FRET成像的三维水凝胶
2016年8月1日
荧光共振能量转移（FRET）成像是用于实时细胞生物学的研究的强有力的工具。这里提出了在使用常规荧光显微镜生理三维（3D）水凝胶的微环境FRET显像细胞的方法。被描述为比例FRET探针产生在激活范围线性比例的分析。
该实验方法的总体目标是使用嵌入模拟自然组织的三维水凝胶中的细胞的 FRET 成像来实时研究细胞内信号传导。该方法可以帮助回答发育生物学、药理学和再生医学领域的关键问题，例如最佳生物材料的开发和工程 3D 微组织中的高通量药物筛选。该技术的主要优点是 FRET 可以使用常规的宽视场显微镜系统用于多种水凝胶类型的大量细胞。
在制造用于水凝胶铸造的模具并将培养的细胞悬浮在水凝胶溶液中后，根据文本方案，在组织培养罩中，使用无菌技术将含有前体的细胞添加到铸造模具中。在交联之前，将悬浮在水凝胶前体中的细胞居中离心，通过将细胞限制在单个焦平面上并最小化平面外信号来优化成像。接下来，要交联 PC 水凝胶，请使用 UVA 光源的曝光时间等于每平方厘米厚度 3.2 焦耳，以照射含有前体的细胞。
或者，使用较便宜的手持式牙科灯。避免过度暴露水凝胶，因为这会降低细胞活力。物理交联水凝胶则置于 37 摄氏度。
交联后，取出 PDMS 水凝胶铸模，并用先前制备的 PDMS 培养皿替换。使用无菌刮刀将 PDMS 向下压在玻璃杯上以使其粘附。将无酚、无血清培养基或化学成分明确的培养基添加到带有盖玻片的 PDMS 培养皿中创建的孔中，以保持水凝胶浸没。
将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。将装有水凝胶的 PDMS 培养皿固定在显微镜载物台上并将油涂在物镜上后，使用透射光找到至少 15 个细胞进行成像，并通过荧光成像验证转染。在显微镜软件中，通过在视野中心附近的几个单元格中进行选择来配置 FRET 图像通道的相机设置，并根据文本协议优化每个图像通道的曝光和增益。
选择靠近水凝胶中心、在相对平坦的照明场内、既不太亮也不太暗且 FRET 比率在 00 到 1.0 之间的细胞。然后，选择多个视野以获取至少 15 个转染细胞的图像。完成后关灯以限制曝光。
要配置延时图像采集的捕获速率，请输入捕获的周期。使用快速速率进行基线信号捕获，例如每个视场每 5 秒捕获一次，并对后续的长期信号动力学使用较慢的速率。选择 Run now（立即运行）以启动图像采集并捕获图像 5 分钟，以在指定视场处建立探针响应的基线。
图像采集 5 分钟后，移液加入所需的激动剂或拮抗剂，通过移液混合，然后继续成像。根据文本协议进行FRET校准后，在显微镜软件中选择背景感兴趣区域图标上的箭头，然后选择绘制椭圆背景感兴趣区域。在单元格附近的每个视野中绘制并指定一个感兴趣区域或 ROI，以定义背景水平。
确保选中 Keep Updating Background Offset，然后单击 Background Region of Interest 图标激活对背景感兴趣区域的查看。或者，选择感兴趣区域图标，并将感兴趣区域属性设置为 Use as Background Region of Interest （用作背景感兴趣区域） ，并且 Regions of interest （感兴趣区域） 在每个多点中都不同。使用感兴趣区域背景图标，选择 Subtract Background Using Region of Interest。
在弹出窗口中，在 Subtract Area of Interest （减去感兴趣的背景区域） 下，选择 Every Image（每个图像），然后在 Apply To（应用于）下选择 All Frames（所有帧）。对于每个视野，要使用受体发射通道和二进制遮罩定义单元周围的感兴趣区域，请使用菜单 Binary、Define Threshold，然后选择 Apply To Current Frame。然后，调整下限阈值以选择单元格。
接下来，如有必要，使用 Binary Close 函数填充二进制掩码中的孔。然后，使用 Region of Interest 图标选择 Copy Binary to Region of Interest，将二进制掩码保存为感兴趣区域。将后续视野的感兴趣区域追加到现有的感兴趣区域池中。
删除任何感兴趣的虚假区域。然后，右键单击 Regions of Interest 并检查它们的属性是否为 Use as Standard Region of Interest 和 Regions of Interest 在每个多点中都不同。感兴趣的单元格区域可以手绘，但必须注意去除杂散值。
该协议包含适用于平坦照明场外的细胞和没有平坦视野的显微镜的程序。凝胶化前水凝胶前体的离心使盖玻片附近一个焦平面上的细胞数量最大化。这最大限度地减少了背景噪声并提高了成像通量。
在这个 FRET 实验中，对于淬灭发射或 QE、FRET 比率的计算，单链二进制 ICUE1 探针只需要两张图像，其中激发和发射的 QE 等于 CFP CFP，激发和发射的受体发射等于 YFP YFP。选择了多个视场，其中多个单元位于均匀照明区域内，如图所示。从实验开始，使用阈值受体发射图像指定用于通道信号背景校正和细胞分析的 ROI。
此外，如此处所示，选择了表达足够探针的细胞。计算每像素的 QE 和敏化发射 FRET 比率以及每个细胞的平均 FRET 比率。计算 SE 比率的倒数，并将两个比率归一化。
在毛喉素刺激下，基于 QE 和 SE 的 Fret 比率都检测软骨细胞中环 AMP 活性的增加。物理交联和化学交联凝胶均显示 QE FRET 比率随时间增加，表明对添加毛喉素的环 AMP 信号反应增加。该程序可与其他显微镜技术（如 FRAP、flim Fret 以及 Fret 和各向异性测量）一起使用，以回答诸如不同微组织类型之间的通透性和细胞分离差异等问题。
由于交联是在 PDMS 附近淬火的，因此请务必记住为直径略大于水凝胶本身的光交联水凝胶设计模具。
概述
本文介绍了一种用于三维水凝胶微环境中细胞的Förster共振能量转移（FRET）成像的方法。该技术允许对细胞内信号进行实时研究，并可使用常规的荧光显微镜进行应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 发育生物学
- 药理学
背景
- FRET成像是研究细胞过程的有价值工具。
- 三维水凝胶可以模拟自然组织环境。
- 该方法能够对多个细胞进行高通量分析。
- 常规显微镜技术可用于该方法。
研究目的
- 实现对细胞内信号的实时观察。
- 促进再生医学生物材料的开发。
