检测皮质片段在细菌孢子萌发

该分步方案的总体目标是量化细菌孢子萌发过程中皮层片段或还原糖的丰度。该方法将详细说明在孢子萌发过程中检测皮层片段或还原糖存在所需的步骤。该技术的主要优点是大多数实验室都拥有成功完成实验步骤所需的试剂和设备。

通过将一管艰难梭菌孢子放入加热块中并在 65 摄氏度下孵育 30 分钟来开始此过程。孵育后，将试管置于冰上。发芽溶液对所研究的细菌孢子种类具有特异性。

为了测定艰难梭菌孢子的萌发，我们使用 pH 值为 7.5 的 10 毫摩尔 Tris 溶液，以及 150 毫摩尔氯化钠、100 毫摩尔甘氨酸和 10 毫摩尔牛磺胆酸的去离子水溶液。每个样品准备 1 毫升发芽液，外加 1 毫升。在开始检测之前，将 1 毫升发芽液转移到微量离心管中并将其放在一边。

这将用作皮层片段检测的空白。接下来，在发芽溶液中，将孢子加入约 3.0 的 OD 600 中并短暂涡旋。这种数量的孢子非常适合在艰难梭菌孢子萌发过程中调节皮层片段的释放。

添加孢子后，立即将 1.2 mL 样品取出到新的微量离心管中，然后将其放入离心机中。然后在室温下以 14， 000 倍 G 离心 1 分钟，即为零时间点。离心后，将 1 毫升上清液转移到新鲜的 2 毫升螺旋盖管中，并在零下 80 摄氏度下冷冻。

重复定期取等分试样、离心和冷冻的过程，直到每个时间点收集完样品。由于离心和取样需要时间，在此过程中不可能出现小于 2 分钟的时间点，因此这些样品每 2 分钟采集一次，持续 14 分钟。在制备皮质样品时，如果需要监测二犀啶酸，请取出单独的 100 μL 样品，并分装在冰上的微量离心管中。

还要制备样品，以使用以下量的 N-乙酰氨基葡萄糖生成标准曲线。发芽溶液中的 0、12.5、25、50、100、250、500 和 5， 000 纳摩尔。在每个时间点收集样品后，从冰箱中取出样品，并将其与空白和标准曲线样品一起冻干。

然后将所有样品储存在零下 80 摄氏度直至使用。在检测当天，将冻干样品（包括对照和标准曲线样品）重悬于 120 μL 盐酸中，加入苯酚和 β-巯基乙醇。接下来，将所有重悬样品转移到新鲜的 2 mL 螺口盖管中。

然后将它们在 95 摄氏度的循环水浴中孵育 4 小时。孵育后，将样品放在冰上直至冷却。然后加入 120 微升 3 摩尔氢氧化钠来中和它们。

接下来，向每个样品中加入 80 微升饱和碳酸氢钠溶液和 80 微升 5% 乙酸酐溶液并涡旋。然后将样品在室温下孵育 10 分钟。孵育后，将样品转移回 95 摄氏度的水浴中整整 3 分钟。

请注意，此步骤对时间敏感，较长的时间会影响下游信号的生成。从水浴中取出样品并在冰上冷却。向每个试管中加入 400 微升 6.54% 四硼酸钾四水合物并涡旋。

将样品在 95 摄氏度的循环水浴中孵育整整 7 分钟。此步骤也是时效性的。取出样品，置于冰上 5 分钟。

当样品在冰上时，准备显色试剂。将 0.320 克 DMAB 溶解在 1.9 毫升冰醋酸中。请注意，该试剂对时间、温度和光敏感，不应提前制备。

DMAB 完全溶解后，加入 100 μL 10 正盐酸并涡旋样品。然后加入 5 毫升冰醋酸，再次涡旋。对于比色反应，将 100 μL 每个冷却的皮层或对照样品转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。

向每个样品中加入 700 微升新鲜制备的着色溶液。立即将样品转移到 37 摄氏度的水浴中，并孵育样品 20 分钟。孵育后，将每个样品的 200 微升转移到透明的 96 孔板中。

样品开始时应该是黄色的，但如果减少糖分，则呈紫色，这表明存在皮层。在这里，许多样本没有显示可见的紫色。然而，250、500 和 5， 000 纳摩尔样品在视觉上与阴性对照 0 纳摩尔不同。

使用读板器，测定 585 纳米处的吸光度。当在 585 纳米的外径中测量时，标准样品产生的信号最适合线性回归。下表显示了使用 N-乙酰氨基葡萄糖标准品的典型结果。

然后使用这些数据生成此处显示的标准曲线。在发芽促进条件下使用补充有 100 毫摩尔甘氨酸和 10 毫摩尔牛磺胆酸的发芽缓冲液进行发芽测定。在非发芽条件下，仅 100 毫摩尔甘氨酸。

在没有牛磺胆酸的情况下，艰难梭菌孢子不发芽，并且溶液中皮质片段的存在几乎没有变化。然而，在牛磺胆酸和甘氨酸存在下，艰难梭菌孢子发芽并将皮质片段释放到溶液中。随着时间的推移，反应样品的 OD585 会增加，从而被吸收。

使用标准曲线计算该测定过程中释放的皮层片段的数量。从该测定中可以看出，大部分皮层在发芽后 15 分钟被水解或释放。这表明大多数孢子都在这个时间范围内发芽了。

看完这个视频后，您应该对细菌孢子萌发过程中如何检测发芽液中的皮层片段或还原糖有很好的了解。在尝试此程序时，重要的是要密切注意反应时间，以便测定能够正确进行。