Name: 为患者组织甲基结合DNA序列捕获 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 了解MBDCap-seq技术用于大规模患者队列的全基因组DNA甲基化分析。该方法可识别差异甲基化区域并发现新型生物标志物，为临床诊断和治疗提供表观遗传学依据。

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本工作由CPRIT研究培训奖RP140105资助，并部分获得美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM114142基金以及William & Ella Owens医学研究基金会的资助。

所有组织均在获得机构审查委员会批准且所有参与者同意进行分子分析和随访研究后获取。该方案已获圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心人类研究委员会批准。
1. 甲基化DNA结合捕获（MBDCap）
<ol>
	<li>样本收集与DNA提取
	<ol>
		<li>从患者石蜡包埋组织样本中收集大量肿瘤或正常组织样本。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用商业化的DNA小量提取试剂盒从石蜡包埋组织样本中提取基因组DNA。</li>
		<li>使用甲基化DNA富集试剂盒，并按照此处描述的步骤及制造商说明书进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>初始磁珠洗涤 
	注意：磁珠用于偶联MBD-生物素蛋白，该蛋白可检测基因组上的DNA甲基化。磁珠通常悬浮于储存液中。请使用以下步骤去除该液体。
	<ol>
		<li>通过轻轻吹打使链霉亲和素磁珠（见材料表）重悬，获得均匀的悬浮液。切勿使用涡旋振荡器混匀磁珠。</li>
		<li>每1 µg输入DNA，向管中加入10 µL磁珠和90 µL的1x结合/洗涤缓冲液，旋转混匀1分钟。切勿使用涡旋振荡器混匀。</li>
		<li>将管子置于磁力架上静置1分钟。</li>
		<li>用移液器吸去液体并弃去。</li>
		<li>向磁珠中加入250 µL的1x结合/洗涤缓冲液，旋转混匀1分钟。</li>
		<li>重复步骤1.2.3至1.2.5两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将MBD-生物素蛋白偶联至磁珠
	<ol>
		<li>对于1.2 µg输入DNA，每管加入7 µL（3.5 µg）MBD-生物素蛋白。</li>
		<li>加入93 µL的1x结合/洗涤缓冲液至蛋白溶液中，使终体积为100 µL。</li>
		<li>在室温&#160;下于旋转混合仪上混合磁珠-蛋白混合物1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>片段化DNA（输入）
	<ol>
		<li>将1.2 µg总基因组DNA加入96 µL TE&#160;缓冲液和24 µL 5x结合/洗涤缓冲液中，配制成120 µL溶液，进行超声处理。超声过程中采用30秒&#160;开启、30秒&#160;关闭的循环模式，重复20–25次。</li>
		<li>使用商业高灵敏度DNA试剂盒，在生物分析系统上运行1 µL超声处理后的DNA溶液，根据制造商说明书检测片段大小是否在150–350 bp范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤MBD磁珠
	<ol>
		<li>将含有MBD磁珠的管子置于磁力架上静置1分钟。</li>
		<li>用移液器吸去液体并弃去，注意不要触碰磁珠。</li>
		<li>用250 µL的1x结合/洗涤缓冲液重悬磁珠。</li>
		<li>在室温下于旋转混合仪上混匀磁珠5分钟。</li>
		<li>重复步骤1.5.1至1.5.4两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>片段化DNA捕获反应（1 µg输入DNA）
	<ol>
		<li>将DNA/缓冲液混合物转移至含有MBD磁珠的管中。</li>
		<li>在室温下于旋转混合仪上将MBD磁珠与DNA混合1小时&#160;。也可选择在4&#160;oC过夜混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除未被捕获的DNA
	<ol>
		<li>DNA与MBD磁珠混合后，将管子置于磁力架上静置1分钟，使所有磁珠聚集于管壁内侧。</li>
		<li>用移液器吸去上清液，并将其保存至洁净无DNase的微量离心管中作为非甲基化DNA。将此样品置于冰上保存。</li>
		<li>向磁珠中加入200 µL的1x结合/洗涤缓冲液以洗涤磁珠。</li>
		<li>在旋转混合仪上混匀磁珠3分钟。</li>
		<li>将管子置于磁力架上静置1分钟。</li>
		<li>用移液器吸去液体，并将其保存至微量离心管中。</li>
		<li>对于输入DNA ≤1 µg的捕获反应，重复步骤1.7.3至1.7.6，共进行两次额外的洗涤，总计获得三个洗涤组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单次洗脱组分收集
	<ol>
		<li>将低盐缓冲液与高盐缓冲液按1:1比例混合，制备洗脱缓冲液（1,000 mM NaCl）。</li>
		<li>用200 µL洗脱缓冲液（1,000 mM NaCl）重悬磁珠。</li>
		<li>在旋转混合仪上孵育磁珠3分钟。</li>
		<li>将管子置于磁力架上静置1分钟。</li>
		<li>保持管子在磁力架上，用移液器小心吸出液体，避免枪头接触磁珠，将液体收集至洁净无DNase的1.5 mL微量离心管中。将此样品置于冰上保存。</li>
		<li>重复步骤1.8.1至1.8.4一次，将第二次收集的样品加入同一管中（总体积为400 µL）。将合并后的样品置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乙醇沉淀（DNA纯化）
	<ol>
		<li>向前述步骤中获得的每个未捕获组分、洗涤组分和洗脱组分中，分别加入1 µL甘油原（20 µg/µL，试剂盒提供）、1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）（例如，每400 µL样品加40 µL）以及2倍体积的100%乙醇（例如，每400 µL样品加800 µL）。总体积为1,241 µL。</li>
		<li>充分混匀后，在-80&#160;oC孵育至少2小时。</li>
		<li>在4&#160;oC条件下，以11,363 x g离心15分钟。</li>
		<li>小心弃去上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>加入500 µL预冷的70%乙醇。</li>
		<li>在4&#160;oC条件下，以11,363 x g离心5分钟。</li>
