为患者组织甲基结合DNA序列捕获
October 31st, 2016
在这里，我们提出了一个协议，调查使用甲基结合DNA测序捕获（MBDCap-SEQ或MBD-SEQ）技术以及随后的生物信息学分析管道的大规模临床病人的筛查研究全基因组DNA甲基化。
该技术的总体目标是系统地研究大型患者队列中的全基因组 DNA 甲基化景观。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，特别是关于患者 DNA 甲基化景观中的哪些区域失调。这种技术的主要优点是可以以具有成本效益的方式调查大量患者。
这项技术可以对患者的治疗和诊断产生积极影响，因为我们可以研究现有的生物标志物并识别新的生物标志物。虽然这种方法可以提供对患者队列的见解，但它也可以应用于其他系统，例如小鼠来源样品的培养细胞系来源的细胞中的 DNA 甲基化。与 Ya-Ting Hsu 博士一起演示此程序的将是我们实验室的技术员 Joseph Liu 先生。
测序部分将由我们测序核心的技术人员 Dawn Garcia 女士演示。根据文本方案从肿瘤或正常组织中分离基因组 DNA 后，将 1.2 μg 基因组总 DNA 添加到 96 μL TE 缓冲液和 24 μL 5X 结合洗涤缓冲液中，制成 120 μL 溶液。对 DNA 溶液进行超声处理 30 秒，然后静置 30 秒。
重复超声处理总共 20 到 25 次。根据制造商的方案，使用带有市售高灵敏度 DNA 试剂盒的生物分析仪系统运行 1 μL 超声处理的 DNA 溶液，以检查片段的大小。它们应在 150 到 350 个碱基对的范围内。
要进行单组分洗脱，请通过制备低盐缓冲液和高盐缓冲液的一对一溶液来制备洗脱缓冲液。使用 200 μL 洗脱缓冲液重悬甲基结合 DNA 或 MBD 微珠，并在旋转混合器上孵育悬浮液 3 分钟。孵育后，将试管放在磁力架上 1 分钟，然后小心地移液，不要让移液管的尖端接触磁珠，并将其转移到干净的不含 DNase 的 1.5 mL 微量离心管中。
将此样品储存在冰上。对第二个样品重复洗脱，并将其收集在与第一个样品相同的试管中。向每个未捕获的洗涤和稀释馏分中加入 1 微升糖原、3 摩尔乙酸钠体积的十分之一（pH 值为 5.2）和两个样品体积的 100% 乙醇。
将溶液充分混合后，在零下 80 摄氏度下孵育至少两个小时。然后将反应物在 11、363 倍 g 和 4 摄氏度下离心 15 分钟。小心丢弃上清液，不要干扰沉淀，并加入 500 微升冷的 70% 乙醇。
在重复乙醇洗涤之前，再次旋转试管。将颗粒风干 5 分钟。然后使用不含 DNase 的水或缓冲液重悬。
根据文本协议检查 DNA 的总量是否超过 20 ng。然后将 DNA 放在冰上或储存在零下 20 摄氏度直至进一步使用。对于 DNA 测序文库制备，使用全自动文库构建系统并遵循制造商提供的标准方案。
选择长度为 200 至 400 个碱基对的 DNA 片段进行文库制备。制备 DNA 测序文库后，去除反应物并使用荧光定量系统定量 DNA 测序文库。为了构建 PCR 扩增反应，在 PCR 管中加入 15 μL DNA 测序文库、25 μL PCR 预混液、2 μL PCR 引物混合物和 8 μL 水。
使用文本方案中概述的程序，根据 PCR 混合物制造商的建议进行必要的调整。进行足够的循环以产生 2 至 10 毫摩尔的文库 DNA。净化 PCR 反应后，为每个样品添加条形码，并将四个样品一起拉入流通池的一个泳道中。
使用我们测序的标准 50 碱基对单读长方案。根据文本协议进行生物信息学。使用 MBD 帽试图识别不同基因组区域中的 CpG 岛，这些岛在肿瘤中相对于正常组织进行差异甲基化，本研究显示，在位于基因启动子中的总 CpG 岛中，19.5% 在肿瘤中表现出与正常组织相比的差异甲基化。
同样，55.2% 的基因内 CpG 岛显示差异甲基化。基因内启动子显示 28.1%，对于没有 CpG 岛的基因启动子，1.8% 显示差异甲基化。该热图清楚地描绘了 77 种乳腺肿瘤、10 种乳腺正常组织和 38 种乳腺癌细胞系的差异甲基化区域。
在该图中，甲基化在两个子宫内膜癌亚组中进行定量，即非复发性与复发性，在已鉴定靶基因 SFRP1 的启动子 CpG 岛的不同 CpG 位点的两名患者中。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四到五天内完成。
在尝试此程序时，请务必记住首先测试正在测试的基因组 DNA 的质量。按照此程序，可以执行焦磷酸测序等其他方法，以回答以下问题：在已识别的差异富集区域（已改变）中，哪些确切的 CpG 是？开发后，这项技术为表观遗传学领域的研究人员探索大型患者队列中的 DNA 甲基化铺平了道路。
观看本视频后，您应该对如何使用 MBD 帽测序技术研究患者样本中的全基因组 DNA 甲基化有很好的了解。请记住这一点，有时很难从 FFP 和 DNA 样本等中捕捉到高质量的 DNA，因此当我们执行该程序时，总是对基因组 DNA 进行适当的评估。
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概述
本文介绍了一种使用MBDCap-seq技术研究大型临床患者群体基因组范围DNA甲基化的协议。该方法旨在揭示表观遗传景观及其对患者诊断和治疗的影响的关键见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 表观遗传学
- 基因组学
- 临床研究
背景
- DNA甲基化在基因调控中起着至关重要的作用。
- 了解甲基化模式可以揭示疾病的生物标志物。
- 大规模研究可以增强发现的统计效力。
- MBDCap-seq是一种分析DNA甲基化的成本效益高的方法。
研究目的
- 系统地研究患者群体中的DNA甲基化景观。
- 识别甲基化景观中的失调区域。
- 探索现有和新的治疗和诊断生物标志物。
使用的方法
- 甲基结合DNA捕获测序（MBDCap-seq）
- 生物信息学分析管道
- 应用于患者来源的样本和培养的细胞系
- 与实验室技术人员合作展示协议
主要结果
- 识别患者样本中的关键甲基化变化。
- 展示该方法对各种生物系统的适用性。
- 潜在发现临床用途的新生物标志物。
- 大规模表观遗传学研究的成本效益高的方法。
结论
- MBDCap-seq是理解临床环境中DNA甲基化的有价值工具。
- 该方法可以促进患者诊断和治疗的进展。
- 未来的研究可以扩展发现，探索其他生物学背景。
常见问题
Executive Industry Relevance
