用于患者组织的甲基化结合DNA捕获测序

该技术的总体目标是对大规模患者队列中的全基因组DNA甲基化图谱进行系统性研究。该方法有助于回答表观遗传学领域的关键问题，特别是关于DNA甲基化图谱中哪些区域在患者中发生失调的问题。该技术的主要优势在于能够以经济有效的方式对大量患者进行分析。

该技术可能对患者的治疗和诊断产生积极影响，因为它不仅能够研究已有的生物标志物，还能识别新的生物标志物。尽管该方法可为患者队列研究提供重要信息，也可应用于其他系统，例如来源于小鼠样本的培养细胞系来源细胞中的DNA甲基化。本实验操作将由本实验室技术员Joseph Liu先生与Ya-Ting Hsu博士共同演示。

测序部分将由我们测序核心实验室的技术员Dawn Garcia女士进行演示。根据文本方案，从肿瘤或正常组织中分离基因组DNA后，向其中加入1.2微克总基因组DNA、96微升TE缓冲液和24微升5倍结合洗涤缓冲液，配制成总体积为120微升的溶液。将DNA溶液超声处理30秒，随后静置30秒。

总共重复超声处理20至25次。使用商业高灵敏度DNA试剂盒，按照制造商的说明书，通过生物分析仪系统对1微升超声处理后的DNA溶液进行检测，以检查片段大小，片段长度应在150至350个碱基对范围内。

进行单次洗脱时，将低盐缓冲液与高盐缓冲液按1:1比例混合，配制洗脱缓冲液。取200 µL洗脱缓冲液重悬甲基结合DNA或MBD磁珠，于旋转混合仪上孵育3分钟。孵育结束后，将离心管置于磁力架上静置1分钟，随后小心吸取上清液，注意移液枪头勿接触磁珠，将液体转移至新的无DNase的1.5 mL微量离心管中。

将该样品置于冰上保存。对第二个样品重复洗脱步骤，并将其收集到与第一个样品相同的离心管中。向每个未捕获的洗涤液和稀释组分中加入1 µL糖原、十分之一体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）以及两倍样品体积的100%乙醇。

充分混匀溶液后，在负80摄氏度下孵育至少2小时。然后在4摄氏度、11,363 × g条件下离心反应物15分钟。小心弃去上清液，勿扰动沉淀，加入500 µL预冷的70%乙醇。

重复乙醇洗涤前，再次离心管子。将沉淀在空气中干燥5分钟，然后用无DNase的水或缓冲液重悬。

根据文本方案，确认DNA总量超过20纳克。随后将DNA置于冰上，或于负20摄氏度保存以待后续使用。进行DNA测序文库构建时，使用完全自动化的文库构建系统，并遵循制造商提供的标准操作流程。

选择长度为200至400个碱基对的DNA片段用于文库构建。DNA测序文库制备完成后，终止反应，并使用荧光定量系统对DNA测序文库进行定量。进行PCR扩增反应时，在PCR管中加入15 µL DNA测序文库、25 µL PCR预混液、2 µL PCR引物混合物以及8 µL水。

根据PCR试剂混合液生产商的建议，使用文本方案中概述的程序，并进行必要的调整。进行足够数量的循环，以产生2至10毫摩尔的文库DNA。PCR反应产物纯化后，对每个样本进行条形码标记，并将四个样本合并至流动池的一个通道中。

采用我们的测序标准50个碱基对的单端读长方案。按照文本方案进行生物信息学分析。利用MBD捕获技术，旨在鉴定在肿瘤组织与正常组织相比下不同基因组区域中差异甲基化的CpG岛。本研究发现，在位于基因启动子区域的所有CpG岛中，有19.5%在肿瘤中表现出与正常组织的差异甲基化。

类似地，在所研究的基因内CpG岛中，有55.2%表现出差异甲基化。基因内启动子区域中有28.1%表现出差异甲基化，而对于无CpG岛的基因启动子，仅有1.8%表现出差异甲基化。该热图清晰地展示了77例乳腺肿瘤、10例乳腺正常组织和38株乳腺癌细胞系中差异甲基化的区域。

在本图中，对子宫内膜癌的两个亚组（非复发组与复发组）中两名患者在已鉴定靶基因 SFRP1 的启动子区 CpG 岛不同 CpG 位点的甲基化水平进行了定量分析。若操作得当，掌握该技术后可在四到五天内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要首先检测待测基因组DNA的质量。完成该步骤后，可进一步采用焦磷酸测序等其他方法，以回答如下问题：在已鉴定出的差异富集区域中，哪些具体的CpG位点发生了改变？该技术自建立以来，为表观遗传学领域的研究人员探索大规模患者队列中的DNA甲基化提供了重要途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用MBD捕获测序技术对患者样本中的全基因组DNA甲基化进行研究。请牢记，有时从FFPE等组织或DNA样本中获取高质量的DNA可能较为困难，因此在进行实验操作时，始终需要对基因组DNA的质量进行恰当评估。