		<li>小心弃去上清液，避免扰动沉淀。</li>
		<li>重复步骤1.9.6至1.9.7一次，并彻底去除残留的上清液。</li>
		<li>将沉淀在空气中干燥约5分钟。切勿完全干燥沉淀。</li>
		<li>用37.5 µL无DNase水或其他适当体积的缓冲液重悬DNA沉淀。</li>
		<li>将DNA置于冰上，或于-20&#160;oC或更低温度保存，以备后续使用。</li>
		<li>检测总DNA量是否超过20 ng（例如，使用荧光定量系统，见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 测序
<ol>
	<li>使用从MBDCap步骤中回收的DNA片段进行测序。每个待测序样本需要20&#160;- 40 ng的DNA总量用于文库构建。</li>
	<li>采用全自动文库构建系统（参见材料表）进行DNA-seq文库制备，并遵循制造商提供的标准操作流程。选择大小为200 - 400 bp的DNA片段用于文库构建。自动化文库制备系统有助于标准化文库构建流程，并最大限度减少因手工操作带来的样本间差异。</li>
	<li>使用接头引物并稀释至100倍浓度，每份样本取10 µL使用。</li>
	<li>完成步骤2.2后，取出反应产物，使用荧光定量系统对DNA-seq文库进行定量（参见材料表）。
	<ol>
		<li>设置PCR扩增程序。选择PCR预混液以提高基因组GC富集区域的PCR扩增效率。在PCR管中加入15 µL DNA-seq文库、25 µL PCR预混液（参见材料表）、2 µL PCR引物混合液（参见材料表）以及8 µL H2O。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据PCR预混液制造商推荐的PCR条件，针对不同起始材料调整循环次数和温度：98&#160;oC预变性45 s，X个循环（98&#160;oC变性15 s、65&#160;oC退火30 s、72&#160;oC延伸30 s），最后72&#160;oC延伸1 min，然后在4&#160;oC保存。
	<ol>
		<li>进行足够循环数以获得终浓度为2 -&#160;10 nM的文库DNA（通常为8 - 10个循环）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明书，使用1:1比例的PCR纯化磁珠对PCR反应产物进行纯化（参见材料表）。</li>
	<li>用20 - 30 µL洗脱缓冲液洗脱纯化产物。</li>
	<li>对每个样本进行条形码标记，并将4个样本混合后上样至流动池的一个通道中。采用标准的50 bp单端读长测序方案进行测序（参见材料表）。</li>
</ol>
3. 生物信息学分析
注意：对测序获得的原始 fastq 文件进行后续处理，以执行质量控制并将短 DNA 序列（reads）比对到基因组。
<ol>
	<li>使用Bowtie短序列比对工具对每个样本的fastq文件进行基因组比对，将测序读段比对至参考基因组。该步骤可采用多种读段比对工具完成，可根据个人偏好选择使用。
	<ol>
		<li>比对至参考基因组时，允许全长序列读段最多有 2 个错配；每条读段报告最多 20 个最佳比对结果。例如，使用 bowtie -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 &#60;ebwt&#62;&#60;fastq文件&#62;&#60;比对文件&#62;.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 LONUT9 用于恢复多重比对的测序读段，以提高富集区域的检测灵敏度。对于每条读段，若其与上述任一已识别峰足够接近，则最多恢复一个比对结果。例如，使用命令：perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 &#60;比对文件&#62;&#60;输出路径&#62;. LONUT 将执行以下步骤。
	<ol>
		<li>将比对结果拆分为唯一比对上的读段和多重比对上的读段，使用峰值识别工具BELT对唯一比对上的读段进行峰值 calling11示例命令中的选项 -w 250 和 -p 99 用于 BELT。</li>
		<li>将唯一比对的 reads 与通过 LONUT 恢复的 reads 合并，合并后的 reads 以 BED 格式用于后续分析。计算合并后 reads 的数量，用于后续标准化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将测序读段分箱。使用 Perl 脚本提取目标区域的读段：perl methyPipeline.pl &#60;样本信息文件&#62;&#60;refGene文件&#62; -上 &#60;上游延伸长度&#62; -脱氧核糖核酸&#60;下游延伸长度&#62;对于 sampleInfoFile 中列出的每个 bed 文件，perl 脚本将执行以下任务。 
	注：参见补充编码文件中的 Perl 脚本。
	<ol>
		<li>将读段按固定大小的窗口进行分组， 例如，100 bp，适用于24条染色体。</li>
		<li>对于 refGeneFile 中指定的每个基因，提取转录起始位点（TSS）周围的 bins，延伸长度由选项 -up 和 -dn 指定。例如，提取 TSS 上游和下游 4 kb 区域内的数据。在 bin 大小为 100 bp 时，该提取的数据包含 81 个 bins，其中中心 bin 对应 TSS。</li>
		<li>对于位于反义链上的基因，使用 Perl 脚本将提取的区域从左到右翻转，以确保上游区域始终位于左侧。</li>
		<li>进一步分割转录起始位点 &#177;将4 kb区域分为三个子区域：左侧（上游4 kb至上游2 kb）、中间（上下游各2 kb）、右侧（下游2 kb至4 kb）。</li>
		<li>对每个样本，将各区间内的读段计数除以步骤 3.3.3 中计算得到的总比对读段数。该标准化处理可消除样本间读段数量的特异性差异，从而实现不同样本间读段数据的比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行 bash 脚本（如脚本文件中所示），对从左侧区域获得的标准化 reads 进行统计检验，以检测在 flank 区域所描述的区域内正常组与病例组之间的差异甲基化。 
	注：参见补充代码文件中的 bash 脚本。根据差异甲基化区域，共有七种组合： 
	全基因区域：转录起始位点上下游的差异甲基化 &#177;4 kb 区域 
	中左：中部和左区均存在差异甲基化 
	中右：中部和右侧区域的差异甲基化 
	侧翼区域：左右两侧区域的差异甲基化 
	左侧：仅左侧区域存在差异甲基化 
	右侧：仅在右侧区域存在差异甲基化 
	中部：仅在中间区域存在差异甲基化</li>
	<li>使用相同的 bash 脚本在龙卷风图中可视化差异甲基化。将高甲基化和低甲基化基因分别绘制在不同的面板上，并按照 3.4 节中所述的区域组合顺序分别进行排序。</li>
</ol>

