用于研究与人类衰老相关疾病基因的转基因小鼠表型分析方案

本检测方案的总体目标是建立一系列简单测试，可作为初步表型分析流程，用于指导后续对行为表型以及组织结构与功能的深入研究。通过该流程可判断人类疾病的行为学和细胞表型是否在小鼠模型中得到重现。该技术的主要优势在于，即使在无相关实验经验的实验室中，无需大量投入即可开展这些测试，同时仍能为后续更深入的研究提供重要信息。

从出生后第4天至第10天，每天进行后肢功能测试，以评估后肢近端肌肉的力量、无力程度及疲劳情况。开始前，先让小鼠在测试区域适应30分钟。在此期间，准备一个新的500毫升锥形管，用70%乙醇冲洗干净，然后将一至两个棉球推入管底。

将该试管垂直固定以进行测试。未进行测试时，将幼崽与母鼠放在一起以维持其体温。经过半小时的适应后，从笼中取出一只幼崽并记录其体重。

然后轻轻抓住幼鼠的后肢，将其悬挂在试管边缘上方，使幼鼠朝向棉塞。记录幼鼠的拉拽尝试次数，并测量其坠落的潜伏期。等待30秒后，重复该测试。

第二次测试后，用记号笔标记幼鼠。然后用来自原笼的垫料轻轻擦拭幼鼠，并将其放回母鼠身边。由于较年长的P8幼鼠无法用记号笔标记，需通过剪趾进行标识。

在进行下一只幼鼠实验前，用70%乙醇擦拭试管。从出生后第19天至第21天每天进行断乳期观察试验，以评估小鼠的运动能力和总体活动水平。首先让小鼠在测试区域适应环境30分钟。

在幼崽适应环境的同时，准备实验区域。用2英寸见方的六乘六网格标记一个有机玻璃测试箱。使用前，用70%乙醇清洁测试箱。

然后放置摄像机，使整个箱子的侧面视图充满视野。标准化周围环境的外观，以避免引入新奇因素。测试前，将断奶幼鼠转移至干净的暂养杯中，并记录其体重。

然后开始视频录制。首先，拍摄一张测试识别卡，显示小鼠的编号、年龄以及当前日期。随后将小鼠从暂存杯转移至中心方格中。

持续三分钟，记录两只前爪共同跨越的线条数量。三分钟后，将小鼠放回清洁的笼子中，并结束视频录制。每次测试之间，用70%乙醇清洁盒子。

根据视频记录小鼠的直立行为次数，即小鼠用两只前爪完全离开支撑面直立站立的行为。同时记录理毛行为次数，即两只前爪均用于清洁时的行为。在出生后第22天至第26天期间的交替日进行抓力测试，以评估神经肌肉力量。

通常，让小鼠适应测试区域30分钟。测试装置为一个带金属丝网栅的聚甲基丙烯酸甲酯箱。使用70%乙醇清洁两者。

然后用一层气泡膜铺在盒子底部作为缓冲，并在气泡膜上覆盖纸张以吸收排泄物。接着将待测小鼠分开，分别装入独立的杯子中。现在，将第一只小鼠放置在金属丝网的中央，缓慢翻转金属丝网，使其倒置至距离盒子柔软表面10至20厘米的高度。

记录小鼠跌落的潜伏期，如果小鼠在60秒内未跌落，则在60秒时结束测试。随后将第一只小鼠放回饲养杯中。每次测试之间，用70%乙醇擦拭网格，并更换气泡膜上的纸张。

然后对组内的另外两只小鼠进行测试。每只小鼠测试一次后，重复该过程两次，使每只小鼠共进行三次试验。如果每组小鼠少于三只，需确保每次试验之间至少有五分钟的恢复时间。

进行NADH脱氢酶染色时，将新配制的NADH溶液与新配制的NBT溶液等体积混合。然后向每张载玻片加入一毫升染色液，将载玻片置于湿润容器中，在37摄氏度下孵育30分钟。进行琥珀酸脱氢酶染色时，配制含有0.1摩尔琥珀酸钠、1.25摩尔NBT和0.2摩尔磷酸缓冲液的溶液。

然后向每张载玻片加入一毫升溶液。将载玻片放入湿盒中，在37°C下孵育一小时。用染色剂孵育后，吸去染色液，并用蒸馏水洗涤载玻片三次。

然后将玻片依次浸入浓度递增和递减的丙酮溶液中进行洗涤。每种浓度的丙酮溶液均洗涤三次，每次两分钟。最后，用蒸馏水冲洗玻片三次。

然后使用水性封片剂封片。通过所述的一系列测试对不表达 HTRA2 的小鼠进行检测，并与同窝对照小鼠进行比较。在 P4 至 P6 期间，拉力次数或坠落潜伏期均未观察到变化。在 P7 至 P10 期间，发现神经肌肉力量有所下降。

在活动能力测试中，HTRA2基因敲除小鼠的活动能力下降。HTRA2基因敲除小鼠在金属丝网抓握测试中也表现出力量减弱。H和E染色显示，在P35时，HTRA2基因敲除小鼠的视网膜结构与对照组相比无明显变化。

最后，通过电子传递链复合体活性的组织化学染色来鉴定呼吸酶功能的变化。与对照组相比，HTRA2 基因敲除小鼠的染色强度降低，这种变化在小脑和纹状体中可见，但在皮层中未观察到。

观看本视频后，您应能够充分理解如何评估基因修饰小鼠的活动能力及神经肌肉力量，并掌握如何将这些研究与细胞轴实验相结合。感谢观看，祝您的实验顺利成功。