Name: FRET成像的三维水凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习使用FRET成像技术对三维水凝胶中的细胞进行实时细胞内信号传导研究。该方法利用常规宽场显微镜系统，可应用于发育生物学、药理学和再生医学领域的高通量药物筛选。

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作者感谢匹兹堡大学牙医学院提供的经费支持、美国国立卫生研究院资助项目K01 AR062598以及资助号P30 DE030740。作者还感谢Jin Zhang博士提供ICUE1质粒，Wayne Rasband开发ImageJ软件，以及Michael Cammer提供ImageJ宏程序。

作者声明无利益冲突。

本研究展示了如何利用FRET成像技术在三维水凝胶中分析细胞信号传导。尽管先前的研究已报道了在水凝胶基底上接种细胞的FRET成像35-37、细胞外与水凝胶相互作用的FRET成像38，以及被困在水凝胶中分子的FRET成像39-41，但本文是首次描述基于FRET成像对嵌入三维水凝胶中的细胞进行细胞内分析的研究。该工作解决了将FRET成像从二维体系转移到三维体系时面临的若干实施问题。第一，FRET成像需要高数值孔径物镜以收集足够的发射信号，但这会限制景深。本研究通过离心使细胞轻微沉降，从而增加靠近玻璃表面焦平面内的细胞数量，以补偿这一限制。第二，三维水凝胶支架在成像过程中可能发生漂移，导致视野移动，增加分析难度。本研究中水凝胶被牢固结合在盖玻片上，确保其在整个实验过程中保持固定。第三，选择适合三维FRET成像的水凝胶组成至关重要，因为水凝胶可能阻碍细胞的可视化。本研究采用了透明性良好的PC-gel和TR-gel水凝胶。然而，通过离心将细胞聚集到靠近盖玻片的焦平面，也可用于对衍射更强的水凝胶中的细胞进行成像。水凝胶的选择取决于需要模拟的微环境条件，相关综述可参见文献42。第四，本研究采用了一种替代计算方法来计算单链ICUE1探针的FRET比值（即，EQE&#160; = QE/cAem），以减少分析所需的图像通道数量，从而最大限度地减少光漂白。每个细胞的平均FRET比值是通过计算细胞内各像素比值的平均值得出的，以避免低估真实的FRET比值。最后，本文还描述了线性比值分析方法以及计算单链二元探针激活比例的方法。
使用宽场显微镜进行成功的FRET实验有几个关键方面。在硬件方面，相机必须具有足够的灵敏度以分辨微小的信号变化，因此新型科学级CMOS相机和电子倍增CCD比传统CCD更适用。为了最佳地分析FRET比率的空间分布，相机的空间分辨率至少应达到物镜点扩散函数的两倍（奈奎斯特准则），这使得双视图系统在此任务中不太适用。更为关键的是为特定的FRET荧光对选择合适的曝光时间和图像采集速率，以最大程度减少荧光染料的光漂白。随着实验持续时间的增加，建议降低采集速率。使用快速滤光轮可提高采集速率和可用于分析的视野数量，同时避免双视图系统和转塔式滤光块带来的图像配准问题。非均匀的照明场会增加对来自样品自发荧光和相机系统噪声的背景荧光进行校正的复杂性。某些水凝胶，特别是含有胶原蛋白的水凝胶，具有强烈的自发荧光43,44。若不进行背景校正，FRET比率将被低估。本文采用一种简单的背景校正方法，依赖于相对平坦的照明场，该照明场通常可通过落射荧光照明在图像中心区域实现（图3B，步骤7.2）。因此，本方法将感兴趣细胞限制在该照明场范围内。此处描述的背景校正未考虑在二元探针检测波长下的细胞自发荧光。在这种情况下，应使用未标记细胞（无探针转染）在相同条件下成像，并进行背景扣除。也可使用标记与未标记细胞的混合样本，并选择其中的未标记细胞作为背景感兴趣区域（ROI）。其他可实现全图像视野细胞分析的方法包括使用阴影掩模、多个背景ROI，或不含细胞的相同样品，相关方案可应要求提供。
