Name: 为记录细胞内电压响应电法果蝇光感受器和中间对光刺激在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习使用锐电极记录果蝇光感受器和视觉中间神经元的细胞内电压响应，以研究神经编码机制。该方法可在最小细胞损伤下获得高质量长期记录，适用于昆虫视觉信息处理研究。

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作者感谢Mick Swann、Chris Askham和Martin Gautrey在设计和制造实验装置的许多电气与机械部件过程中所做出的重要贡献。MJ目前的研究工作得到了生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC资助号：BB/M009564/1）、中国认知神经科学与学习国家重点实验室开放研究基金、中国高端外国专家资助项目、芬兰Jane和Aatos Erkko基金会资助以及Leverhulme信托基金（RPG-2012-567）的资助。

作者无任何利益冲突需要披露

我们介绍了如何使用锋利的传统微电极在完整的果蝇复眼中记录R1-R6感光细胞和LMC细胞的细胞内反应的基本关键步骤。在过去18年中，该方法已与定制的硬件和软件工具共同优化，以获得高质量且持久的记录，用于回答广泛的实验问题。通过投入时间和资源构建稳定而精确的实验装置，并制备出具有理想电学特性的微电极，高质量的记录便可成为任何从事黑腹果蝇（Drosophila）视觉神经生理学研究的实验室中的常规操作。尽管设计良好的记录系统和光刺激系统对于快速执行不同实验范式至关重要，但有三个操作步骤对成功记录尤为关键：（i）制备果蝇样本时尽量减少对复眼的损伤；（ii）拉制出具备合适电学特性的微电极；（iii）将记录电极插入复眼时避免损伤其尖端。最终，为了获得有意义的数据，研究人员必须理解电生理学的物理基础，以及如何为特定靶细胞类型制备合适的微电极。
因此，该技术的局限性主要取决于研究者的耐心、经验和技术水平。由于掌握该技术需要较长时间，尤其对于微小样本而言 果蝇 细胞，电生理学初学者最好先以较大的昆虫复眼（例如丽蝇）进行练习36 或蝗虫35使用相同的设备，一旦能够常规地对较大的光感受器和中间神经元进行高质量的细胞内记录，便可继续进行下一步 果蝇 眼睛。该技术的另一项局限在于细胞鉴定。穿透的 果蝇 细胞可通过电泳方式加载染料，包括 Lucifer yellow 或 neurobiotin。然而，由于微电极尖端尺寸较小，电泳效率较电阻较低的电极（如膜片钳电极）更低。此外，填充染料的微电极通常电学性能较差，使其在记录高质量电生理信号时更为困难 果蝇 光感受器和大运动前神经元（LMCs）。
有时会出现技术问题，表现为输入信号不稳定或完全缺失。这通常与电压信号持续漂移或超出放大器的记录范围（过高或过低）有关。大多数情况下，这种现象是由于记录电极被堵塞所致，或者电极尖端过细——电阻过高或管壁电容过大——无法有效传导快速的信号变化。尽管可以尝试通过“蜂鸣”电极电容的方式来疏通尖端，有时确实有效，但通常最有效的解决方法是直接更换记录电极。这可能还需要进一步调整微电极拉制仪的参数，以降低新电极的尖端电阻。在某些实验准备过程中，若使用石蜡油封闭角膜孔洞耗时过长，电极尖端也可能被堵塞。长时间暴露于空气中会使新暴露的视网膜组织干燥，其表层会变成类似胶状的物质。若发生这种情况，当将电极从眼球中抽出时，研究者通常会看到一团红色的组织黏附在记录电极上。此时唯一的解决办法是重新制备样本。石蜡油在电生理记录中具有多种优势：（i）可防止血淋巴凝固，避免其损坏电极尖端；（ii）可包覆电极尖端，降低其管壁电容，从而减小电极的时间常数，进而可能提高所记录神经信号的时间分辨率40,41；（iii）保持电极尖端清洁，便于穿刺；穿刺后，（iv）甚至有助于将电极尖端与细胞膜密封42。
