Name: 灭鼠工作心脏模型心肌的性能和氧耗的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 了解啮齿类动物离体左心工作心脏模型的制备方法，用于精确控制心室负荷条件并研究心肌收缩性能与氧耗。该模型为心血管生理学研究提供了重要的实验平台。

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本文所述设备和实验由波士顿儿童医院心脏病科以及Haseotes家族的慈善捐赠资助。我们感谢Frank McGowan博士和Huamei He博士为我们提供该模型的早期使用经验，感谢Lindsay Thomson在插图制作方面提供的帮助。

本方案在机构动物护理与使用委员会的现行方案下进行。
1. 研究的准备工作
<ol>
	<li>打开水浴锅，加热 Krebs-Henseleit 缓冲液（KHB）储液罐（设定为 42 °C）。</li>
	<li>配制 16 L 的 KHB 溶液，其成分如下（单位为 mM）：128 NaCl、5.7 KCl、1.3 MgSO4、25 NaHCO3、2.7 CaCl2、0.53 EDTA、0.54 NaC3H3O3 和 10.8 葡萄糖13。各成分的质量分别为：27.584 g NaCl、1.58 g&#160; KCl、0.578 g MgSO4、8.401 g NaHCO3、1.47 g CaCl2、0.744 g EDTA、0.22 g NaC3H3O3 和 7.208 g 葡萄糖。 
	注意：这些成分可预先以粉末形式分装于锥形管中，于实验当天现用现配。
	<ol>
		<li>使用 0.22 微米滤膜过滤 4 L 去离子水。</li>
		<li>取 3.7 L 上述水加入 4 L 烧杯中，除 CaCl2 外，将所有成分加入水中。</li>
		<li>在另一烧杯中，将 CaCl2 溶解于剩余的 300 ml 水中。</li>
		<li>以 95% O2 / 5% CO2 混合气体以 1 L/min（LPM）流速通气 5 分钟，以调节 pH 至 7.40，并促进 CaCl2 的溶解。</li>
		<li>将溶解后的 CaCl2 溶液加入其余 KHB 溶液中。</li>
		<li>将配制完成的 KHB 加入储液罐，循环通过所有管路 30 分钟，确保系统中无肉眼可见气泡。以 0.5 LPM 流速持续通入 95% O2 / 5% CO2 混合气体。 
		注意：KHB 可在冰箱中冷藏保存过夜，但不得超过 1–2 天；使用前需恢复至室温并重新过滤。禁止在不同实验间重复使用 KHB。</li>
		<li>准备两个洁净的 50 ml 烧杯，各装入冰冻 KHB，并置于解剖台附近的冰桶中。在取出心脏前，确保 KHB 处于冰冻状态（而非仅冷却）。</li>
		<li>根据制造商说明，在校准前将微型压力-容积（PV）导管置于装有滤过 KHB 的 10 ml 注射器中浸泡 30 分钟。 
		注意：用于浸泡 PV 导管的 KHB 温度应尽可能接近 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备动物麻醉及解剖操作台。
	<ol>
		<li>确保异氟烷储罐中有足量麻醉剂。用 1 ml 注射器抽取 500 U 肝素，并安装 26 号（1/2&#34;）针头。准备好用于麻醉动物的面罩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设定主动脉阻断灌注压为 80 mmHg，左心房（LA）阻断灌注压为 10 mmHg。打开主动脉阻断和左心房阻断通路，使温热 KHB 缓慢滴出。在准备解剖动物时，打开主动脉阻断，使 KHB 保持稳定缓慢滴注。</li>
	<li>根据制造商说明校准 PV 导管。</li>
</ol>
2. 动物准备与解剖
注意：为获得最佳结果，应确保动物体重在 300 至 500 g 之间；我们发现，对于本系统而言，动物体重在 425 至 450 g 之间最为理想。
<ol>
