Name: 一种醇溶蛋白氰基丙烯酸酯纳米粒子为亲水涂料生产协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学习醇溶蛋白氰基丙烯酸酯纳米粒子制备方案，用于快速亲水涂料生产。该方法可在不到一分钟内完成疏水表面改性，提升材料功能性与应用价值。

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感谢 Jason Adkins 先生提供的专业技术支持。

1. 商业麦胶蛋白的脱脂处理
<ol>
	<li>用量筒量取 150 ml 丙酮，倒入 250 ml 锥形瓶中。
	<ol>
		<li>在室温下，将磁力搅拌子放入锥形瓶中，开启磁力搅拌器持续搅拌，同时加入 30 g 商业购得的麦醇溶蛋白粉末。用铝箔密封瓶口，并在通风橱中继续搅拌过夜（O/N）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用滤纸过滤该溶液。
	<ol>
		<li>用新鲜的丙酮（约 50 ml）洗涤滤渣。静置 10 分钟，使丙酮充分沥干。</li>
		<li>将滤纸及其下方的滤渣一同转移至较大的培养皿中，例如细胞培养方皿。用一张大号滤纸覆盖整个培养皿，以减缓残留丙酮的挥发速度。</li>
		<li>在通风橱中静置过夜（O/N），使滤渣完全干燥。将脱脂后的麦醇溶蛋白储存于密闭容器中，室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 麦醇溶蛋白的纯化制备
<ol>
	<li>用量筒量取 150 ml 水，倒入 1,000 ml 锥形瓶中。
	<ol>
		<li>用刻度量筒量取 350 ml 无水乙醇，加入同一个 1,000 ml 锥形瓶中。用磁力搅拌器剧烈搅拌（800 - 1,000 rpm），直至溶液混合物中不再产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在持续搅拌的同时，加入 20 g 脱脂商用麦醇溶蛋白粉末。分次少量加入麦醇溶蛋白，以避免形成内部含有空气的结块。继续搅拌过夜（O/N）。</li>
	<li>将整个溶液转移至 1,000 ml 量筒中，静置两天。在此期间，杂质将沉淀至量筒底部。</li>
	<li>用移液管将上清液转移至旋转蒸发仪中，尽可能除去上清液中的乙醇。随着乙醇含量的降低，麦醇溶蛋白将以聚集体形式出现在溶液中。</li>
	<li>将含有麦醇溶蛋白聚集体的溶液浸入或旋转于甲醇/干冰混合物中进行冷冻，随后在真空条件下于 -70 °C 冷冻干燥。在冷冻干燥前，确保整个溶液已完全冻结，无任何液体残留。 
	注：冷冻干燥后的麦醇溶蛋白将形成多孔固体。</li>
	<li>用研钵和研杵将冷冻干燥的麦醇溶蛋白研碎，再用咖啡研磨机研磨，得到细粉（&#60;0.5 mm）。将产物转移至密封容器中，室温保存。</li>
</ol>
3. ECA 与麦醇溶蛋白的聚合反应
<ol>
	<li>将一个闪烁瓶（体积约为 20 ml）放入天平中归零。加入 3.2 g 蒸馏水和 6.8 g 无水乙醇至闪烁瓶中。</li>
	<li>将闪烁瓶转移至磁力搅拌器上，放入一根磁力搅拌子（20&#160;x 3 mm），并在 800 - 1,000 rpm 条件下剧烈搅拌，直至水-乙醇混合液不再产生气泡。</li>
	<li>在持续搅拌的同时，向瓶中加入 40 µl 的 4 N HCl。随后在搅拌条件下加入 20 mg 麦醇溶蛋白，继续搅拌直至麦醇溶蛋白粉末完全溶解于水-乙醇混合液中。</li>
	<li>确认麦醇溶蛋白溶液肉眼观察澄清后，在搅拌速度仍保持 800 - 1,000 rpm 的条件下，缓慢加入 80 - 100 µl 的 ECA。
	<ol>
		<li>将搅拌速度降至 500 rpm，继续搅拌 1 小时。随着反应进行，观察溶液浑浊现象，表明聚合反应正在进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应结束后，将溶液转移至离心管中，并平衡各管重量。在 10,000 x g 条件下离心 20 分钟。在此过程中，副产物沉淀，而纳米颗粒保留在上清液中。副产物的主要成分为 PACA 均聚物。</li>
	<li>离心完成后，用移液器将生成的纳米颗粒悬浮液（上清液）转移至闪烁瓶（或其他密闭容器）中，并在室温下保存。</li>
</ol>
4. 产物的表征
<ol>
	<li>在20 ml 闪烁瓶中，将3.2 g 水与6.8 g 无水乙醇混合，配制10 g 的68 wt% 乙醇水溶液，并搅拌至溶液中不再产生气泡。
	<ol>
		<li>在搅拌过程中，向该溶液混合物中加入40 µl 的4 N HCl。继续搅拌，同时加入50 µl 纳米颗粒悬浮液至上述制备的乙醇溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用上述制备的样品溶液，通过动态光散射（DLS）测量纳米颗粒的粒径，并遵循仪器制造商的操作说明。 
	注意：最终产物的粒径必须小于200 nm。若粒径大于200 nm，则产物在长期储存中将不稳定。当所用的ECA不新鲜时，易形成较大的纳米颗粒。</li>
</ol>
5. 产物的检测
<ol>
	<li>准备一块玻璃板，例如手持镜子。&#160;用肥皂水清洗玻璃板表面，再用流动水冲洗玻璃板表面，然后将清洗后的表面晾干，或不干燥直接用于下一步。</li>
	<li>将3.6)中获得的纳米粒子悬浮液喷洒到玻璃板的一部分区域，立即用流动水冲洗表面。</li>
	<li>在玻璃板表面喷洒纯水，观察到已涂覆区域（喷有纳米粒子悬浮液）能保持一层水膜，而未涂覆区域则无此现象。</li>
</ol>

