三维水凝胶中的FRET成像

本实验方法的总体目标是通过FRET成像技术，对嵌入模拟天然组织的三维水凝胶中的细胞进行细胞内信号通路的实时研究。该方法有助于解答发育生物学、药理学和再生医学领域中的关键问题，例如优化生物材料的开发以及在工程化三维微组织中进行高通量药物筛选。该技术的主要优势在于，可利用常规的宽场显微镜系统，在多种类型的水凝胶中对大量细胞进行FRET检测。

根据文本方案，在组织培养罩内，将含有细胞的前体溶液用无菌技术加入到用于水凝胶浇铸的模具中。在交联之前，对悬浮于水凝胶前体中的细胞进行离心，使细胞集中于单一焦平面，从而优化成像效果，并最大限度减少焦外信号。接下来，为交联PC水凝胶，使用UVA光源照射含细胞的前体，照射剂量为每毫米厚度每平方厘米3.2焦耳。

或者使用价格较低的手持式牙科灯。避免过度暴露水凝胶，因为这会降低细胞活力。物理交联水凝胶则置于37摄氏度环境中。

交联后，移除PDMS水凝胶铸造模具，并替换为先前制备的PDMS培养皿。使用无菌刮铲将PDMS压紧在玻璃表面以使其粘附。向PDMS培养皿中加入无酚无血清培养基或化学成分明确的培养基，覆盖盖玻片以形成培养孔，确保水凝胶完全浸没在培养基中。

将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。待含有水凝胶的 PDMS 培养皿固定在显微镜载物台上，并在物镜上滴加镜油后，使用透射光找到至少 15 个用于成像的细胞，并通过荧光成像验证转染效果。在显微镜软件中，从视野中心附近的几个细胞中选择，为 FRET 成像通道设置相机参数，并根据文本方案优化每个成像通道的曝光时间和增益。

选择位于水凝胶中心附近、处于相对平坦的照明区域内且亮度适中的细胞，其FRET比率应在0.00至1.0之间。随后，选取多个视野，至少对15个转染细胞进行成像。完成操作后关闭光源，以减少光照暴露。

为配置延时成像的采集速率，请输入采集周期。基线信号采集使用较快的速率，例如每个视野每 5 秒采集一次，后续长期信号动力学则使用较慢的速率。选择“立即运行”以开始图像采集，并持续采集 5 分钟，以建立指定视野下探针响应的基线。

在完成五分钟的图像采集后，加入所需激动剂或拮抗剂，用移液器吹打混匀，并继续成像。根据正文方案完成FRET校准后，在显微镜软件中点击背景感兴趣区域图标的箭头，选择“绘制椭圆形背景感兴趣区域”。在每个视野中靠近细胞的位置绘制并指定一个感兴趣区域（ROI），用于定义背景水平。

确保选中“保持更新背景偏移”选项，然后单击“背景感兴趣区域”图标以激活背景感兴趣区域的显示。或者，选择感兴趣区域图标，并将感兴趣区域属性设置为“用作背景感兴趣区域”，以及“每个多点位置的感兴趣区域不同”。使用感兴趣区域背景图标，选择“使用感兴趣区域减去背景”。

在弹出窗口中，在“减去背景感兴趣区域”选项下选择“每幅图像”，在“应用范围”下选择“所有帧”。对于每个视野，使用受体发射通道和二值掩膜来定义细胞周围的感兴趣区域时，使用菜单“二值化”、“定义阈值”，并选择“应用于当前帧”。然后，调整下限阈值以选中细胞。

接下来，如有必要，使用二值闭运算功能填充二值掩膜中的孔洞。然后，点击“感兴趣区域”图标，选择“将二值图像复制为感兴趣区域”，以将二值掩膜保存为感兴趣区域。将后续视野的感兴趣区域追加至已有的感兴趣区域集合中。

删除所有无效的兴趣区域。然后，右键单击兴趣区域，检查其属性是否设置为“用作标准兴趣区域”以及“在每个多点位置中兴趣区域不同”。细胞兴趣区域可手动绘制，但必须注意去除无效值。

该方案包含针对超出平面照明视野的细胞以及无平面视野显微镜的操作步骤。在凝胶化前对水凝胶前体进行离心，可使尽可能多的细胞集中于盖玻片附近的单一焦平面。这有助于最小化背景噪声并提高成像通量。

在此FRET实验中，对于淬灭发射（QE）FRET比率的计算，仅需获取单链二元ICUE1探针的两幅图像，包括以CFP激发和CFP发射的信号（QE = CFP/CFP），以及以YFP激发和YFP发射的受体发射信号（acceptor emission = YFP/YFP）。选择多个视野，使每个视野中均包含位于均匀照明区域内的若干细胞，如图所示。使用实验开始时获得的受体发射图像（经阈值处理）来设定通道信号背景校正和细胞分析所用的感兴趣区域（ROIs）。

此外，如图所示，选择表达足够探针的细胞。计算每个像素的量子效率（QE）和敏化发射FRET比率，以及每个细胞的平均FRET比率。计算敏化发射比率的倒数，并对两个比率进行归一化处理。

在佛司可林刺激下，基于 QE 和 SE 的 FRET 比值均可检测到软骨细胞内环磷酸腺苷（cyclic AMP）活性的升高。随时间推移，物理交联和化学交联凝胶均显示出 QE FRET 比值的上升，表明环磷酸腺苷信号通路对佛司可林的添加产生了增强的响应。该方法可与其他显微技术（如荧光漂白恢复技术（FRAP）、荧光寿命 FRET（FLIM FRET）以及 FRET 与各向异性测量）联用，以回答诸如不同微组织类型之间通透性和细胞信号传导差异等问题。

由于在PDMS附近交联反应会被淬灭，因此在设计光交联水凝胶的模具时，务必记住将模具的直径设计得比水凝胶本身略大一些。