- 改善工程化微组织中的药物筛选过程。
使用的方法
- 制作水凝胶铸造模具。
- 将培养的细胞悬浮在水凝胶溶液中。
- 使用UVA光或牙科灯进行水凝胶交联。
- 配置FRET成像的显微镜设置。
主要结果
- 成功成像嵌入水凝胶中的细胞。
- 优化成像条件以最小化背景噪音。
- 建立FRET分析的基线信号。
- 有效使用感兴趣区域进行背景校正。
结论
- 该方法增强了在三维环境中研究细胞信号的能力。
- 它为各种生物学领域的未来研究提供了框架。
- 水凝胶中的FRET成像可以推动药物发现的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
FRET imaging in three-dimensional hydrogels enables real-time quantification of intracellular signaling within physiologically relevant microenvironments, directly addressing the limitations of traditional 2D assays. This capability enhances predictive confidence in early discovery and supports mechanistic de-risking for drug screening and biomaterial development. The method's compatibility with standard widefield microscopy and high-throughput workflows positions it as a scalable asset for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of intracellular signaling pathways in 3D, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling tissue-like environments for hypothesis testing.
- Improves predictive confidence by capturing context-dependent cellular responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening workflows.
- Supports assay standardization and reproducibility through ratiometric FRET quantification.
- Enables high-throughput imaging and analysis of multiple cells across hydrogel types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro signaling measurements with disease-relevant 3D microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by modeling tissue-specific responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing material-dependent signaling differences.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET imaging method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging the gap between in vitro assays and physiologically relevant models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D cellular contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in engineered microtissues.
- Analytics: Provides ratiometric FRET measurements and background-corrected outputs for robust data comparison.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo-like tissue responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various hydrogel systems and compatible with multiple microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by modeling relevant biology early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FRET probe design and quantitative imaging analysis.
- Needs access to widefield epifluorescence microscopy and compatible hydrogel fabrication tools.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data processing workflows.
- Adaptable across different hydrogel chemistries and cell types with protocol optimization.
- Throughput and imaging depth may be limited by hydrogel opacity and microscope configuration.