<ol><li>Vauthier, C., Dubernet, C., Fattal, E., Pinto-Alphandary, H., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28alkylcyanoacrylates%29+as+biodegradable+materials+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliver. Rev. 55, 519-548 (2003).</li>
<li>Wieser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+gluten+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chemistry of gluten proteins.</a> Food Microbiol. 24, 115-119 (2007).</li>
<li>Bietz, J. A., Wall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+high+molecular+weight+gliadin+and+ethanol+soluble+glutenin+subunits+of+wheat%3A+Relation+to+gluten+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Identity of high molecular weight gliadin and ethanol soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure.</a> Cereal Chem. 57, 415-421 (1980).</li>
<li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+composites+by+using+gliadin+as+a+bonding+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereal+Sci%22%5BJournal%5D)">Production of composites by using gliadin as a bonding material.</a> J. Cereal Sci. 54, 168-172 (2011).</li>
<li>Kim, S., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+gliadin-poly%28ethyl+cyanoacrylate%29+nanoparticles+for+hydrophilic+coating%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanopart.+Res%22%5BJournal%5D)">Production of gliadin-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles for hydrophilic coating.</a> J. Nanopart. Res. 16, 1-10 (2014).</li>
<li>Behan, N., Birkinshaw, C., Clarke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+n-butyl+cyanoacrylate+nanoparticles%3A+a+mechanistic+study+of+polymerisation+and+particle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation.</a> Biomaterials. 22, 1335-1344 (2001).</li>
<li>Nicolas, J., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+poly%28alkyl+cyanoacrylate%29-based+colloidal+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of poly(alkyl cyanoacrylate)-based colloidal nanomedicines.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 111-127 (2009).</li>
<li>Kim, S., Evans, K., Biswas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+BSA-poly%28ethyl+cyanoacrylate%29+nanoparticles+as+a+coating+material+that+improves+wetting+property%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface.+B%22%5BJournal%5D)">Production of BSA-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles as a coating material that improves wetting property.</a> Colloid Surface. B. 107, 68-75 (2013).</li>
<li>Lander, L. M., Siewierski, L. M., Brittain, W. J., Vogler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+comparison+of+contact+angle+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">A systematic comparison of contact angle methods.</a> Langmuir. 9, 2237-2239 (1993).</li>
<li>Davies, J., Nunnerley, C. S., Brisley, A. C., Edwards, J. C., Finlayson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Dynamic+Contact+Angle+Profile+Analysis+in+Studying+the+Kinetics+of+Protein+Removal+from+Steel+Glass%2C+Polytetrafluoroethylene%2C+Polypropylene%2C+Ethylenepropylene+Rubber%2C+and+Silicone+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Colloid+Interf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of Dynamic Contact Angle Profile Analysis in Studying the Kinetics of Protein Removal from Steel Glass, Polytetrafluoroethylene, Polypropylene, Ethylenepropylene Rubber, and Silicone Surfaces.</a> J. Colloid Interf. Sci. 182, 437-443 (1996).</li>
<li>Giolando, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-crystals+of+titanium+dioxide+in+aluminum+oxide%3A+A+transparent+self-cleaning+coating+applicable+to+solar+energy%5BTitle%5D)+AND+%22Sol.+Energy%22%5BJournal%5D)">Nano-crystals of titanium dioxide in aluminum oxide: A transparent self-cleaning coating applicable to solar energy.</a> Sol. Energy. 97, 195-199 (2013).</li>
</ol>