当电极架的氯化银导线断裂或去氯化时，信号可能进一步变得不稳定或完全丢失；此时只需更换或重新氯化旧导线即可。信号缺失也可能是因为一个（或两个）电极架未牢固连接到插孔中。然而，设备本身发生故障的情况极为罕见。如果无法检测到信号，且已排除所有其他可能性，则应检查记录装置的各个部件（包括前置放大器、放大器、低通滤波器和模数/数模转换器）是否正确连接并正常工作。实现这一目的的一种方法是，用一台已知正常工作的设备中的相应仪器逐一替换现有仪器。或者，可使用信号发生器逐个检测各电子元件的性能。
但电生理学家面临的最常见技术问题或许是记录噪声。广义上，记录噪声是指除神经元对特定刺激的直接反应之外所观察到的电活动。由于果蝇制备样本在操作正确时非常稳定，因此所观察到的噪声（超出反应本身自然变异性之外的部分）通常来源于记录设备中的接地回路，或来自附近电子设备的干扰。此类噪声通常为50/60 Hz的电源嗡鸣及其谐波，但有时也包含更复杂的波形。为了确定噪声的来源，可将果蝇制备样本的固定装置从实验装置中移除，通过一滴果蝇任氏液将记录电极与参考电极连接（或将电极置于少量任氏液浴中；见步骤1.2.6），并在电压钳或桥式模式下记录信号。若在记录信号中观察到噪声，则表明该噪声很可能来自果蝇制备样本之外的外部来源。
另一种识别噪声来源的有效方法是将电极架替换为连接到放大器的电子细胞模型。在一个理想配置且良好接地的系统中，记录到的信号现在应几乎无噪声，仅显示来自模数转换器的随机比特噪声（在最佳情况下甚至比特噪声也不存在）。如果仍然存在噪声，则需重新检查所有设备是否正确接地。检测接地回路的一个简便方法是：（i）断开所有设备部件的接地线；（ii）使用欧姆表确认断开后每个部件确实与地隔离；（iii）将各个部件逐一直接连接至中央接地点，而不是通过设备的其他部分间接连接。同时尝试改变设备的配置。例如，有时将计算机和显示器移离设备更远可降低噪声；但在其他情况下，将计算机放入设备机架内部反而能减少噪声。还值得尝试拔掉附近的设备，观察噪声是否减少，或对额外组件进行屏蔽。此外，尝试拔下或更换记录设备中的不同组件，尤其是BNC电缆（其接地连接可能存在问题）。当使用细胞模型时，若仅观察到比特噪声，则初始噪声源可能来自电极或果蝇制备本身。例如，参考电极可能意外接触到了头囊内的运动神经或活性肌肉纤维（或在胸部放置时干扰了飞行肌）。通常最简单的做法是重新制备一只用于记录的果蝇，并注意尽量减少对果蝇的损伤。但如果噪声持续存在且为宽带噪声，则很可能是电极不适合实验需求——过于尖锐或过细（因而噪声过大），或根本不适用于当前目的；我们甚至观察到石英电极充当了天线，拾取到微弱的广播信号！尽管为了从特定细胞类型获得稳定高质量记录，需要反复调整拉制仪的参数以制备出理想的微电极，这一过程可能非常耗时，但这是值得的。一旦记录电极被优化适配于实验，便可实现持久且极高质量的记录。
尖端微电极记录技术也可用于研究多种样本中的神经信息处理过程，包括昆虫眼睛和大脑中不同的信息处理层43,44。由于微电极尖端可以制作得非常精细，因此通常对被研究细胞的损伤小于大多数膜片钳技术的应用。重要的是，现代采样-保持微电极放大器能够良好地控制电极尖端的电学特性40,45-47。因此，当正确应用时，该技术可在亚毫秒分辨率下，从体内3,5,7-10,44或体外48样本中获得高信噪比的可靠数据。这种精度是当前光学成像技术无法实现的，因为后者噪声更大、速度更慢。此外，该方法可用于在电流钳和电压钳配置下表征小细胞的电膜特性5,29,33,36,40-42,49，为连接实验与理论的生物物理和经验建模方法提供有价值的数据7,8,11,33,49-54。