针对3D FRET成像，探针响应对水凝胶对分析物的通透性高度敏感（图6）。因此，应在不同实验处理之间比较相同的水凝胶区域，最好选择几何对称的位置，例如本文所用的支架中心附近。或者，可采用微流控腔室/生物反应器，以快速且均匀地将分析物溶液灌注到水凝胶中45。当水凝胶的自发荧光过高时，可能无法检测到FRET信号（信噪比过低）；此时应使用更薄的水凝胶或更换探针（采用不同的荧光团）。在光交联水凝胶中进行3D FRET成像时，建议使用最低限度的辐照剂量，并选择探针荧光团激发光谱范围之外的波长。可使用405 nm的可见光源配合LAP，以进一步减少潜在的细胞损伤31,46。然而，建议使用365 nm辐照配合LAP，因为这能最大程度减少探针漂白。365 nm位于CFP供体激发光谱的尾端，而405 nm则处于其激发峰顶。或者，也可允许探针表达恢复一天时间。使用双元探针可最大程度减少因供体与受体荧光团表达水平差异及分子扩散差异所引起的敏感性问题。非双元探针也可使用，但需采用SE而非QE成像，并额外校正激发与发射光谱的光谱串扰（见下文）。此外，FRET探针商业可及性低且设计复杂，可能构成技术障碍。成功实验最关键的要素仍然是对荧光信号进行恰当的校正与分析。
FRET比率的另一种计算方法被采用，除了减少光漂白外，还有其他几个原因。对于二元单链探针，通常报道的比率是供体激发下的受体发射（敏化发射，SE）与供体激发下的供体发射（淬灭发射，QE）之比。 即， FRET 比值 = SE/QE25,47,48. SE/QE相对于FRET效率的变化呈非线性关系21,22,47即，该比值与探针的内在FRET效率（Ei）呈指数型非线性关系(Donius, A. E., Taboas, J. M. 未发表的工作 (2015))，其中当Ei小于约15%时，该比值的线性关系最佳。SE/QE还会低估激活探针的比例（FAP， 即， 探针结合分析物的比例）。因此，对SE/QE的分析需要繁琐的平衡剂量反应研究及曲线拟合。幸运的是，SE或QE与在受体激发下受体发射（Aem）的比值相对于Ei和FAP呈线性关系。 即FRET 比值 SE/Aem 和 QE/Aem。SE/Aem 常用于二元探针，仅需终点校准（在探针无活性和完全活性状态下），但细胞基础信号的存在使得终点校准难以实现。为消除对终点校准的需求，可对 SE 进行校正（cSE），以校正供体与受体激发和发射光谱之间的光谱重叠（光谱渗漏），以及复合探针荧光团与显微成像系统的量子产率和光谱敏感性（QS）。基于 cSE 的校正后 SE FRET 比值定义了图像中每个像素内探针的观测 FRET 效率。 即， E东南&#160;= cSE/Aem。已有商用及免费软件可用于校正这些因素对SE的影响，建议读者参考Chen和Periasamy 2006年的研究，以获取相关方法的详细解释。50。然而，计算 E东南 每个时间点需要捕获三个图像通道（SE、QE、Aem）。因此，在本研究中，我们还采用了另一种FRET比率EQE&#160;= 1 - QE/cAem，该计算仅需采集两个图像通道（QE 和 Aem）。计算 EQE 仅需通过QS校正Aem即可（cAem = Aem ×&#160;QS）。QS = Dem/Aem 可通过校准样品的两张图像轻松估算，其中 Dem 是在受体漂白条件下对供体进行激发时的供体发射信号。任意时刻的 FAP 值均可通过比较 E 计算得出东南 或 EQE 探针的Ei值。
最终，FRET比率筛选（E东南&#160;= cSE/Aem&#160;与 EQE&#160;= QE/cAem）的计算应基于探针类型以及信号最佳的通道进行选择。上述两种方法均包含每帧图像的背景噪声校正，以校正随时间变化的自发荧光。这些方法假设Aem激发光不会重叠进入Dem激发光谱，这通常得益于探针设计和显微镜滤光片配置。单链探针可任选一种方法，选择依据为探针信号（亮度）相对于相机噪声以及SE和QE通道背景信号的最佳表现。对于本研究中使用的ICUE1探针及实验条件（细胞和水凝胶类型），SE通道的信号强于QE通道。双链探针则必须使用E方法。东南 由于供体和受体荧光团的非等摩尔分布。对于在结合分析物时FRET降低的探针（如ICUE1），FRET效率可被 &#34;倒置&#34; 在结合分析物时呈现出阳性信号变化，正如我们在本研究中通过 E 所示东南&#160;= 1 - cSE/Aem 或 EQE = QE/(Aem × QS)。
FAP 分析对 FRET 比值的正确校正以及 Ei 的估算较为敏感。Ei 可通过与 QS 相同的校准样品以及传统的终点法 FRET 效率检测进行估算，公式为 Ei = 1 - (QE/Dem)（先获取 QE 图像，随后对受体进行光漂白，再获取 Dem 图像）28，但必须注意尽量减少供体的意外漂白。我们描述了一种改进方法，其中基于经量子产率校正的Aem来估算Dem。 即，Ei = 1 - (QE/(Aem × QS))。或者可使用 Ei = cSE/Aem。在活细胞中估算 Ei 需要使所有探针均达到完全的 FRET。在实际操作中，探针很难实现完全的 FRET。