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纳米颗粒悬液的制备过程中有几个关键步骤。如果纯化的麦醇溶蛋白含有杂质，则与ECA的反应会产生副产物。尽管这些不需要的产物可在离心阶段从反应体系中去除，但会降低主要产物的产率。如果在实验步骤2.3）中制备的麦醇溶蛋白溶液在两天后仍未出现上清液与沉淀物的明显分离，则需要延长静置时间。使用新鲜的ECA至关重要，因为ECA的保存期限有限。
旧的ECA中的部分聚合ECA会产生较大尺寸的纳米颗粒，这些颗粒在悬浮介质中不稳定。每种反应物的浓度均可调整，但这种调整会影响最终产物的尺寸和稳定性。因此，有必要观察所制备的纳米颗粒是否形成聚集体。由于聚集体的尺寸在数微米范围内，可使用光学显微镜进行检测。所制备的纳米颗粒在高于120 °C时开始分解。如果涂层表面的温度升高至120 °C以上，则需要重新涂覆。涂层在正常条件下是稳定的。除非涂层材料暴露于苛刻条件，例如加热至120 °C以上或浸入碱性水中，否则数月内未观察到任何降解迹象。
本文所介绍的涂层工艺具有快速成膜的优势，因为该过程依赖于纳米颗粒在玻璃（或其他材料）表面的快速吸附。采用蛋白质作为纳米...

本文的目的是展示一种通过简单喷涂方式改变材料润湿性能的纳米颗粒悬浮液的制备方案。所用的纳米颗粒悬浮液由烷基氰基丙烯酸酯1和一种谷类蛋白——醇溶蛋白（gliadin）2,3制成。在制备过程中，蛋白质在含水乙醇中形成聚集体4，随后与单体（烷基氰基丙烯酸酯）发生反应，生成以蛋白质为核心、周围包裹线性聚合物链[聚（烷基氰基丙烯酸酯）]5的纳米颗粒。
聚（烷基氰基丙烯酸酯）具有生物可降解性，已通过乳液聚合法用于制备纳米颗粒6。该反应可由水中解离出的羟基或其他反应介质中的亲核基团自发引发7。在本文所述反应中，蛋白质聚集体表面的氨基可引发烷基氰基丙烯酸酯单体的聚合反应5,8。该反应的结果是在反应体系中形成纳米颗粒，其核心为蛋白质聚集体，外层则为聚（烷基氰基丙烯酸酯）（PACA）链。所制备的纳米颗粒对大多数材料具有强亲和性（更准确地说，是任何PACA能够吸附的材料），并可附着在其表面，形成纳米尺度的薄涂层。通过简单的喷涂即可使材料表面迅速变为亲水性。
麦醇溶蛋白是存在于小麦胚乳中的谷蛋白的主要组分之一。麦醇溶蛋白主要是分子量约为28,000–55,000的单体蛋白。麦醇溶蛋白的聚集主要由氢键、离子键和疏水键等非共价键驱动2。尽管本文选择麦醇溶蛋白作为反应物，但许多其他蛋白质也可用于相同目的。然而，由于诱导聚集的条件取决于所用蛋白质的类型，因此需要相应地调整反应条件8。与其他蛋白质相比，麦醇溶蛋白更易获得，纯化过程简单，且生产成本较低。尽管本文选用氰基丙烯酸乙酯（ECA）作为该反应的单体，但其他烷基氰基丙烯酸酯也可用于相同的反应。选择ECA的原因在于其易于获取且成本低廉。