	<li>在麻醉舱中使用异氟烷（1 - 2%）对动物进行麻醉，直至动物失去意识。将动物转移至解剖台，并为其佩戴含有异氟烷和氧气的麻醉面罩。通过脚趾夹捏测试评估镇静程度。在动物眼睛上涂抹兽医用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>腹腔内注射500单位肝素。静置10分钟，使肝素充分吸收。用胶带固定动物四肢，以更好地暴露胸腔。</li>
	<li>心脏解剖。
	<ol>
		<li>确认对脚趾挤压无反应后，用镊子将皮肤从腹腔提起，然后用剪刀沿膈肌弧度剪开腹膜腔，直至肋骨后缘。</li>
		<li>一旦可见膈肌，使用小剪刀沿膈肌前表面，顺着先前切口的方向剪开，以进入胸腔。将切口沿两侧腋线向腋窝方向延伸。 
		注意：由于膈肌切开后通气功能将受到影响，因此接下来的步骤应迅速完成。</li>
		<li>用镊子从剑突处向前方牵拉肋骨。切开心包膜和胸膜。</li>
		<li>在膈肌上方识别下腔静脉（IVC）和主动脉，并将其牵开 整块 使用钝头镊子向前操作。</li>
		<li>使用大型弯剪，迅速在下腔静脉和主动脉上剪开切口，并将心脏和肺部从胸腔中取出 整块切断食管、气管、头臂动脉和静脉的头侧部分，以移除胸腔内的心脏和肺脏。将胸腺组织随此组织块一并切除。注意避免损伤升主动脉的近端部分。</li>
		<li>立即将心脏和肺浸入冰冻的KHB溶液中，并转移至此前已按步骤1所述设置好的Langendorff装置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 主动脉插管
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将心肺复合体置于平皿中，使胸腺和大血管面向实验者，肺的背侧面向台面。分开胸腺的两个叶，辨认头臂动脉从主动脉的起始处。
	<ol>
		<li>将主动脉搭在平皿边缘，用小剪刀在主动脉瓣上方约 5 mm 处、右锁骨下动脉起始处近端横断主动脉。 
		注意：切口应形成一个完整的圆形横截面。如果切口角度偏斜（即呈宽椭圆形）或不完整，应重新切割以达到理想效果。这有助于高效完成主动脉插管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用两对弯头镊子分别夹住主动脉两侧，引导主动脉套入主动脉插管（插管应持续缓慢滴注KHB）。主动脉瓣应位于插管尖端下方 1 - 2 mm 处。
	<ol>
		<li>完成主动脉插管后，将镊子垂直交叉夹于主动脉上以固定位置。或者，可在主动脉上放置一个小夹子以固定心肺复合体，使单个实验者即可完成该模型操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>请助手在镊子下方穿过一根4-0丝线，围绕插管进行结扎，并在心脏前后多次打结固定。完全打开插管以启动逆向主动脉灌注。观察心脏是否有力搏动。 
	注意：如果心脏未迅速开始有力搏动（~ 200 次/分钟），则结扎线或插管可能阻塞了一侧或双侧冠状动脉。若怀疑如此，应拆除结扎线并重新定位，使其远离冠状动脉。如果心脏膨胀且无搏动，插管可能已穿过主动脉瓣。若冠状动脉出现渗漏（KHB从主动脉根部喷出），应将插管向主动脉瓣方向推进（此现象可能因误将头臂动脉当作升主动脉插管所致）。</li>
</ol>
4. 肺静脉闭塞及肺动脉插管准备
注意：此步骤的目的是建立一个封闭的左心房系统，以确保来自左心房阻塞的所有容积和压力均传递至左心结构。若未能完全闭合肺静脉，可能导致前负荷不足，进而歪曲实验结果或造成工作心脏制备状态不稳定。
<ol>
	<li>切除胸腺以更好地暴露肺动脉（PA）。</li>
	<li>手动旋转主动脉插管，使心脏后侧面向操作者。解剖出通向右肺的血管。用镊子夹住右肺组织，进一步分离这些血管。使用中大型外科夹（或缝线），用单个夹子同时阻断右肺动脉、肺静脉和支气管。在夹子远端切除右肺。
	 
	注意：由于在跳动心脏模型中难以充分游离肺动脉，我们的操作常规是先阻断肺静脉，使肺动脉扩张，从而更易于切开，同时避免损伤邻近结构。</li>
	<li>对左肺重复步骤4.2。
	 