果蝇（Drosophila melanogaster）的复眼是研究感光细胞和中间神经元阵列在神经图像采样与处理以及动物视觉中功能组织的优秀模型系统。该系统具有最完整的连接图谱1,2，并易于进行遗传操作和精确的神经活动监测（具有高信噪比和时间分辨率）3-10。
果蝇（Drosophila）的复眼呈模块化结构，包含约750个看似规则、由晶状体覆盖的结构单元，称为小眼（ommatidia），这些小眼共同为果蝇提供几乎覆盖头部周围所有方向的全景视觉视野。眼睛的主要信息采样单元是其杆状感光细胞7,8,11。每个小眼包含八个感光细胞（R1-R8），它们共享同一个角膜小眼面，但朝向七个不同的方向。外层感光细胞R1-R6对蓝绿光最敏感，而位于其上方、朝向相同方向的内层细胞R7和R8则表现出三种不同的光谱敏感亚型：浅色型（pale）、黄色型（yellow）和背侧边缘区（dorsal rim area, DRA）12-15。
<img alt="果蝇光感受器结构及突触连接；视叶小叶单元排列示意图" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 功能组织 果蝇 眼睛. (A果蝇复眼中，前两个视叶——小眼和外髓质——以灰色标示。小眼的R1-R6感光细胞以及外髓质的大单极细胞（LMCs：L1-L3）易于获取 体内 与传统的锐利微电极记录相比。示意图中的电极标示了在视网膜中从R1-R6记录的常规路径。在视网膜下层（lamina）中对LMC进行记录的一种方法是将电极向左平行移动。B视网膜小叶是由按视网膜拓扑结构排列的卡式单元组成的基质，每个单元包含处理来自视觉空间特定小区域信息的神经元。由于神经重叠现象，来自不同相邻小眼的六个感光细胞将其轴突（R1-R6）投射至同一个视网膜小叶卡式单元，向L1-L3神经元及一个无长突细胞（Am）形成组胺能输出突触。CR1-R6轴突末梢与视觉中间神经元（包括L4、L5、Lawf、C2、C3和T1）之间的神经信息传递在小叶小柱内极为复杂。DR1-R6 光感受器轴突接受来自L2和L4单极细胞的突触反馈。B）和（C）根据 Rivera-alba 等人进行的修改2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
的 果蝇 眼为神经重叠型16这意味着，属于七个相邻小眼、观察空间中同一点的八个感光细胞的神经信号，会在接下来的两个神经纤维网层——即视网膜下神经组织（lamina）和髓质（medulla）——中的一个神经小叶内汇聚在一起。其中，六个外周感光细胞R1-R6将其轴突终末投射至视网膜下神经组织（lamina）的神经柱中。图1），R7和R8细胞绕过该层，并与其对应的髓质小柱形成突触连接17-19。这些精确的神经连接构成了果蝇早期视觉视网膜拓扑映射的神经基础，其中每个视叶（lamina）图1A-C) 和髓质柱（ cartridge ）代表空间中的单个点。
大单极细胞（LMC：L1、L2 和 L3）以及无长突细胞（Am）接收来自 R1-R6 光感受器的直接输入，这些细胞位于视网膜小叶中1,2,20。其中，L1 和 L2 是体积最大的细胞，介导主要的信息通路（图 1D），它们分别对亮边和暗边的移动产生反应，从而构成运动检测器的计算基础21,22。行为学实验表明，在中等对比度条件下，这两条通路促进相反方向的运动感知：L1 细胞介导从后向前的运动感知，而 L2 细胞介导从前向后的运动感知23,24。连接性研究进一步提示，L4 神经元可能在相邻小叶模块之间的侧向通信中发挥关键作用25,26。在相同模块及两个相邻模块中的 L2 与 L4 细胞之间均发现了 reciprocal 突触连接。在下游通路中，每个 L2 细胞及其三个相关的 L4 细胞将轴突投射到共同的靶细胞——髓状体中的 Tm2 神经元，在此处来自相邻模块的输入被认为被整合以处理从前向后的运动信息27。尽管 L1 神经元通过缝隙连接和化学突触接收来自同模块 L2 细胞的输入，但它们并不直接与 L4 细胞或相邻的视网膜小叶模块相连。
只有属于L2/L4环路而非L1通路的神经元向R1-R6感光细胞轴突提供突触反馈1,2（图1D）。同小室连接具有特异性，即L2仅连接至R1和R2，L4仅连接至R5；而所有R1-R6感光细胞均可接收来自相邻小室中一个或两个L4细胞的突触反馈。此外，Am神经元与R1、R2、R4和R5之间存在强烈的突触连接，胶质细胞也以突触方式参与该网络，因而可能参与神经图像处理6。最后，轴突间的缝隙连接在小室内连接相邻的R1-R6感光细胞，并连接R6与R7/R8感光细胞，从而参与各小室中信息的不对称表征与处理14,20,28。
在近乎完整的黑腹果蝇（Drosophila）中对单个光感受器和视觉中间神经元进行细胞内电压记录，可获得毫秒以下时间分辨率、高信噪比的数据3,5,7-10,29，这对于解析相连神经元之间快速的神经计算至关重要。目前的光学成像技术尚无法达到这一精度，因其噪声显著更高，且通常仅能在10–100毫秒的时间分辨率下工作。此外，由于电极尖端极细且尖锐，该方法不仅限于记录胞体，还可直接记录小型活性神经结构，例如LMC的树突网络或光感受器轴突——这些结构无法用体积更大的膜片钳电极尖端触及。重要的是，与大多数膜片钳技术相比，该方法在结构上侵入性更小、造成的损伤更轻，因而对被研究细胞的胞内环境和信息采样影响更小。因此，传统的尖锐微电极技术已持续为神经信息处理在合适时间尺度上的研究贡献基础性发现和原创性见解，推动了我们对视觉机制的理解3-10。
本文解释了如何 体内 细胞内记录 果蝇 R1-R6 光感受器和 LMC 的记录由 Juusola 实验室完成。本方案将介绍如何构建合适的电生理记录装置、制备果蝇样本以及进行记录操作。文中展示了部分代表性数据，并讨论了使用该方法时可能遇到的一些常见问题及潜在解决方案。