<table><tbody><tr><td>氰基丙烯酸乙酯（ECA）单体</td><td>K&amp;R International (Laguna Niguel, CA)</td><td>I-1605</td><td>可使用任意纯度的ECA。</td></tr><tr><td>醇溶蛋白（Gliadin）</td><td>MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS)</td><td>公司赠送</td><td>醇溶蛋白可从Sigma-Aldrich公司购买（货号：G3375-25G）。除醇溶蛋白外，也可使用任意市售&amp;nbsp;麸质。</td></tr><tr><td>HCl</td><td>任意</td><td></td><td>可使用任意试剂级化学品。</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>任意</td><td></td><td>可使用任意试剂级化学品。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>任意</td><td></td><td>可使用任意试剂级化学品。</td></tr><tr><td>乙醇（100%）</td><td>任意</td><td></td><td>可使用任意试剂级化学品。</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>任意</td><td></td><td>可使用尺寸大于10 cm的任意规格滤纸。</td></tr><tr><td>细胞培养方皿</td><td>任意</td><td></td><td>可使用尺寸大于20 × 20 cm的任意培养皿。</td></tr><tr><td>咖啡研磨机</td><td>任意</td><td></td><td>可使用任意型号的咖啡研磨机。</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>任意</td><td></td><td>可使用任意型号的旋转蒸发仪。</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>任意</td><td></td><td>可使用能够达到-70 &amp;deg;C的任意冷冻干燥机。</td></tr><tr><td>离心机</td><td>任意</td><td></td><td>可使用能够提供1,000 × g离心力的任意离心机。</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>任意</td><td></td><td>可使用能够使搅拌子转速达到1,000 rpm的任意磁力搅拌器。</td></tr><tr><td>动态光散射（DLS）</td><td>Brookhaven Instruments Corporation</td><td>NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer</td><td>可使用任意厂商的DLS仪器。</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜（SEM）</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td>可使用任意型号的扫描电子显微镜。</td></tr><tr><td>动态接触角（DCA）</td><td>Thermo Cahn Instruments</td><td></td><td>可使用任意型号的动态接触角仪。</td></tr></tbody></table>

一种用于亲水涂层的醇溶蛋白-氰基丙烯酸酯纳米颗粒的制备方案

A Protocol for the Production of Gliadin-cyanoacrylate Nanoparticles for Hydrophilic Coating

本文介绍了一种通过简单喷雾包覆方法将疏水表面转变为亲水表面的蛋白质基纳米颗粒制备方案。这些纳米颗粒是通过在谷类蛋白（醇溶蛋白）分子表面发生烷基氰基丙烯酸酯的聚合反应而制得。烷基氰基丙烯酸酯是一种单体，当其施加到材料表面时，在室温下可立即发生聚合。该聚合反应由材料表面微量的弱碱性或亲核性物质（包括水分）引发。一旦发生聚合，聚烷基氰基丙烯酸酯因其主链上含有腈基，对目标材料表现出强亲和性。蛋白质也可作为该聚合反应的引发剂，因其含有可引发氰基丙烯酸酯聚合的氨基。若使用聚集态蛋白质作为引发剂，则在烷基氰基丙烯酸酯聚合后，蛋白质聚集体将被疏水性的聚烷基氰基丙烯酸酯链所包裹。通过调控实验条件，可制备出粒径在纳米范围内的颗粒。所制得的纳米颗粒可轻易吸附于多种材料表面，包括玻璃、金属、塑料、木材、皮革和织物。当将所制备的纳米颗粒悬浮液喷洒至材料表面并用水冲洗后，纳米颗粒的胶束结构会发生构象变化，使亲水性蛋白质暴露于空气中。因此，经纳米颗粒包覆的表面转变为亲水性表面。

纳米颗粒可在多种反应条件下制备。醇溶蛋白在较宽范围的乙醇含量下均可形成聚集体5。然而，聚集体的尺寸应尽可能小，因为后续将在该聚集体上添加额外一层（即，聚合的ECA），此过程将导致最终颗粒尺寸增大。若颗粒最终尺寸过大，则颗粒将不稳定并易于沉淀。因此，选择68%的水性乙醇作为反应介质4。所制备的纳米颗粒尺寸在数百纳米量级。利用所制备纳米颗粒实现亲水包覆的作用机制如下。
对于材料的涂覆，将这种纳米颗粒悬浮液（溶于68%乙醇中）喷洒在目标材料表面，随后用水冲洗。当含水乙醇中的纳米颗粒被喷洒到目标材料表面时，由于乙醇的表面张力很低，含水乙醇容易扩散到更广泛的区域。这种扩散作用使悬浮的纳米颗粒迅速而均匀地分布于目标材料表面。由于纳米颗粒表面的PECA链与材料之间具有强亲和力，这些被输送的纳米颗粒会吸附在材料上。随后加入水会改变纳米颗粒的构象。换句话说，纳米颗粒会打开其结构，使内部的亲水性蛋白质暴露于空气...