&#160;例如 ICUE1，其在结合分析物后 FRET 信号降低。一种 体外 使用细胞裂解物和纯化分析物进行Ei的计算最为理想，但超出了本研究的范围。本文建议使用2′,5′-二脱氧腺苷以降低细胞内的cAMP水平。然而，也可基于信号基础水平推导出的Ei估计值来计算相对FAP。由于上述原因，多数研究通常报告FRET比值（如本研究所示），或基于终点校准的相对FAP，其中添加激动剂前的信号基础水平作为下限，而加入第二种可饱和信号的激动剂后的信号作为上限。福司柯林常被用作对照激动剂以达到cAMP信号的饱和。 alternatively，也可使用cAMP类似物，如8-溴代腺苷3',5'-环磷酸单酯。建议在实验结束时使用阳性对照，以识别不同实验处理之间信号通路可能发生的改变。
计算每个细胞的平均信号响应需要考虑多个因素。首先，应通过计算细胞内每个像素的FRET比率的平均值来获得平均FRET比率， 即，(∑(QE⁄cAem))／像素数量，而非细胞中平均QE与Aem的比值 即，(∑QE)⁄(∑cAem)。尽管后一种方法由于背景噪声较低而无需精细遮蔽，但它会显著低估真实的平均FRET比率。然而，基于像素的比率计算需要浮点运算，并对细胞区域进行精确的二值化遮蔽，以定义感兴趣区域（ROI），并避免将细胞外背景噪声产生的伪影比率纳入分析。为避免细胞形态带来的结果偏差，必须对整个细胞区域进行定量。根据细胞形态变化和迁移情况，遮蔽区域可能需要随时间重新定义。或者，也可使用大于细胞的ROI，但需设定排除标准，以剔除QE和Aem信号中远低于细胞水平且接近背景水平的像素比率。本文所述分析方法详述了本研究中用于FRET分析的基本步骤，无需依赖专用软件或插件。显微镜制造商及其他供应商为其显微镜软件提供附加模块，支持自动化的比率及FRET分析。同样，公共领域的ImageJ软件也提供多种用于颗粒和FRET分析的插件，例如RiFRET。其次，由于采用二维图像，基于像素的平均FRET比率会低估三维细胞结构的真实平均比率。二维信号代表了沿z轴方向的投影与平均。若无高速三维成像技术，无法实现活细胞中FRET比率三维空间分布的计算。例如，使用转盘共聚焦显微镜）。这一问题在二维和三维培养体系中均存在，但在三维培养中影响更为显著，因为更多的细胞结构位于焦平面之外。这对于定位于特定细胞结构的探针尤为关键，例如定位于质膜的EPAC1探针PM-ICUE。有关校正细胞厚度对比率计算影响的建议，请参见Spiering et al. 201324Aem 分布的分析可用于检测探针是否在细胞的某些区域积聚，并据此调整成像平面。这将有助于解释FRET比率的空间分布，并排除伪阳性结果。 例如，识别探针饱和（即， Aem 值较低的区域探针浓度也较低，可能出现探针饱和并导致较高的 FRET 比值。第三，不同实验组之间 FRET 基线水平的差异可能反映了转染效率、探针表达水平或基础信号活性的差异。 &#34;相对分析&#34; （步骤10.1.1）有助于消除FRET比率随时间可能存在的漂移。该步骤便于比较不同样本间反应相对幅度的差异，但会阻碍与参照样本（对照组曲线为一条水平直线）反应时间进程的比较。 &#34;绝对分析&#34; （步骤 10.1.2）有助于比较不同样本间的反应速率，但由于每条曲线被不同的常数缩放，因而不利于比较反应幅度。研究中常采用对基线进行线性回归的方法，以校正随时间变化的 FRET 比值漂移。
所述的三维FRET方法是一种有用且实用的技术，可用于制备负载细胞的三维水凝胶并进行延时成像，该方法也可适用于其他探针和成像模式。除单链二元探针外，其他FRET系统需要对基于强度的信号进行更复杂的校正，如上所述。或者，可采用FRET荧光寿命成像（FLIM-FRET）技术，通过检测探针供体荧光发射寿命的变化来计算FRET效率。与基于强度的FRET不同，FLIM-FRET对背景噪声、光谱串扰、量子效率以及探测器的光谱敏感性不敏感2。然而，FLIM系统价格昂贵、结构复杂且不常见，并且在使用具有单指数衰减且无FLIM跑偏现象的荧光团时效果最佳49。所述方法也可与更先进的显微镜平台结合使用（例如，FRET-TIRF、荧光各向异性以及光谱相关FRET）。将该方法应用于高速共聚焦显微镜和多光子显微镜的三维成像，将有助于分析信号响应的亚细胞分布，并提高信号分析的准确性。这种三维FRET方法将推动在模拟的三维细胞微环境中开展更深入的细胞生物学研究。因此，该方法可直接应用于药理学和再生医学领域的需求，包括研究细胞间信号传导以及在工程化水凝胶微组织中筛选药物反应。