<table><tbody><tr><td>用于制作果蝇标本的体视变焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF 目镜：WHN30x-H/22</td><td>可实现约150倍放大，工作距离长；定制重型钢制台式支架</td></tr><tr><td>体视显微镜在细胞内实验装置中的应用</td><td>&amp;middot;&amp;nbsp; Olympus</td><td>奥林巴斯 SZX7；目镜：WHN30x-H/22</td><td>需要30倍目镜，以便在将电极穿过角膜小孔进入眼内时，能清晰观察到电极尖端的反射光</td></tr><tr><td>尼康显微镜</td><td>尼康 SMZ645；目镜：C-W30x/7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>Melles Griot</td><td>面包板上带有公制M6孔</td><td>我们定制的实验装置在厚重的面包板上钻有一个大孔，可使来自下方的果蝇准备平台支柱（内含带电子元件的铜制散热片）穿过</td></tr><tr><td>纽波特</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>Narishige NMN-21</td><td>在我们的细胞内记录装置中，使用了不同的显微操作器系统来驱动尖端记录电极进入果蝇复眼。所列出的所有操作器均能成功地从黑腹果蝇的光感受器细胞和大细胞（LMCs）获得持久且稳定的记录。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Huxley Bertram</td><td>Huxley xyz轴精细手动控制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex 三轴系统</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;用户</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;配备额外X轴压电步进器和MS 314控制器的用户DC-3K</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>任何带开关的磁力底座均可使用</td><td></td><td>例如，在法拉第笼内管理线缆</td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>哈佛仪器</td><td>ESP/W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>0.3 - 0.5 mm 直径；电极夹需进行氯化处理</td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>多种不同品牌，包括 Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光纤束</td><td>超精细技术</td><td></td><td>为向万向节臂系统传递LED光刺激，我们使用液体和石英光导纤维（波长范围从紫外到红外）。</td></tr><tr><td>索恩实验室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>果蝇捕捉管</td><td></td><td>P80-50P 50 ml 离心管，聚丙烯材质，100 个/包</td><td>从50 ml塑料离心管上切下锥形底部，并在其上粘接一个1 ml移液器吸头。</td></tr><tr><td>数字采集系统</td><td>国家仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单电极电流/电压钳制微电极放大器</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>表现卓越！</td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>标准（±150 nA）</td><td>对于 npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>LED 光源与驱动器</td><td>2通道OptoLED（Cairn Research Ltd.，英国）</td><td></td><td>我们的许多刺激系统均为自主研发&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>自行设计与构建</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集与分析软件</td><td>可供选择的公司众多</td><td></td><td>Biosyst；Juusola 实验室用于实验与理论研究的定制Matlab系统</td></tr><tr><td>个人电脑或 Mac</td><td></td><td></td><td>确保计算机（PC 或 Mac）与数据采集系统及软件兼容</td></tr><tr><td>万向节系统&amp;nbsp;</td><td>自行设计与构建</td><td></td><td>提供光刺激的精确定位（x,y,z）</td></tr><tr><td>帕尔帖温度控制系统&amp;nbsp;</td><td>自行设计与构建</td><td></td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>自建</td><td></td><td>电磁噪声屏蔽</td></tr><tr><td>细丝状硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td></td><td>外径：1 mm</td><td></td></tr><tr><td>内径：0.5 - 0.7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细丝化石英玻璃毛细管</td><td></td><td>外径：1 mm</td><td></td></tr><tr><td>内径：0.5 - 0.7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Model P-2000 激光 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>对于硼硅酸盐参比电极，使用预设程序#11（膜片电极）：加热值 = 350；灯丝 = 4；拉速 = 36；延迟 = 200）。对于硼硅酸盐记录电极，使用预设程序#12（该程序通常可拉制出性能良好的传统尖端电极）&amp;nbsp; 用于感光细胞记录：加热值 = 355；灯丝值 = 4；速度 = 50；延迟 = 225；拉力 = 150。对于需要更细电极尖端的LMC记录，这些参数需进行调整。拉制石英毛细管时，P-2000手动操作建议使用细尖微电极的程序。这些程序&amp;rsquo; 预设参数可作为系统性优化的有用起点，以制备出穿透成功率高且记录噪声低的电极。</td></tr><tr><td>参比电极用细胞外林格溶液</td><td>来自 Fisher Scientific 的化学品</td><td>10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, 蔗糖</td><td>参见方案部分的配方</td></tr><tr><td>用于填充记录微电极的 3 M KCl 溶液</td><td>Fisher Scientific 公司的盐类</td><td>10010310，KCl</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>凡士林</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非不锈钢剃须刀片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>刀片架/刀片分割器</td><td>Fine Science Tools 品牌，由 Dumont 生产</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>蓝丁胶</td><td>Bostik</td><td></td><td>或者，使用模具粘土</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont 品牌的精细科学工具</td><td>11252-00</td><td>#5SF（超细吸头）</td></tr></tbody></table>