<ol><li>Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+a+perspective+on+the+role+of+DNA+methylation+in+acquired+endocrine%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine.</a> Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).</li>
<li>Nair, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methyl-DNA+immunoprecipitation+%28MeDIP%29+and+methyl-CpG+binding+domain+%28MBD%29+protein+capture+for+genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveal+CpG+sequence+coverage+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias.</a> Epigenetics. 6, 34-44 (2011).</li>
<li>Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Methods in DNA methylation profiling.</a> Epigenomics. 1, 331-345 (2009).</li>
<li>Clark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+whole+genome+approach+of+MeDIP-seq+to+the+targeted+approach+of+the+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip%28%28R%29%29+for+methylome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling.</a> PLoS One. 7, e50233(2012).</li>
<li>Walker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling%3A+comparison+of+genome-wide+sequencing+methods+and+the+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip.</a> Epigenomics. , 1-16 (2015).</li>
<li>Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+DNA+methylomes+from+microarray+to+genome-scale+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Technol.+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing.</a> Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).</li>
<li>Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD-isolated+Genome+Sequencing+provides+a+high-throughput+and+comprehensive+survey+of+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).</li>
<li>Brinkman, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+DNA+methylation+profiling+using+MethylCap-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq.</a> Methods. 52, 232-236 (2010).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LOcating+non-unique+matched+tags+%28LONUT%29+to+improve+the+detection+of+the+enriched+regions+for+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data.</a> PLoS One. 8, e67788(2013).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMS%3A+a+web-based+system+for+visualization+and+analysis+of+genome-wide+methylation+data+of+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers.</a> PLoS One. 8, e60980(2013).</li>
<li>Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W-ChIPeaks%3A+a+comprehensive+web+application+tool+for+processing+ChIP-chip+and+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data.</a> Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).</li>
<li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveals+estrogen-mediated+epigenetic+repression+of+metallothionein-1+gene+cluster+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer.</a> Clin. Epigenetics. 7, 13(2015).</li>
<li>Hsu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+hypomethylation+of+EpCAM-regulated+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+recurrent+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).</li>
<li>Wang, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Distal+and+Genic+Methylation+in+the+Development+of+Prostate+Tumorigenesis+Revealed+by+Genome-wide+DNA+Methylation+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis.</a> Sci. Rep. , (2015).</li>
<li>Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+profiling+of+DNA+modifications%3A+cytosine+methylation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond.</a> Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).</li>
<li>Riebler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BayMeth%3A+improved+DNA+methylation+quantification+for+affinity+capture+sequencing+data+using+a+flexible+Bayesian+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach.</a> Genome Biol. 15, R35(2014).</li>
</ol>