细胞信号转导在药理学、组织工程和再生医学等多个领域中既复杂又具有重要意义。为了加深对细胞生物学的理解，并开发用于组织再生的优化材料，需要有效的研究工具。 Förster 共振能量转移（FRET）成像是一种关键工具，可实现对受体激活、分子构象及超分子相互作用的分析。例如，活细胞中蛋白质/DNA 复合物的形成）中的应用。FRET 是一种发生在荧光基团之间的非辐射能量转移1其效率与供体荧光团和受体荧光团之间距离的六次方成反比。因此，它可提供在纳米尺度（通常为1 - 10 nm）上两种不同分子之间或同一分子不同区域之间的空间距离信息。2供体和受体荧光基团可以是不同类型的分子（异源FRET），其中供体具有较高能量的发射（较短波长），也可以是相同类型的分子（同源FRET）。FRET成像可在固定细胞或活细胞中进行，但通常在缺乏高速共聚焦系统时，使用固定细胞以高空间分辨率成像分子相互作用。活细胞则用于研究那些因固定处理而受到抑制或改变的相互作用和生物学过程，例如细胞内实时信号转导响应。3.
采用FRET成像的活细胞研究部分由于二维（2D）细胞培养具有操作简便和背景信号较低（无来自焦平面外细胞的发射光）的优点而广泛使用。然而，与生理微环境和三维（3D）培养相比，2D培养会显著改变多种细胞过程4,5。例如，在2D培养中，细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的天然相互作用发生显著改变，导致细胞形态和极性出现明显变化6。膜微区（例如，小窝和脂筏）及受体信号传导受到培养环境的强烈调控，部分原因是这些结构可与细胞骨架组分结合7,8，而细胞形态和细胞骨架结构又受到空间培养环境的显著调控9。机械转导不仅受3D基质的影响，还受到3D环境中比2D培养更复杂的次级载荷条件的影响10。最后，一般而言，3D基质的通透性低于培养基，与2D培养相比，信号分子的扩散减少且结合增加。通过3D培养，可以构建并观察到在黏附性、化学性和机械性信号方面更接近生理状态的微环境。细胞间的相互作用得以促进，而黏附特性则可通过3D材料的结构、组成和构型（图案化）加以控制11-13。材料的力学特性同样可通过其组成和结构进行定制14,15。因此，在水凝胶中培养细胞使得对原代细胞进行FRET研究成为可能，否则这些细胞在传统技术下会发生去分化或表型改变，例如关节软骨来源的细胞。因此，亟需一种能够在活体3D培养中开展FRET检测的方法。
水凝胶支架是进行基于三维FRET研究的理想材料，因为它们可以制成光学透明的，并且能够定制以调控微环境并提供细胞信号。由天然聚合物制成的水凝胶已被用于细胞培养数十年，包括明胶和纤维蛋白16。通过对这些聚合物进行化学修饰或使用合成聚合物，可实现对细胞微环境更精确的调控17,18。通过改变水凝胶的聚合物组成和网络孔径（聚合物浓度和交联密度），可以调控其机械刚度和通透性19,20。此外，通过引入生长因子和细胞配体，可使水凝胶具备生物活性。由于这些优势，开发用于生物传感、药物递送和组织工程的水凝胶已成为一个非常活跃的研究领域21。水凝胶的三维打印技术也正在发展，用于构建微组织和微器官15。因此，在水凝胶中进行细胞的FRET成像不仅有助于模拟生理条件下的细胞行为，还可作为研究和优化工程化组织生长的有力工具。