记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

昆虫感光细胞和视觉中间神经元的电压反应可通过传统的尖锐微电极进行精确记录。本文所述方法可使研究者从单个细胞中稳定记录持续时间较长（从数分钟至数小时）的高质量胞内反应 黑腹果蝇 R1-R6感光细胞和大单极细胞（LMCs）对光刺激的反应。由于记录系统噪声较低，该技术可用于研究果蝇复眼中单个细胞之间的变异，以及这些细胞的输出如何反映视觉环境的物理特性。本文概述了实施该技术的全部关键步骤。首先介绍了构建适合记录的电生理装置的基本步骤，包括实验设备的设计与选型。随后说明了如何制备合适的（尖锐的）记录电极和（钝头的）参考电极以进行记录前准备。详细描述了如何将一只完整的果蝇固定在定制的果蝇固定装置中，在其复眼上制作一个小窗口，并以最小损伤的方式将记录电极插入该窗口。本文还解释了如何定位细胞感受野的中心，对被研究细胞进行暗适应或光适应，并记录其对动态光刺激的电压反应。最后，阐述了稳定正常记录的判断标准，展示了单个细胞对不同光刺激所产生特征性的高质量电压反应，并简要定义了如何量化其信号传递性能。该方法的许多环节在技术上具有挑战性，需要反复练习和耐心才能掌握。但一旦研究人员熟练掌握并根据实验目标进行优化，该技术将提供卓越的 体内 神经生理学数据

