和成熟树突状细胞的方法，用于免疫学研究和疫苗开发。该技术可高效体外制备大量树突状细胞，并分析其代谢特征与表面标志物表达。

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