二元比率FRET探针在研究细胞信号传导方面非常有用，也可应用于水凝胶培养。有关已发表的荧光和FRET探针的部分列表，请参见细胞迁移联盟网站22。最常见的探针类型包含两个不同的荧光团，它们通过一个或多个识别元件（即对分析物敏感的区域）相连或关联。当检测到分析物时（例如，离子或分子的结合、该区域的酶切作用），这些区域会发生构象变化、结合或解离，从而改变荧光团之间的距离，进而改变FRET强度（增强或减弱）23。另一种较少见但同样有用的探针类型依赖于分析物引起两个荧光团光谱重叠的变化，从而改变FRET强度。&#34;单链&#34;比率探针是在单个分子上连接一对荧光团。&#34;双链&#34;探针则将荧光团对分别置于不同的分子上，但它们的表达可由同一表达盒共同调控24。与单荧光团表达研究（例如，荧光融合蛋白）不同，使用比率FRET探针的研究无需进行共转染以校正转染效率或细胞活力。只要表达水平超过最低阈值，比率FRET探针对转染效率相对不敏感（浓度不敏感）23,25。只要两个荧光团对环境变化的响应相似，它们对激发光源波动及其他细胞内环境因素（例如，pH、离子）也不敏感。此外，其响应不受转录延迟的影响，这一点不同于荧光和生物发光启动子-报告基因构建体26,27。
比率型FRET探针在常规的宽场落射荧光显微镜系统中易于且频繁地使用。在活细胞成像中，宽场显微镜相较于线扫描共聚焦系统更受青睐，原因在于系统成本、荧光团漂白以及能否以足够的时间分辨率捕捉信号变化。此外，结合电动载物台和多视野图像采集，可在大量细胞中实现单细胞分析。宽场显微镜需要基于强度对异源FRET探针信号进行分析。尽管强度分析不像其他FRET方法那样需要复杂的硬件设备，但在数据采集后需进行更多校正工作，以消除荧光团行为及显微镜/成像系统配置所带来的影响。28荧光团捕获的发射光强度是激发能量、荧光团量子产率以及滤光片与相机/探测器光谱灵敏度和线性的函数。2这些参数在供体和受体之间可能不同，因此定量分析需要进行校准。此外，受体发射的成像会受到荧光团光谱重叠的影响（供体激发光对受体的激发，以及供体发射信号渗漏至受体发射光谱中）。2. &#34;单链&#34; 探针在纳米尺度上因其荧光基团为等摩尔浓度而进行内部归一化，而其他荧光基团的 &#34;双链&#34; 探针在细胞内的不同区域可能以不同的化学计量比存在25,28. 如果荧光染料的 &#34;单链&#34; 探针的亮度相似（消光系数和量子产率的函数），非线性探测器灵敏度的影响较小，只需校正背景荧光以及耦合的量子产率与探测器灵敏度即可23因此 &#34;单链&#34; 比例型FRET探针在宽场显微镜中最为容易实现24.
本文介绍了一种使用常规宽场落射荧光显微镜对三维水凝胶培养中的活细胞进行FRET成像的简便技术。该方法可被已在二维条件下开展FRET实验的实验室，以及关注微组织中细胞间信号传导的研究团队轻松采用。本文以光交联水凝胶（PC-gel，聚乙二醇二甲基丙烯酸酯）和温敏性水凝胶（TR-gel，Matrigel）中活软骨细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的FRET成像检测为例，展示了该方法的应用。实验采用基于EPAC1（ICUE1）的比率型FRET探针，检测在佛司可林（forskolin）刺激下cAMP水平的变化；佛司可林是一种腺苷酸环化酶的化学激动剂，可催化ATP转化为cAMP。cAMP是介导G蛋白偶联受体信号通路的主要第二信使之一，能够激活多种因子，包括由cAMP直接激活的下游交换蛋白（EPACs）。当cAMP结合至EPAC结构域时，荧光团之间的距离增大，导致FRET效率下降。本文详细描述了水凝胶材料的制备、使用ICUE1探针转染细胞，以及将细胞包埋于三维水凝胶中的过程。同时阐述了三维FRET实验的操作流程及用于评估单个细胞探针活性所需的图像分析方法。我们还讨论了利用宽场显微镜在二维和三维条件下进行FRET分析所固有的局限性。本文所述技术相较于现有的二维方法具有改进意义，因其可在更接近生理状态的环境中进行分析，且所需的图像校正与标定步骤更少。该方法具有广泛适用性，多种透明材料均可使用，同时可保持特定的细胞类型与转染偏好。