此处针对果蝇（Drosophila）眼部改良的尖锐微电极记录方法，可用于可靠地量化视网膜和外髓质细胞中的神经信息采样与处理过程，以及它们之间的通信4,5,7,8,10,33。该方法已被用于研究不同野生型品系、突变体或基因工程果蝇品系中的视觉信号编码，充分证明了其应用价值；不仅可用于量化突变、温度、饮食或特定基因表达所带来的影响3,4,6,9,10,14,30,34，还可揭示视觉行为改变背后的机制性原因14,34。此外，该方法也易于应用于其他昆虫的神经生理实验35,36，从而推动神经行为学领域的视觉研究。接下来，我们将展示该方法成功应用的若干实例。
<img alt="感光细胞电压反应示意图；细胞内记录装置；温度对电位的影响。" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 7"> 
图 7. 果蝇 R1-R6 感光细胞在 20 和 25 oC 下对光脉冲的电压反应。 由于尖锐微电极穿刺通常非常稳定，因此可以通过加热或冷却果蝇，记录同一 R1-R6 感光细胞在不同环境温度下对特定光刺激的电压反应。在我们的实验装置中，果蝇固定装置置于基于闭环帕尔帖元件的温控系统上，使我们能够在数秒内改变果蝇头部的温度。较高温度会加快电压反应，并特征性地降低 R1-R6 感光细胞的静息电位（如红色箭头所示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
研究温度对光感受器输出的影响
通过设计精良且隔振良好的记录系统，该方法可用于通过加热或冷却果蝇来测量温度对单个细胞神经输出的影响。给出的示例显示了同一R1-R6光感受器在20和25℃下对持续10毫秒的强光脉冲的电压反应 oC (图7）。如先前所定量4,9，升温会降低感光细胞在暗处的静息电位，并加快其电压反应。
<img alt="果蝇感光细胞电压记录，光刺激下的信号适应与噪声比图示。" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 8"> 
图 8. 果蝇 R1-R6 感光细胞的信号传递性能随光照强度增强而提高。（A）同一微电极在相同细胞、20 oC 条件下记录的对弱光（下方）和强光（上方；亮度高 10,000 倍）重复自然光强度时间序列的感光细胞输出。强光刺激的响应幅度更大，因其整合了更多单光子引发的微小反应（即“光子 bumps”）4,5,7,8。（B）叠加显示 20 个连续的、每段持续一秒的电压响应。单个响应（浅灰色）取自适应趋势（图 A 中箭头所示）消退之后（图 A 中虚线框区域）。对应的响应均值（即信号）以较深线条表示。信号与单个响应之间的差异即为噪声。（C）采用标准方法4,5,7,8通过信噪比（SNR）量化细胞的信号传递性能。在强光刺激下，感光细胞可靠信号传递的频率范围比弱光条件下宽约 64 Hz（强光：SNR'Bright ≥1，最高达 84 Hz；弱光：SNR'Dim ≥1，最高达 20 Hz），且信噪比显著提升，从 SNRDimMAX = 87 提高至 SNRBrightMAX = 1,868。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过重复刺激研究适应性与神经编码
该方法具有非侵入性，对视网膜和髓板结构造成的损伤相对较小，因此非常适合在接近自然生理状态下体内（in vivo）研究单个细胞对不同光刺激的信号响应性能。图8展示了在20 oC条件下，一个R1-R6光感受器对弱光和强光重复自然光强度时间序列刺激的电压响应，而图9则展示了另一个R1-R6光感受器和一个LMC在25 oC条件下对另一种自然光刺激的响应。由于在同一果蝇体内同时进行视网膜和髓板区域的细胞内记录——即使用两根尖锐微电极分别在视网膜和髓板中记录——技术难度过高而难以实现，因此突触前和突触后记录分别来自两只不同的果蝇30。
<img alt="细胞内电压响应分析示意图；光刺激；果蝇中的信噪比。" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图9"> 