本方案由圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心的 Tim Huang 博士和 Victor Jin 博士实验室开发。

MBDCap-seq 技术是一种亲和富集方法3，当研究包含大量患者的队列时，被视为一种具有成本效益的替代方案15本流程从样本获取到数据分析与解释提供了一套全面的方法。其中最重要的步骤之一是建立PCR扩增程序，以提高基因组中GC富集区域的PCR扩增效率，因为DNA甲基化主要发生于这些区域。此外，测序后必须确保每个样本至少有超过2000万条唯一比对到基因组的序列读长。该测序深度足以实现对全基因组的充分富集或覆盖。12如果在第一轮测序中某个样本未达到此覆盖度，且第一部分中该样本仍有可用的DNA，则可在第二部分中进行另一轮测序。将所得的测序读段与第一轮测序的读段合并，以达到所需的覆盖度。整体实验设计应包含一些生物学对照（例如， 正常组织）以校正基于偏倚的&#160;拷贝数变异等因素15.
我们采用生物信息学方法分析患者样本中观察到的DNA甲基化，以鉴定在核心启动子区、启动子岸区以及这些区域各种组合中表现出差异甲基化富集的潜在靶基因。尽管MBD捕获测序（MBDCap-seq）的分辨率最多只能达到约100 bp，但如本方案所述，将这些区域区分为核心区和岸区，有助于我们识别...

通过DNA甲基化对基因进行表观遗传调控是机体内不同类型组织稳定分化、决定细胞命运所必需的关键机制之一1。该过程的失调已被证实可导致包括癌症在内的多种疾病2。
该过程主要涉及在 DNA 的 CpG 二核苷酸中胞嘧啶残基上添加甲基基团3。目前已有多种不同的技术用于研究这一机制，每种技术各有其优势，已在多项研究中有所阐述2-8。本文将介绍其中一种称为甲基结合 DNA 捕获&#160;测序（MBDCap-seq）的技术，该技术利用亲和富集方法来鉴定 DNA 中的甲基化区域。该方法基于 MBD2 蛋白对甲基化 DNA 的结合能力，富集含有甲基化 CpG 位点的基因组 DNA 片段。我们采用一种 commercially available 甲基化 DNA 富集试剂盒来分离这些甲基化区域。本实验室已利用该技术筛查了数百份患者样本，本文提供了一套全面优化的实验方案，可用于大规模患者队列的研究。
与任何新一代测序技术一样，MBDCap-seq 也需要特定的生物信息学方法，才能准确量化各样本间的甲基化水平。近年来已有许多研究致力于优化测序数据的标准化和分析流程9,10。在本方案中，我们展示其中一种方法，该方法采用一种独特的读段回收策略——LONUT——随后对每个样本进行线性标准化，从而实现对大量患者样本间的无偏比较。