<table><tbody><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）[Sylgard 184 弹性体试剂盒]</td><td>Fisher Scientific（埃尔斯沃思胶粘剂）</td><td>NC0162601</td><td>试剂</td></tr><tr><td>聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM）</td><td>根据 Lin-Gibson 方法，使用 Sigma Aldrich 的 PEG 制备</td><td>95904</td><td>试剂</td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>试剂</td></tr><tr><td>3-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440167</td><td>试剂</td></tr><tr><td>二甲基苯基亚磷酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td>试剂</td></tr><tr><td>2,4,6-三甲基苯甲酰氯</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td>试剂</td></tr><tr><td>2-丁酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>试剂</td></tr><tr><td>溴化锂</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>试剂</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Sigmacote（硅化试剂）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td>试剂</td></tr><tr><td>甲苯&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td>试剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH3025601</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基，无酚红（无酚红且无血清培养基）</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>试剂</td></tr><tr><td>FuGENE HD 转染试剂（转染试剂）</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Cellstripper（细胞解离溶液）</td><td>康宁</td><td>25-056-CI</td><td>试剂</td></tr><tr><td>生长因子减少型基质胶，无酚</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>试剂</td></tr><tr><td>移液器吸头（10,200,1,000） &amp;mu;l)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>无粉检查手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>3 mm 活检打孔器</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>预包被玻璃盖玻片（环氧硅烷）</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>无菌离心管（15 ml，50 ml 锥形）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>细胞培养皿（6孔）</td><td>Falcon</td><td>351146</td><td>一次性实验器材</td></tr><tr><td>带电动载物台的落射荧光显微镜</td><td>尼康</td><td>MEA53100（Eclipse TiE 倒置）</td><td>大型/非一次性实验设备</td></tr><tr><td>可调式XY载物台样品夹</td><td>尼康</td><td>77011393</td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>60倍（1.3 数值孔径）物镜（CFI Plan Apochromat 60XH Lamda）</td><td>尼康</td><td>MRD01605</td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>CFP/YFP 光源及激发/发射滤光片支架（Lambda 光源） &amp;& 轮，Lambda 发射滤光片系统)</td><td>尼康（Sutter Instrument 代理商）</td><td>77016231, 77016088</td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>CYF/YFP滤光片组</td><td>尼康（Chroma技术公司）</td><td>77014928</td><td>非一次性实验器材</td></tr><tr><td>相机（ORCA Flash 4.0 v1）</td><td>尼康（滨松经销商）</td><td>77054076</td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>NIS-Elements 40.20.02 显微镜软件</td><td>尼康</td><td>MQS31100&amp;nbsp;</td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>Prism（电子表格与绘图软件）</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>版本 6</td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>OmniCure S1000 紫外点固化灯系统（配备 365 nm 滤光片）或其他光源&amp;lambda; = 365 或 405</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>大型/非一次性实验设备</td></tr><tr><td>移液器辅助器&amp;nbsp;</td><td>Drummond Scientific Co.&amp;nbsp;</td><td>DP-100</td><td>非一次性实验器材</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>豪泽科学</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>真空干燥器/脱气装置&amp;nbsp;</td><td>任何</td><td></td><td>大型/非一次性实验设备</td></tr><tr><td>组织培养罩&amp;nbsp;</td><td>任何</td><td></td><td>大型/非一次性实验设备</td></tr><tr><td>化学通风橱&amp;nbsp;</td><td>任何</td><td></td><td>大型/非一次性实验设备</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>任何</td><td></td><td>大型/非一次性实验设备</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>任何</td><td></td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>烧杯</td><td>任何</td><td></td><td>非一次性实验设备</td></tr><tr><td>培养箱&amp;nbsp;</td><td>任何</td><td></td><td>大型/非一次性实验设备</td></tr></tbody></table>

