记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

本实验的总体目标是记录果蝇感光细胞和视觉中间神经元对可控光刺激的细胞内电反应。该方法有助于回答神经编码领域中的关键问题，例如光刺激如何被编码为其响应之一，或视觉信息如何由感光细胞和中间神经元从光刺激中提取。该技术的主要优势在于，能够在对细胞内环境和信息采样造成极小损伤的情况下，获得持久且高质量的记录结果。

该演示的特征至关重要，因为其各个步骤若不通过观察示范，很难正确掌握。使用标准的拉管仪，从带丝的硼硅酸盐玻璃或石英玻璃管中拉制参考微电极。尽量形成短而平缓的锥形。

不同仪器的具体设置有所不同。由于尖端的孔径在实验中会被打破，因此其大小并不关键。然后使用相同的玻璃管拉制一根记录电极，尝试获得长度为10至15毫米的细长渐变锥形。

在光学显微镜下，将电极固定在玻璃片的一侧，使用多种粘合剂，并用40倍空气物镜检查其尖端。优质的电极应平滑地收窄至一个肉眼不可见的微小尖端，其周围可见连续的、明暗相间的平行干涉条纹。实验开始前，使用连接有微粒过滤器并带有细塑料尖头的5毫升注射器，向参考电极内反向填充果蝇林格液。

进行光感受器实验时，用 3 摩尔氯化钾填充记录电极，直至其大端形成液滴。这将最大限度减少记录过程中液接电位产生的噪声。若需记录组胺能 LMCs，应使用 3 摩尔醋酸钾和 0.5 毫摩尔氯化钾填充记录电极，以尽量减少对细胞氯离子电位的影响。

首先准备一个装有5至10日龄果蝇的新鲜培养管。较年轻的果蝇更为脆弱，但也可用于记录。选取第一只果蝇进行电生理实验。

较大的雌性果蝇最容易操作。当果蝇在捕捉管中时，利用其天生向上爬行的习性，将其引入移液器吸头并盖上较小的吸头。接着，将一个100毫升的注射器通过一段柔性塑料软管连接到移液器吸头上（吸头口稍加扩大，刚好能让果蝇通过），并将软管另一端连接至固定在果蝇固定装置上的大号移液器吸头。

然后从注射器中挤出少量空气，将果蝇弹入果蝇固定装置。通过体视显微镜观察，轻轻注入更多空气，直至果蝇头部从固定装置的锥形末端伸出。确保果蝇的胸部被牢固固定。

然后用蜂蜡固定果蝇。使用蜡加热器的最低温度来干净地熔化蜂蜡，此时蜂蜡会呈现透明状。如果温度过高，蜂蜡会烧焦。

用少量蜂蜡固定果蝇的喙和右眼眼角，注意避开角膜。将这两个点固定在果蝇固定装置上。此步骤需迅速完成，以免灼伤果蝇。

接下来，戴上护目镜并制作微型刀具。使用两个平口夹持刀片架固定一片非不锈钢剃须刀片，并将其锋利边缘的一小条部分敲裂。理想情况下，应形成一个锋利如尖塔状的刃口。

现在，仔细且高度专注地使用微刀切开果蝇左眼的几个小眼，例如从眼睛赤道上方背侧表皮处起的四到五个小眼。这将为记录微电极提供通路。该操作相当具有挑战性，需要使用制作精良的刀具，并且必须通过反复练习才能掌握。

然后轻轻移除开口处的一小片角膜，暴露出下方的视网膜。现在使用凡士林涂抹棒的细毛，迅速用一小滴凡士林覆盖该孔洞。凡士林还能额外降低移液管的管壁电容。

避免涂抹眼睛，以免影响光学清晰度。操作微电极放大器时，务必通过触碰法拉第笼或防震台的金属表面接地，以防止静电积累。将固定好的果蝇牢固地安装在果蝇实验平台的支架上。

旋转果蝇固定装置，使果蝇的左眼正对研究人员。接着使用小型粗调显微操作器，将钝头参考电极轻轻穿过果蝇的单眼插入头壳内。务必确认果蝇仍保持健康状态，并能活动其触角。

制备样品必须极为精细，方可进行记录。现在将锋利的记录微电极通过覆盖有胶状物的开口插入左眼。当电极进入组织时，其尖端位置应可通过反射图案清晰辨识。

脆弱的电极尖端必须精准引导，否则会断裂，这极具挑战性。根据所记录的细胞类型，果蝇头部的朝向应略有不同。将电极就位后，打开微电极放大器。

然后关闭冷光源，从电源插座上拔下插头，并将其连接到中央接地端，以尽量减少接地环路引起的电噪声。接着调整蛇形灯管导光臂，使卡登臂系统能够自由地在果蝇周围移动。随后关闭室内灯光，使果蝇样品处于相对黑暗的环境中。

现在测量眼内记录电极的电阻，其值必须在 100 至 260 兆欧之间。有时电极尖端可能被堵塞，可使用放大器的电容性蜂鸣和电流脉冲功能进行疏通。

如果这没有效果，请使用新的电极。接下来，将放大器设置为电流钳或电桥模式，并在电极之间将电压调零。在果蝇暗适应数分钟后，使用压电步进器或轻轻旋转微调旋钮，以0.1至1微米的步长将记录电极尖端插入眼睛。

每一步均用持续时间为1至10毫秒的闪光刺激眼睛。每次闪光都会引起电压或视网膜电图（ERG）的短暂下降。当电极尖端进入靠近LMC的视叶外丛状层时，ERG信号会发生反转。

然后继续进行测量。由于该方法具有非侵入性，可将近乎自然状态下的单个细胞信号特性进行研究。在 20 摄氏度下，测定了 R1-R6 光感受器对弱光和强光的电压响应。

接下来，在25摄氏度条件下，将一只果蝇的R1-R6感光细胞与另一只果蝇的LMC进行比较。由于在同一果蝇中使用两根尖锐微电极进行细胞内记录难度过大而不可行，因此每组测量均在不同的果蝇上完成。当数据叠加显示时，其反应的可重复性变得明显。

通过将信号和噪声数据片段进行傅里叶变换得到功率谱，并将平均信号功率谱除以相应的平均噪声功率谱，从而获得频域中的信噪比。该结果在最佳制备条件下可能对信号极为敏感。该技术可用于记录多种物种。

在19摄氏度下，对Coenocia蝇类施加了相同的自然、重复的光刺激。通过推进记录电极，从同一只蝇类获取了突触前和突触后的数据。记录中更快的动力学特征与此物种的捕食性相符。

一旦掌握，只要操作得当，该技术能够实现持久、高质量的记录。在尝试该操作时，必须认识到——我的意思是，这就像学习弹钢琴一样，练习得越多，获得的结果就越好。

完成该操作后，还可采用其他方法（如药理学干预）来回答更多问题，例如神经调质在调控反应中的作用。该技术建立后，为神经生物物理学领域的研究人员探索如何优化光信息的获取、捕获与传递，以及光转导机制中的相关生化反应和后续生物学过程奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何准备用于细胞内实验的黑腹果蝇，以及如何记录其感光细胞和中间神经元的神经反应。