图9. 果蝇R1-R6光感受器和LMC在25 oC下对重复自然刺激的电压响应。（A）通过不同果蝇上的不同微电极记录的R1-R6（灰色）和LMC（黑色）输出。（B）完全光适应条件下，对同一自然刺激模式连续记录20次，突触前（上方）和突触后（下方）的个体响应（浅灰色）及相应的平均响应（信号，深色轨迹）。信号与个体响应之间的差异即为噪声。（C）通过记录的信噪比（SNR）量化细胞的信号传递性能。LMC输出的可靠信号传递范围比R1-R6输出宽约10 Hz（SNR'LMC ≥1，最高达104 Hz；SNR'R ≥1，最高达94 Hz）。两者的信噪比均较高（SNRLMCMAX = 142，SNRRMAX = 752），且由于记录噪声较低，二者之间的差异反映了细胞间真实的编码差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
刺激开始后，记录结果通常显示快速适应的趋势，这种趋势在5-6秒内基本消失。此后，细胞对每次持续1秒的刺激呈现产生高度一致的反应（每个虚线框内包含20次此类反应）。当这些反应叠加时，其可重复性变得明显图8B 和 图9B）。单个反应以细灰线表示，其均值以较粗的深色线表示。平均反应被视为 神经信号，而 神经噪声 平均值与每个个体反应之间的差异4,5,9,37,38. 频域中的相应信噪比（图8C 和 图9C通过将信号和噪声数据片段进行傅里叶变换得到功率谱，并将平均信号功率谱除以相应的平均噪声功率谱，获得结果。4,5,9,37,38通常情况下，记录到的神经输出对自然刺激的信噪比最高可达较高水平（100 - 1,000），在噪声极低且最稳定的记录条件下，该比值可达到以下数值 &gt;&gt;1,000 (例如., 图8C）。还应注意，升温会扩大细胞可靠信号传导的带宽4 (SNR'明亮≥ 1）；例如，两个 R1-R6 之间的相对差异 图8 和 9分别为10 Hz（20时84） oC 和 25℃ 时的 94 Hz oC）。
人们还可以利用香农方程，根据每个细胞的信噪比进一步估算其信息传递速率。32，或通过三重外推法计算响应熵与噪声熵率之间的差值39有关信息理论分析的更多细节，以及该方法在使用和局限性方面的具体说明，已在先前的出版物中给出。7,8,39.
<img alt="细胞内电压反应记录；叠加反应与信号性能图。" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 10"> 
图 10. 杀手蝇 R1-R6 光感受器和 LMC 在 19 oC 下对重复自然刺激的电压反应。（A）通过同一微电极从同一只果蝇记录的 R1-R6（灰色）和 LMC（黑色）输出；随着电极在眼内推进，先记录突触后，后记录突触前。（B）在初始适应后（A 中虚线框），捕获了对同一自然刺激模式的 20 次连续突触前（上方）和突触后（下方）反应（浅灰色迹线）。它们的均值为信号（上方较深迹线），而各自与单个反应的差异即为噪声。（C）信噪比（SNR）的计算方法如 图 8C 和 9C 所示。LMC 输出的可靠信号传递范围比 R1-R6 输出宽约 100 Hz（SNR'LMCMAX ≥1，最高达 234 Hz；而 SNR'RMAX  ≥1，最高达 134 Hz）。两者的信噪比均较高（SNRLMCMAX = 137，SNRRMAX = 627），并且由于记录中使用了同一微电极，其差异反映了突触前与突触后神经输出的真实差别。这些结果表明，记录系统的噪声较低，对分析的影响可忽略不计。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
神经行为学视觉研究
该方法还可用于记录不同昆虫物种复眼中突触前和突触后的电压反应7,8,35,36 (图10），从而允许对视觉信息处理进行比较神经行为学研究。对于所介绍的记录系统，唯一需要的调整是为所研究的物种配备新的样品固定装置，每个装置需具有适当尺寸的开口。这些示例记录来自一只雌性食蚜蝇（Coenosia attenuata）。它们展示了R1-R6光感受器和LMC在相同重复光刺激下的细胞内电压反应，该刺激方式用于 果蝇 对应物在 图9，但在19 oC. 本实验中，突触前和突触后数据均记录自同一只果蝇；使用同一根记录电极（内充3 M KCl），先后依次记录，电极先通过侧部 lamina，再进入前部视网膜。与之相比， 果蝇 25 时的数据 oC，该 Coenosia 数据——即使在较低温度下——也显示出动力学更快的响应；扩展了可靠信号传递的范围（信噪比） &gt;&gt;1）在更宽的频率范围内。这种神经编码对自然刺激的功能性适应与 Coenosia其捕食性生活方式36，这需要高精度的时空信息以实现快速的空中捕食行为。