三维水凝胶中的fret成像

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Förster共振能量转移（FRET）&#160;成像是一种用于实时研究细胞生物学的有力工具。目前利用FRET的研究通常采用二维（2D）培养体系，但该体系无法模拟真实的三维（3D）细胞微环境。本文介绍了一种在3D水凝胶环境中，利用常规宽场落射荧光显微镜进行淬灭发射FRET成像的方法。文中描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，可在探针激活范围内获得线性比率结果。以软骨细胞为例，在佛司可林刺激下，使用EPAC1激活探针（ICUE1）检测细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的变化，并展示了该方法能够检测因水凝胶材料类型不同而导致的cAMP信号差异，所用水凝胶包括光交联水凝胶（PC-gel，聚乙二醇二甲基丙烯酸酯）和温敏性水凝胶（TR-gel）。与传统的2D FRET方法相比，本方法无需额外复杂的操作。已具备2D FRET成像能力的实验室可轻松采用该技术，开展在3D微环境中的细胞研究。该方法还可进一步应用于工程化3D微组织的高通量药物筛选。此外，该方法兼容其他形式的FRET成像技术，如各向异性测量和荧光寿命成像（FLIM），并适用于共聚焦、脉冲或调制照明等先进显微镜平台。

所有水凝胶前体、细胞和浇铸模具均按上述方法制备。将含细胞的前体溶液浇注至PDMS模具中，在凝胶化/光交联前进行离心，以使细胞固定在盖玻片附近，便于进行FRET成像分析（图1将带有盖玻片的水凝胶置于预先制备的PDMS成像孔中进行显微成像（图2）。然后将光学配置和图像采集参数设置如下所示 图 3A展示了CFP-YFP荧光团对所有四个FRET相关图像通道的采集（参见下文 &#34;光学共聚焦&#34; 在 图3），这对于非二进制探针是必需的。然而，在本研究中，单链二进制 ICUE1 探针仅需两幅图像即可计算量子效率（QE = &#34;CFP CFP&#34; 和 Aem = &#34;YFP YFP&#34; （激发发射）。在多个视野（xy位置）中选择若干细胞，这些细胞位于均匀照明区域内。图3B）。延时成像结束后，导出探针的信号数据。使用实验开始时经阈值处理的Aem图像，划定用于通道信号背景校正和细胞分析的感兴趣区域（ROIs）。图4）。从细胞库中筛选出表达量适中（不过低也不过高，即非过亮）探针的细胞图4B). 每次采集时，通过背景扣除后图像通道的浮点除法计算每个像素的QE和SE FRET比率。每个细胞的平均FRET比率（即， 每个 ROI 的信号）被计算，并相对于刺激前的基线信号进行归一化处理（即， 从所有时间点中减去基线后的回归分析，并以均值标准误（SEM）作为误差线进行绘制。基于QE和cSE的FRET比率均能检测到软骨细胞在佛司可林（100 nM）刺激下cAMP活性的升高， 图5）。由于包埋在水凝胶中的软骨细胞内cAMP活性的基础水平较低，导致QE信号较弱，因此QE FRET比率对背景校正比cSE FRET比率更敏感。两种水凝胶类型（TR-gel和PC-gel）的FRET比率均随时间逐渐升高（图6)，表明加入Forskolin后cAMP信号响应增强。根据QE FRET比率所示，PC-凝胶水凝胶中的软骨细胞表现出更大的cAMP变化（图示）以及更高的基础cAMP水平（EQE = 0.19 在 PC-凝胶中 与 EQE = 0.09，在TR凝胶中，基线相减图中未显示）。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> 
图1： 光交联水凝胶（PC-凝胶）中的细胞分布 
A：将含细胞的水凝胶前体进行离心，以使盖玻片附近焦平面上的细胞数量最大化。B：此方法可增加视野（FOV）中的细胞数量，并最大限度减少来自焦外细胞的背景信号。（比例尺 = 200 µm）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> 
图2：PDMS培养皿中的水凝胶 
将水凝胶置于较高的PDMS小室（体积为水凝胶的10倍）内，底部为盖玻片，用于显微成像和分析物刺激。PC-gel水凝胶呈透明状，并与盖玻片牢固结合，确保在整个检测过程中保持位置不变。通过使用更宽的活检打孔器以及更厚的PDMS片，可制备更大的PDMS小室，使其容纳的培养基体积比水凝胶体积多10倍。（比例尺 = 2 mm）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> 
图3： FRET成像的采集配置 
A：采集设置为每7秒在多个位置进行一次图像捕获。对于此处使用的ICUE1探针（二元单链探针）的QE FRET比率计算，仅需两个图像通道，QE = &#34;CFP CFP&#34; 和 Aem = &#34;YFP YFP&#34; （激发发射）下 &#34;光学显微镜&#34; 列中的&#160;&#955; 显微镜软件的标签。B：视野（FOVs）&#34;XY&#34; 选择多个细胞位于均匀照明区域内的位置。图像下方的图表显示了沿穿过视场中心的蓝色箭头线的照明强度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> 
图4：FRET成像分析中感兴趣区域（ROI）的选择 
A：选择无细胞区域作为感兴趣区域（ROI），用于校正每个通道的背景信号。如果细胞密度较高或细胞迁移明显，或者当细胞未处于均匀照明场中且未使用阴影校正掩模时，也可使用无细胞水凝胶的图像进行背景扣除。B：通过Aem通道的图像阈值分割和二值化掩模方法选择细胞的感兴趣区域。若所选ROI大于细胞实际范围，会因包含由背景噪声产生的胞外比值，从而对单个细胞的平均FRET比值计算产生不利影响。不推荐使用每个通道在单个细胞内的平均值来计算细胞FRET比值，因为该方法会低估实际比值。（比例尺 = 50 µm）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> 
图5：温敏性水凝胶（TR-gel）中FRET比率的比较 
基于QE和SE的FRET比率均可检测到在佛司可林刺激下软骨细胞内cAMP活性的升高。佛司可林是一种腺苷酸环化酶激动剂，可诱导cAMP的生成。当ICUE1探针结合cAMP时，FRET信号降低，因此QE FRET比率（EQE&#160; = sQE/(sAem × QS)）升高；相反，SE FRET比率下降，因此以ESE&#160; = 1 - cSE/sAem表示。在水凝胶包埋的软骨细胞中，由于基础cAMP活性较低导致QE信号较弱，QE FRET比率对背景校正的敏感性高于SE FRET比率。误差线表示标准误（SEM），n = 25。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> 
图6： 不同水凝胶中FRET比率的比较 
两种水凝胶中的软骨细胞在佛司可林刺激下均表现出cAMP活性增加，这通过随时间推移升高的QE FRET比率得以证实。水凝胶类型通过多种效应影响细胞反应，包括对佛司可林的通透性差异以及基础细胞cAMP活性的不同（EQE = 0.19 在 PC-凝胶中 与 EQE = 0.09（TR-凝胶，未显示）。误差线 = 标准误（SEM），TR-凝胶的n = 25，PC-凝胶的n = 15。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于实时细胞生物学研究的有力工具。本文介绍了一种利用常规落射荧光显微镜在生理性的三维（3D）水凝胶微环境中进行FRET成像细胞的方法。同时描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，该方法在激活范围内可产生线性比率结果。