<table><tbody><tr><td>Methylminer DNA 富集试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>112-05D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus 超声破碎仪</td><td>diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>3 M 乙酸钠，pH 5.2</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>SPRIworks 片段文库构建系统 I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A50100</td><td>全自动文库构建系统</td></tr><tr><td>接头引物</td><td>Bioo Scientific</td><td>514104</td><td>PCR 引物混合物</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>荧光定量系统</td></tr><tr><td>PCR 预混液</td><td>KAPA scientific</td><td>KK2621</td><td>PCR 预混液</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>PCR 纯化磁珠</td></tr><tr><td>EB 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 测序系统</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于患者组织的甲基化结合dna捕获测序

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

甲基化是DNA上一种重要的表观遗传修饰，对不同组织类型在稳定发育和分化过程中所需基因的精确调控起着关键作用。该过程的失调通常是癌症等多种疾病的显著特征。本文介绍了一种近期的测序技术——甲基化结合DNA捕获测序（MBDCap-seq），该技术可用于大规模患者队列中多种正常组织和病变组织的甲基化水平定量分析。我们详细描述了这一亲和富集方法的实验流程，并配套提供了用于实现最优定量的生物信息学分析流程。该技术已被应用于“一千甲基组计划”（Cancer Methylome System）中，完成了对多种癌症类型数百名患者的测序分析。

我们已采用MBDCap-seq技术研究了多种癌症类型（包括乳腺癌12、子宫内膜癌13、前列腺癌14和肝癌等）大量患者的DNA甲基化改变。本文展示了近期发表的乳腺癌研究中的部分结果12。在此研究中，我们采用全基因组测序方法，鉴定在肿瘤与正常组织之间不同基因组区域中差异甲基化的CpG岛。研究发现，在位于基因启动子区的总共13,081个CpG岛中，有19.5%在肿瘤中表现出与正常组织相比的差异甲基化。同样，在6,959个基因内CpG岛中，55.2%表现出差异甲基化。在4,847个基因间区启动子中，28.1%表现出差异甲基化；而在不含CpG岛的5,454个启动子区域中，仅有1.8%表现出差异DNA甲基化（图1A）。可视化图示（图1B）展示了上述区域的代表性示例。热图清晰地显示了77例乳腺肿瘤、10例乳腺正常组织和38株乳腺癌细胞系中甲基化区域的分布情况。如本文所述生物信息学分析流程中所述，对甲基化水平进行定量，使我们能够对这些患者样本进行多种统计学检验，以识别整个群体或亚群中具有显著差异的甲基化位点。该分析方法为我们提供了可验证的靶...

本文介绍了一种利用甲基结合DNA捕获测序技术（MBDCap-seq 或 MBD-seq）及后续生物信息学分析流程，在大规模临床患者筛查研究中进行全基因组DNA甲基化分析的实验方案。

用于患者组织的甲基化结合DNA捕获测序

甲基化是DNA上一种重要的表观遗传修饰，负责精确调控基因表达，以维持细胞功能的稳定……

该技术的总体目标是对大规模患者队列中的全基因组DNA甲基化图谱进行系统性研究。该方法有助于回答表观遗传学领域的关键问题，特别是关于DNA甲基化图谱中哪些区域在患者中发生失调的问题。该技术的主要优势在于能够以经济高效的方式对大量患者进行分析。该技术对患者的治疗和诊断具有积极意义，因为我们不仅可以研究已有的生物标志物，还能发现新的生物标志物。尽管该方法可为患者队列研究提供洞见，也可应用于其他系统，例如来源于小鼠样本的培养细胞系来源细胞中的DNA甲基化。本实验操作将由本实验室技术员Joseph Liu先生与Ya-Ting Hsu博士共同演示。测序部分将由我们测序核心实验室的技术员Dawn Garcia女士演示。根据文本方案从肿瘤或正常组织中分离基因组DNA后，将1.2微克总基因组DNA加入96微升TE缓冲液和24微升5倍结合洗涤缓冲液中，配制成120微升溶液。将DNA溶液超声处理30秒，然后静置30秒。重复超声处理，共计20至25次。根据制造商说明书，使用商业高灵敏度DNA试剂盒在生物分析仪系统上检测1微升超声处理后的DNA溶液，以检查片段大小，片段长度应在150至350个碱基对范围内。进行单次洗脱时，通过将低盐缓冲液和高盐缓冲液按1:1比例混合配制洗脱缓冲液。取200 µL洗脱缓冲液重悬甲基结合DNA或MBD磁珠，并在旋转混合器上孵育3分钟。孵育结束后，将离心管置于磁力架上静置1分钟，然后小心吸取上清液，注意移液枪头不要接触磁珠，将液体转移至新的无DNase的1.5 mL微量离心管中。将该样品置于冰上保存。对第二个样品重复洗脱步骤，并将其收集到与第一个样品相同的离心管中。向每个未捕获的洗涤液和稀释组分中加入1 µL糖原、十分之一体积的3 M乙酸钠（pH 5.2）以及两倍样品体积的100%乙醇。充分混匀溶液后，在负80摄氏度下孵育至少2小时。然后在4摄氏度、11,363 ×g 条件下离心反应物15分钟。小心弃去上清液，勿扰动沉淀，加入500 µL预冷的70%乙醇。重复乙醇洗涤前再次离心管。将沉淀在空气中干燥5分钟。然后用无DNase的水或缓冲液重悬沉淀。根据文本方案，确认DNA总量超过20纳克。随后将DNA置于冰上，或保存于负20摄氏度，待后续使用。进行DNA测序文库构建时，使用全自动文库构建系统，并遵循制造商提供的标准方案。选择长度为 200 至 400 个碱基对的 DNA 片段用于文库构建。DNA 测序文库制备完成后，终止反应，并使用荧光定量系统对 DNA 测序文库进行定量。设置 PCR 扩增反应时，在 PCR 管中加入 15 微升 DNA 测序文库、25 微升 PCR 主混合液、2 微升 PCR 引物混合液以及 8 微升水。使用文本方案中概述的程序，并根据PCR混合液制造商的建议进行必要的调整。进行足够数量的循环，以产生2至10毫摩尔的文库DNA。PCR反应