本文介绍了一种制备基于蛋白质的纳米颗粒的方案，该方案可将疏水表面转变为亲水表面。所制备的纳米颗粒由醇溶蛋白-氰基丙烯酸酯二嵌段共聚物组装而成。使用该纳米颗粒进行喷雾涂层处理，可将目标材料的表面转变为亲水表面。

本文介绍了一种制备蛋白基纳米颗粒的方案，该方案通过简单的喷雾方法将疏水表面转变为亲水表面。

本演示的总体目标是展示一种用于制备可将疏水表面转变为亲水表面的蛋白基纳米颗粒的方案。该演示展示了用于亲水涂层的蛋白基纳米颗粒的制备方法，以及其在目标材料表面的性能表现。该技术的主要优势在于，涂层过程可在不到一分钟的时间内完成。演示将由我在美国农业部实验室工作了过去16年的技术员 Jason Adkins 进行。开始此操作时，使用量筒量取150毫升丙酮，并转移至250毫升锥形瓶中。在搅拌的同时，向含有丙酮的锥形瓶中加入30克商用醇溶蛋白粉末。用铝箔密封烧瓶口，并在室温下继续搅拌溶液过夜。次日，将溶液通过滤纸过滤，随后用约50毫升新鲜丙酮洗涤滤渣。过滤后，将截留物和滤纸转移至一方形细胞培养皿中。用一张较大的滤纸覆盖培养皿，以减缓残留丙酮的挥发。待脱脂醇溶蛋白室温干燥过夜后，转移至密闭容器中，并存放于实验台。现在，用量筒量取 150 毫升去离子水，并转移至 1,000 毫升的锥形瓶中。用刻度量筒量取 350 毫升无水乙醇，并加入含有去离子水的锥形瓶中。剧烈搅拌溶液，直至不再观察到气泡为止。接下来，将20克脱脂麦醇溶蛋白粉末加入正在搅拌的溶液中。搅拌过夜后，将整个溶液转移至1,000毫升量筒中，静置两天。随后，将上清液转移至带有柔性管的圆底烧瓶中，并通过旋转蒸发尽可能去除上清液中的乙醇。此时，通过将烧瓶浸入甲醇-干冰混合物中，冷冻含有麦醇溶蛋白聚集体的溶液。然后在真空条件下于70摄氏度进行冷冻干燥。使用研钵和研杵将冻干的麦醇溶蛋白研碎，并用咖啡研磨机研磨，以获得细粉。 然后将粉末转移至密封容器中，并在室温下保存。对于聚合反应，向已称重的闪烁瓶中加入 3.2 克蒸馏水和 6.8 克无水乙醇。剧烈搅拌溶液，直至不再观察到气泡。接下来，在搅拌的同时向小瓶中加入 40 µL 的 4 mol/L 盐酸。加入 20 mg 纯化的麦醇溶蛋白粉末，并继续搅拌直至粉末完全溶解。确认溶液均匀后，在搅拌下缓慢加入 80 至 100 µL 氰基丙烯酸乙酯单体。将搅拌速度降至500 rpm，继续搅拌溶液1小时。反应完成后，将溶液转移至离心管中，并平衡管重。在10,000 × g条件下离心20分钟。离心后，用移液器将制备的纳米颗粒悬浮液转移至闪烁瓶中，并在室温下保存。为表征产物，在20毫升闪烁瓶中配制68重量百分比的水性乙醇溶液。搅拌溶液直至不再观察到气泡为止。接下来，在搅拌条件下，向溶液中加入 40 µL 的 4 mol/L 盐酸和 50 µL 纳米颗粒悬浮液。然后按照制造商的说明，使用动态光散射法测定纳米颗粒的粒径。此时，用肥皂水清洗玻璃片（如手持镜子）的表面。将纳米颗粒悬浮液喷洒在玻璃板的部分区域，然后立即用水冲洗表面。接着，将水喷洒在整个玻璃板表面。观察涂层区域与未涂层区域之间的差异。随着纳米颗粒悬浮液中乙醇含量的降低，每个纳米颗粒表面带有高电荷，颗粒表面的亲水性显著增强。吸附纳米颗粒

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