三维水凝胶中的FRET成像

Förster共振能量转移（FRET）成像是一种用于实时检测细胞生物学过程的强有力工具。利用FRET的研究通常……

本实验方法的总体目标是通过FRET成像技术，对嵌入模拟天然组织的三维水凝胶中的细胞进行细胞内信号通路的实时研究。该方法有助于解答发育生物学、药理学和再生医学领域中的关键问题，例如优化生物材料的开发以及在工程化三维微组织中进行高通量药物筛选。该技术的主要优势在于，可利用常规的宽场显微镜系统，在多种类型的水凝胶中对大量细胞进行FRET检测。根据文本方案，在组织培养罩内，将含有细胞的前体溶液用无菌技术加入到用于水凝胶浇铸的模具中。在交联之前，对悬浮于水凝胶前体中的细胞进行离心，使细胞集中于单一焦平面，从而优化成像效果，并最大限度减少焦外信号。接下来，为交联PC水凝胶，使用UVA光源照射含细胞的前体，照射剂量为每毫米厚度每平方厘米3.2焦耳。或者使用价格较低的手持式牙科灯。避免过度暴露水凝胶，因为这会降低细胞活力。物理交联水凝胶则置于37摄氏度环境中。交联后，移除PDMS水凝胶铸造模具，并替换为先前制备的PDMS培养皿。使用无菌刮铲将PDMS压紧在玻璃表面以使其粘附。向PDMS培养皿中加入无酚无血清培养基或化学成分明确的培养基，覆盖盖玻片以形成培养孔，确保水凝胶完全浸没在培养基中。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。待含有水凝胶的 PDMS 培养皿固定在显微镜载物台上，并在物镜上滴加镜油后，使用透射光找到至少 15 个用于成像的细胞，并通过荧光成像验证转染效果。在显微镜软件中，从视野中心附近的几个细胞中选择，为 FRET 成像通道设置相机参数，并根据文本方案优化每个成像通道的曝光时间和增益。选择位于水凝胶中心附近、处于相对平坦的照明区域内且亮度适中的细胞，其FRET比率应在0.00至1.0之间。随后，选取多个视野，至少对15个转染细胞进行成像。完成操作后关闭光源，以减少光照暴露。为配置延时成像的采集速率，请输入采集周期。基线信号采集使用较快的速率，例如每个视野每 5 秒采集一次，后续长期信号动力学则使用较慢的速率。选择“立即运行”以开始图像采集，并持续采集 5 分钟，以建立指定视野下探针响应的基线。在完成五分钟的图像采集后，加入所需激动剂或拮抗剂，用移液器吹打混匀，并继续成像。根据正文方案完成FRET校准后，在显微镜软件中点击背景感兴趣区域图标的箭头，选择“绘制椭圆形背景感兴趣区域”。在每个视野中靠近细胞的位置绘制并指定一个感兴趣区域（ROI），用于定义背景水平。确保选中“保持更新背景偏移”选项，然后单击“背景感兴趣区域”图标以激活背景感兴趣区域的显示。或者，选择感兴趣区域图标，并将感兴趣区域属性设置为“用作背景感兴趣区域”，以及“每个多点位置的感兴趣区域不同”。使用感兴趣区域背景图标，选择“使用感兴趣区域减去背景”。在弹出窗口中，在“减去背景感兴趣区域”选项下选择“每幅图像”，在“应用范围”下选择“所有帧”。对于每个视野，使用受体发射通道和二值掩膜来定义细胞周围的感兴趣区域时，使用菜单“二值化”、“定义阈值”，并选择“应用于当前帧”。然后，调整下限阈值以选中细胞。接下来，如有必要，使用二值闭运算功能填充二值掩膜中的孔洞。然后，点击“感兴趣区域”图标，选择“将二值图像复制为感兴趣区域”，以将二值掩膜保存为感兴趣区域。将后续视野的感兴趣区域追加至已有的感兴趣区域集合中。删除所有无效的兴趣区域。然后，右键单击兴趣区域，检查其属性是否设置为“用作标准兴趣区域”以及“在每个多点位置中兴趣区域不同”。细胞兴趣区域可手动绘制，但必须注意去除无效值。该方案包含针对超出平面照明视野的细胞以及无平面视野显微镜的操作步骤。在凝胶化前对水凝胶前体进行离心，可使尽可能多的细胞集中于盖玻片附近的单一焦平面。这有助于最小化背景噪声并提高成像通量。在此FRET实验中，对于淬灭发射（QE）FRET比率的计算，仅需获取单链二元ICUE1探针的两幅图像，包括以CFP激发和CFP发射的信号（QE = CFP/CFP），以及以YFP激发和YFP发射的受体发射信号（acceptor emission = YFP/YFP）。选择多个视野，使每个视野中均包含位于均匀照明区域内的若干细胞，如图所示。使用实验开始时获得的受体发射图像（经阈值处理）来设定通道信号背景校正和细胞分析所用的感兴趣区域（ROIs）。此外，如图所示，选择表达足够探针的细胞。计算每个像素的量子效率（QE）和敏化发射FRET比率，以及每个细胞的平均FRET比率。计算敏化发射比率的倒数，并对两个比率进行归一化处理。在佛司可林刺激下，基于 QE 和 SE 的 FRET 比值均可检测到软骨细胞内环磷酸腺苷（cyclic AMP）活性的升高。随时间推移，物理交联和化学交联凝胶均显示出 QE FRET 比值的上升，表明环磷酸腺苷信号通路对佛司可林的添加产生了增强的响应。该方法可与其他显微技术（如荧光漂白恢复技术（FRAP）、荧光寿命 FRET（FLIM FRET）以及 FRET 与各向异性测量）联用，以回答诸如不同微组织类型之间通透性和细胞信号传导差异等问题。由于在PDMS附近交联反应会被淬灭，因此在设计光交联水凝胶的模具时，务必记住将模具的直径设计得比水凝胶本身略大一些。

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科研

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生物学

FRET成像的三维水凝胶

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