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

为患者组织甲基结合DNA序列捕获

本视频演示了甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的实验方案。MeDIP是一个为期两天的实验流程，利用对5-甲基胞嘧啶（anti-5...

甲基化DNA免疫沉淀

DNA甲基化分析的金标准是亚硫酸氢盐转化DNA的基因组测序。该方法利用了在酸性条件下，胞嘧啶对亚硫酸氢盐脱氨作用的敏感性高于5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的特性。在对目标基因组DNA进行PCR扩增后，可区分未甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。...

DNA甲基化：亚硫酸氢盐修饰与分析

本文展示了一种用于研究生命早期应激下DNA甲基化和基因表达变化的简化工作流程。从新生小鼠的母体分离开始，到离散脑组织的分离，我们提供了一种从脑组织穿孔样本中同时提取DNA和RNA的实验方案，以用于后续的亚硫酸氢盐测序和逆转录PCR分析。...

大脑中微小解剖限定区域的DNA甲基化与基因表达优化分析

本文描述了一种两步标记法，首先利用β-葡萄糖基转移酶（β-GT）将叠氮葡萄糖转移至5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），随后通过点击化学反应连接生物素接头，从而实现简便且不受密度影响的富集。该高效且特异的标记方法可实现5-hmC的低背景富集，并通过高通量测序进行表观基因组高通量作图。...

基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶的选择性捕获

本视频演示了对胃肠道癌样本基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰的实验步骤。该技术有助于研究基因甲基化模式与癌症发生之间关系，并明确其在致癌过程中的作用。...

基因组DNA的亚硫酸氢盐转化：一种研究胃肠道癌组织基因组DNA样本中DNA甲基化的方法

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序是一种基于限制性内切酶消化结合胞嘧啶亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化分析测序文库制备方法。该方案需要50...

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的DNA甲基化分析

亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的方法。该方法在下一代测序之前，结合亚硫酸氢盐转化与目标区域的PCR扩增，从而在单碱基水平上实现DNA甲基化的绝对定量。...

通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析

本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。...

利用基于甲基化CpG结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面DNA甲基化分析

本文描述了一种用于胃肠道癌症中全基因组DNA甲基化分析的实验方法。该方法适用于研究基因甲基化模式与胃肠道癌症发生过程中致癌因素之间关系的相关研究。...

胃肠道癌症中DNA甲基化的全基因组分析

本研究描述了利用微阵列技术获得的DNA甲基化数据的处理流程。该方案展示了从样本制备到数据分析的各个步骤。所有操作均进行了详细说明，视频中还演示了关键的操作步骤。...

DNA甲基化的样本制备到生物信息学分析：肥胖及相关性状研究的关联策略

在此，我们提出一种用于 体外...

体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

了解MBDCap-seq技术用于大规模患者队列的全基因组DNA甲基化分析。该方法可识别差异甲基化区域并发现新型生物标志物，为临床诊断和治疗提供表观遗传学依据。

用于患者组织的甲基化结合DNA捕获测序

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