用于患者组织的甲基化结合DNA捕获测序

该技术的总体目标是对大规模患者队列中的全基因组DNA甲基化图谱进行系统性研究。该方法有助于回答表观遗传学领域的关键问题，特别是关于DNA甲基化图谱中哪些区域在患者中发生失调的问题。该技术的主要优势在于能够以经济高效的方式对大量患者进行分析。

该技术对患者的治疗和诊断具有积极意义，因为我们不仅可以研究已有的生物标志物，还能发现新的生物标志物。尽管该方法可为患者队列研究提供洞见，也可应用于其他系统，例如来源于小鼠样本的培养细胞系来源细胞中的DNA甲基化。本实验操作将由本实验室技术员Joseph Liu先生与Ya-Ting Hsu博士共同演示。

测序部分将由我们测序核心实验室的技术员Dawn Garcia女士演示。根据文本方案从肿瘤或正常组织中分离基因组DNA后，将1.2微克总基因组DNA加入96微升TE缓冲液和24微升5倍结合洗涤缓冲液中，配制成120微升溶液。将DNA溶液超声处理30秒，然后静置30秒。

重复超声处理，共计20至25次。根据制造商说明书，使用商业高灵敏度DNA试剂盒在生物分析仪系统上检测1微升超声处理后的DNA溶液，以检查片段大小，片段长度应在150至350个碱基对范围内。

进行单次洗脱时，通过将低盐缓冲液和高盐缓冲液按1:1比例混合配制洗脱缓冲液。取200 µL洗脱缓冲液重悬甲基结合DNA或MBD磁珠，并在旋转混合器上孵育3分钟。孵育结束后，将离心管置于磁力架上静置1分钟，然后小心吸取上清液，注意移液枪头不要接触磁珠，将液体转移至新的无DNase的1.5 mL微量离心管中。

将该样品置于冰上保存。对第二个样品重复洗脱步骤，并将其收集到与第一个样品相同的离心管中。向每个未捕获的洗涤液和稀释组分中加入1 µL糖原、十分之一体积的3 M乙酸钠（pH 5.2）以及两倍样品体积的100%乙醇。

充分混匀溶液后，在负80摄氏度下孵育至少2小时。然后在4摄氏度、11,363 ×g 条件下离心反应物15分钟。小心弃去上清液，勿扰动沉淀，加入500 µL预冷的70%乙醇。

重复乙醇洗涤前再次离心管。将沉淀在空气中干燥5分钟。然后用无DNase的水或缓冲液重悬沉淀。

根据文本方案，确认DNA总量超过20纳克。随后将DNA置于冰上，或保存于负20摄氏度，待后续使用。进行DNA测序文库构建时，使用全自动文库构建系统，并遵循制造商提供的标准方案。

选择长度为 200 至 400 个碱基对的 DNA 片段用于文库构建。DNA 测序文库制备完成后，终止反应，并使用荧光定量系统对 DNA 测序文库进行定量。设置 PCR 扩增反应时，在 PCR 管中加入 15 微升 DNA 测序文库、25 微升 PCR 主混合液、2 微升 PCR 引物混合液以及 8 微升水。

使用文本方案中概述的程序，并根据PCR混合液制造商的建议进行必要的调整。进行足够数量的循环，以产生2至10毫摩尔的文库DNA。PCR反应结束后进行纯化，对每个样本进行条形码标记，并将四个样本合并至流动池的一个通道中。

采用我们的测序标准 50 碱基单端读长方案。按照文本方案进行生物信息学分析。利用 MBD 捕获技术，旨在鉴定在肿瘤组织与正常组织中差异甲基化的不同基因组区域中的 CpG 岛。本研究发现，在位于基因启动子区域的所有 CpG 岛中，与正常组织相比，有 19.5% 在肿瘤中表现出差异甲基化。

同样，所研究的基因内CpG岛中有55.2%显示出差异甲基化。基因内启动子区域中有28.1%显示出差异甲基化，而对于不含CpG岛的基因启动子，有1.8%显示出差异甲基化。该热图清晰地展示了77个乳腺肿瘤、10个乳腺正常组织以及38个乳腺癌细胞系中差异甲基化的区域。

在此图中，对子宫内膜癌两个亚组（非复发组与复发组）的两名患者，在已鉴定靶基因 SFRP1 的启动子 CpG 岛的不同 CpG 位点处的甲基化水平进行了定量分析。若操作熟练，该技术可在正确实施的情况下于四到五天内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要首先检测待测基因组DNA的质量。按照本方法操作后，还可进一步采用其他技术（如焦磷酸测序）来回答一些问题，例如：在已鉴定出的差异富集区域中，具体是哪些CpG位点发生了改变？该技术自建立以来，为表观遗传学领域的研究人员探索大规模患者队列中的DNA甲基化提供了重要途径。

观看本视频后，您应能充分了解如何利用MBD捕获测序技术对患者样本中的全基因组DNA甲基化进行研究。请牢记，从FFPE组织等样本中提取高质量DNA有时较为困难，因此在进行实验操作时，始终需要对基因组DNA的质量进行恰当评估。