尖锐的微电极能够准确表征活体果蝇（Drosophila）中感光细胞和视觉中间神经元的电生理输出。本文介绍了如何利用该方法记录单个细胞在可控光照刺激下高质量的电压反应。该方法非常适合研究昆虫复眼中神经信息的处理过程。

昆虫感光细胞和视觉中间神经元的电压反应可通过传统的尖锐微电极进行精确记录。该方法……

本实验的总体目标是记录果蝇感光细胞和视觉中间神经元对可控光刺激的细胞内电反应。该方法有助于回答神经编码领域中的关键问题，例如光刺激如何被编码为其响应之一，或视觉信息如何由感光细胞和中间神经元从光刺激中提取。该技术的主要优势在于，能够在对细胞内环境和信息采样造成极小损伤的情况下，获得持久且高质量的记录结果。该演示的特征至关重要，因为其各个步骤若不通过观察示范，很难正确掌握。使用标准的拉管仪，从带丝的硼硅酸盐玻璃或石英玻璃管中拉制参考微电极。尽量形成短而平缓的锥形。不同仪器的具体设置有所不同。由于尖端的孔径在实验中会被打破，因此其大小并不关键。然后使用相同的玻璃管拉制一根记录电极，尝试获得长度为10至15毫米的细长渐变锥形。在光学显微镜下，将电极固定在玻璃片的一侧，使用多种粘合剂，并用40倍空气物镜检查其尖端。优质的电极应平滑地收窄至一个肉眼不可见的微小尖端，其周围可见连续的、明暗相间的平行干涉条纹。实验开始前，使用连接有微粒过滤器并带有细塑料尖头的5毫升注射器，向参考电极内反向填充果蝇林格液。进行光感受器实验时，用 3 摩尔氯化钾填充记录电极，直至其大端形成液滴。这将最大限度减少记录过程中液接电位产生的噪声。若需记录组胺能 LMCs，应使用 3 摩尔醋酸钾和 0.5 毫摩尔氯化钾填充记录电极，以尽量减少对细胞氯离子电位的影响。首先准备一个装有5至10日龄果蝇的新鲜培养管。较年轻的果蝇更为脆弱，但也可用于记录。选取第一只果蝇进行电生理实验。较大的雌性果蝇最容易操作。当果蝇在捕捉管中时，利用其天生向上爬行的习性，将其引入移液器吸头并盖上较小的吸头。接着，将一个100毫升的注射器通过一段柔性塑料软管连接到移液器吸头上（吸头口稍加扩大，刚好能让果蝇通过），并将软管另一端连接至固定在果蝇固定装置上的大号移液器吸头。然后从注射器中挤出少量空气，将果蝇弹入果蝇固定装置。通过体视显微镜观察，轻轻注入更多空气，直至果蝇头部从固定装置的锥形末端伸出。确保果蝇的胸部被牢固固定。然后用蜂蜡固定果蝇。使用蜡加热器的最低温度来干净地熔化蜂蜡，此时蜂蜡会呈现透明状。如果温度过高，蜂蜡会烧焦。 用少量蜂蜡固定果蝇的喙和右眼眼角，注意避开角膜。将这两个点固定在果蝇固定装置上。此步骤需迅速完成，以免灼伤果蝇。接下来，戴上护目镜并制作微型刀具。使用两个平口夹持刀片架固定一片非不锈钢剃须刀片，并将其锋利边缘的一小条部分敲裂。理想情况下，应形成一个锋利如尖塔状的刃口。现在，仔细且高度专注地使用微刀切开果蝇左眼的几个小眼，例如从眼睛赤道上方背侧表皮处起的四到五个小眼。这将为记录微电极提供通路。该操作相当具有挑战性，需要使用制作精良的刀具，并且必须通过反复练习才能掌握。然后轻轻移除开口处的一小片角膜，暴露出下方的视网膜。现在使用凡士林涂抹棒的细毛，迅速用一小滴凡士林覆盖该孔洞。凡士林还能额外降低移液管的管壁电容。避免涂抹眼睛，以免影响光学清晰度。操作微电极放大器时，务必通过触碰法拉第笼或防震台的金属表面接地，以防止静电积累。将固定好的果蝇牢固地安装在果蝇实验平台的支架上。旋转果蝇固定装置，使果蝇的左眼正对研究人员。接着使用小型粗调显微操作器，将钝头参考电极轻轻穿过果蝇的单眼插入头壳内。务必确认果蝇仍保持健康状态，并能活动其触角。制备样品必须极为精细，方可进行记录。现在将锋利的记录微电极通过覆盖有胶状物的开口插入左眼。当电极进入组织时，其尖端位置应可通过反射图案清晰辨识。脆弱的电极尖端必须精准引导，否则会断裂，这极具挑战性。根据所记录的细胞类型，果蝇头部的朝向应略有不同。将电极就位后，打开微电极放大器。然后关闭冷光源，从电源插座上拔下插头，并将其连接到中央接地端，以尽量减少接地环路引起的电噪声。接着调整蛇形灯管导光臂，使卡登臂系统能够自由地在果蝇周围移动。随后关闭室内灯光，使果蝇样品处于相对黑暗的环境中。现在测量眼内记录电极的电阻，其值必须在 100 至 260 兆欧之间。有时电极尖端可能被堵塞，可使用放大器的电容性蜂鸣和电流脉冲功能进行疏通。如果这没有效果，请使用新的电极。接下来，将放大器设置为电流钳或电桥模式，并在电极之间将电压调零。在果蝇暗适应数分钟后，使用压电步进器或轻轻旋转微调旋钮，以0.1至1微米的步长将记录电极尖端插入眼睛。每一步均用持续时间为1至10毫秒的闪光刺激眼睛。每次闪光都会引起电压或视网膜电图（ERG）的短暂下降。当电极尖端进入靠近LMC的视叶外丛状层时，ERG信号会发生反转。然后继续进行测量。由于该方法具有非侵入性，可将近乎自然状态下的单个细胞信号特性进行研究。在 20 摄氏度下，测定了 R1-R6 光感受器对弱光和强光的电压响应。接下来，在25摄氏度条件下，将一只果蝇的R1-R6感光细胞与另一只果蝇的LMC进行比较。由于在同一果蝇中使用两根尖锐微电极进行细胞内记录难度过大而不可行，因此每组测量均在不同的果蝇上完成。当数据叠加显示时，其反应的可重复性变得明显。通过将信号和噪声数据片段进行傅里叶变换得到功率谱，并将平均信号功率谱除以相应的平均噪声功率谱，从而获得频域中的信噪比。该结果在最佳制备条件下可能对信号极为敏感。该技术可用于记录多种物种。在19摄氏度下，对Coenocia蝇类施加了相同的自然、重复的光刺激。通过推进记录电极，从同一只蝇类获取了突触前和突触后的数据。记录中更快的动力学特征与此物种的捕食性相符。一旦掌握，只要操作得当，该技术能够实现持久、高质量的记录。在尝试该操作时，必须认识到——我的意思是，这就像学习弹钢琴一样，练习得越多，获得的结果就越好。完成该操作后，还可采用其他方法（如药理学干预）来回答更多问题，例如神经调质在调控反应中的作用。该技术建立后，为神经生物物理学领域的研究人员探索如何优化光信息的获取、捕获与传递，以及光转导机制中的相关生化反应和后续生物学过程奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何准备用于细胞内实验的黑腹果蝇，以及如何记录其感光细胞和中间神经元的神经反应。

electrophysiological-method-for-recording-intracellular-voltage

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

为记录细胞内电压响应电法<em&gt;果蝇</em&gt;光感受器和中间对光刺激<em&gt;在体内</em

本文介绍了用于测量果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理学方法。通过刺激运动神经元轴突可人工引发递质释放，而神经肌肉接头（NMJ）的传递情况可通过记录肌肉中诱发的突触后反应进行测量。...

果蝇幼虫神经肌肉接头突触电位记录的电生理学方法

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

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