高灵敏度快速荧光检测结合便携式FRET分析仪

本实验方案的总体目标是在最佳条件下，通过定量测定市售饮料中的糖含量，展示FRET分析仪的普遍适用性。该方法有助于解答小分子（如糖类）检测与监测领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，无需使用昂贵的高端荧光计，即可高效监测针对小分子产生的实时信号。

演示该实验步骤的是我们实验室的Dr. Han。首先，制备麦芽糖或蔗糖特异性的青色和黄色荧光生物传感器质粒。然后，取5毫升LB液体培养基，接种一株DE3大肠杆菌单菌落，并于37°C摇床中振荡培养16小时。

接下来，取1 mL培养物加入含有100 mL LB培养基的锥形瓶中。将锥形瓶置于37°C摇床中培养，直至600 nm处的光密度值约为0.5。在4°C条件下离心培养物20分钟。迅速用50 mL冰冻蒸馏水重悬沉淀，并再次离心20分钟。

将沉淀重悬于50微升含10%体积分数甘油的冰冻蒸馏水中。轻轻涡旋混合液，直至其在600纳米处的光密度达到100。在预冷的电穿孔比色皿中，将该混合液与10纳克CMY质粒混合。

将混合物进行电穿孔。在比色皿中，用一毫升 SOC 培养基重悬细胞，然后转移至一个 15 毫升圆底离心管中。在 37 摄氏度下轻轻振荡培养一小时，使细胞复苏。

将细胞涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37°C条件下培养12小时。用接种环挑取单个菌落，转移至10 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。

将混合物在37摄氏度下振荡培养12小时，以制备种子培养物。取5毫升种子培养物转移至500毫升含氨苄青霉素的LB培养基中，在37摄氏度的摇床培养箱中培养细胞。当600纳米处的光密度达到0.5时，加入IPTG，使其终浓度为0.5毫摩尔。

培养24小时后，将细胞离心20分钟。小心弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL结合缓冲液中。在冰上超声处理细胞10秒，然后冷却细胞10秒。

重复超声处理和冷却步骤五次。将裂解液离心30分钟。将上清液转移至另一收集管中。

使用镍NTA亲和柱纯化上清液。用20毫升纯化后的样品填充10,000毫瓦的浓缩管。将样品离心10分钟，然后用0.8%磷酸盐缓冲液重新填充浓缩管。

以每次20毫升的方式对剩余样品重复此过程，直至所有蛋白质完成浓缩和脱盐。将纯化的FRET生物传感器在-80摄氏度下保存。用CMY生物传感器蛋白配制0.2微摩尔的溶液，并以0.8% PBS作为检测溶液。

打开手持式FRET分析仪。将分析温度设置为53摄氏度。然后将仪器设为校准模式。

使用0.8% PBS填充比色皿作为背景。在分析仪中将样品预热至53摄氏度，然后设定背景。接着，用检测溶液填充另一比色皿。

将比色皿放入分析仪中并设定基线。更换为含有检测溶液和1毫摩尔糖的比色皿，调节至饱和强度以完成校准。

开始制备饮料样品以进行糖含量分析时，使用1.5毫升微量离心管，将1毫升饮料样品离心。用1毫升注射器移除上清液，并通过0.2微米注射器滤膜过滤上清液。在1.5毫升微量离心管中，将0.1毫升滤液与0.9毫升0.8% PBS混合。

轻轻涡旋混合物以确保完全稀释。取5微升稀释后的饮料样品和495微升检测溶液加入比色皿中。将比色皿放入分析仪，并将样品预热至53摄氏度。

按下设置按钮以测量样品的糖含量。在本方法中，通过生物传感器中黄色荧光蛋白与青色荧光蛋白的发射强度比值来测量FRET效率。这些CMY生物传感器的最佳测量温度为50至55摄氏度，因为在此温度下，对照溶液与麦芽糖饱和溶液之间的发射强度比值差异最大。

CMY-BII 生物传感器被用于在53度下评估三种饮料中的麦芽糖含量。通过在给定温度下测定不同麦芽糖浓度时的该比值，生成剂量响应曲线。利用校准过程中获得的数值，将发射比值与麦芽糖浓度相关联。

测得的麦芽糖含量与饮料生产商报告的总糖含量一并显示。饮料A含有大米和大麦等麦芽糖来源。相应地，测得的麦芽糖含量约占报告总糖含量的二分之一。

饮料C是一种运动饮料，其麦芽糖含量非常低。在进行该操作时，需注意将设备及FRET传感器的工作温度控制在50至55摄氏度之间。观看本视频后，您应能够掌握如何使用自制的手持式FRET分析仪对这类小分子进行定量检测。