MBDCap-seq enables cost-effective, large-scale DNA methylation profiling in patient cohorts, supporting biomarker discovery and epigenetic target validation in oncology and other disease areas. The method provides quantitative methylation data that can inform target de-risking and translational biomarker strategies. Its application to hundreds of patient samples demonstrates utility for portfolio-relevant epigenetic screening and mechanistic insight generation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epigenetic dysregulation in disease-relevant tissues to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides genome-wide methylation data from patient samples to clarify pathway involvement and prioritize targets.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying differentially methylated regions associated with tumor phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative methylation readouts from CpG islands in promoters, intragenic regions, and non-CpG promoters for assay standardization.
- Operational Value: Delivers reproducible, scalable methylation profiling compatible with large cohort studies and biobank integration.
- Scientific Value: Enables preparation of validated epigenetic datasets for downstream screening and biomarker validation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase methylation findings to clinical relevance through patient-derived tissue analysis.
- Operational Value: Supports translational continuity by enabling methylation analysis across normal, tumor, and cell line models.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking methylation changes to disease subgroups (e.g., recurrent vs. non-recurrent endometrial cancer).
Pipeline & Workflow Integration
MBDCap-seq fits within the discovery-to-translational continuum by providing epigenetic profiling that informs target validation, assay readiness, and preclinical decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of epigenetic mechanisms in tumorigenesis and differentiation pathways.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible methylation outputs enabling reliable comparison across patient and model systems.
- Analytics: Generates differential methylation metrics (e.g., 19.5% of promoter CpG islands, 55.2% of intragenic islands) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects methylation changes in patient tissues to clinical phenotypes, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable epigenetic profiling capability applicable across cancer types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by revealing epigenetic alterations in disease tissues.
- Operational Value: Enables cost-effective, high-throughput methylation analysis of large patient cohorts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in epigenetic target selection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker discovery in methylation landscapes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and bioinformatics for protocol execution and data interpretation.
- Dependent on sonication, magnetic bead-based capture, and sequencing infrastructure for library preparation and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of DNA quality assessment, fragment size validation, and elution consistency.
- Requires adaptation considerations when applying to diverse sample types such as FFPE, cultured cells, or mouse-derived tissues.
- Practical limitation: Success depends on high-quality genomic DNA input, particularly from challenging clinical samples.