	注意：潜在问题及解决方案：当双侧肺动脉均被阻断后，右心房会明显扩张，心脏可能出现心动过缓。这是因为右心室压力升高所致。如果未出现此现象，可能是肺静脉未完全阻断，导致前负荷不足以维持工作心脏模式。如果在左心房（LA）插管并尝试转换为工作心脏模式后（见下文），心脏仍无法维持心输出量，应考虑在肺静脉残端加用额外夹子或结扎，以阻断任何残留漏血。然而，一旦肺动脉被阻断，应立即进行步骤5，以尽量减少心肌缺血。需注意，部分研究者会在结扎肺静脉之前先行切开肺动脉，以避免右心室压力升高。</li>
	<li>肺动脉切开
	<ol>
		<li>旋转主动脉插管，使心脏前侧面向操作者。确认肺动脉位置。该动脉可能已扩张。使用小剪刀，在肺动脉瓣上方约3 mm处做一横向切口。
		 
		注意：此举将立即缓解压力，心率可能随之上升。由于该插管容易移位，应在完成左心房插管后再进行肺动脉插管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 左心房插管
<ol>
	<li>旋转主动脉插管，使左心房面向操作者。使用小剪刀在左心房上部做一 2 - 3 mm 的切口，位置约在房室沟上方 3 mm 处。
	<ol>
		<li>将左心房插管垂直于二尖瓣平面放置，并指向房间隔方向。</li>
		<li>打开左心房插管，直至Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）开始流动。确保KHB触感温暖（若置于无加热套管路中会迅速变冷），以避免因低温导致心脏转入工作模式后出现心肌功能障碍。插管期间应调整为滴注速度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子施加反向牵引力，将心房插管插入左心房体部，注意避免用力过大，以防撕裂心房。 
	注：左心房插管应放置于心房中央，且对心房壁无张力。</li>
	<li>用4-0丝线围绕左心房体部穿过并打结，以在插管周围形成密封。注意确保缝合包含左心房后壁部分。根据需要添加额外缝线。密封完成后，将插管向后回拉 1 - 2 mm，使其位于心房中央，而非紧贴房间隔。 
	注：心脏转入工作模式后最常见的灌注不良原因是左心房插管紧贴房间隔，导致左心房流入道受阻。当插管位置正确时，左心房压力波形通常会呈现出清晰的a波和v波（见图2E）。</li>
	<li>完全打开左心房插管阀门，以向左心房施加充分的前负荷。监测心脏流出的滴速（来自冠脉流出液）。当左心房插管打开时，应确保滴速无变化。若滴速改变，则表明系统存在泄漏，需按照步骤6.4所述重新缝合心房。</li>
</ol>
6. 肺动脉插管及向工作心脏模式转换
<ol>
	<li>若需测定心肌耗氧量（或冠状动脉流出液中的其他物质，如药物浓度或细胞因子），将1/32&#34;的柔性导管插入肺动脉先前的切口内。 
	注：心肌耗氧量通过左心房灌注液与肺动脉流出液之间的氧含量差来测定。2
	<ol>
		<li>为连续测量心肌耗氧量，可使用在线氧电极比较左心房和冠状窦流出液的氧含量。</li>
		<li>收集冠状窦流出液（包括来自肺动脉及心脏滴下的液体）至带刻度的量筒中，以定时定量测定冠状动脉流量。</li>
		<li>按先前所述方法计算心肌耗氧量。2</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过关闭逆行主动脉泵，转换至工作心脏模式。 
	注：此时左心房压力成为前负荷压力，而此前在Langendorff模式下为逆行泵提供阻力的阻力器，现在则对心输出量产生阻力，从而形成平均动脉压。若平均动脉压下降至约80 mmHg以下，原因可能与前负荷或心肌功能有关。最常见的问题是左心房插管位置不当，此时应重新启动逆行泵后调整插管位置。</li>
</ol>
7. 左心室压力容积导管的插入
注意：压力-容积（PV）导管可通过逆行方式（经主动脉瓣）或心尖穿刺方式放置。逆行法的优点在于导管位置更为稳定，且避免了心尖穿刺及其相关的冠状动脉损伤或前负荷丢失等风险。然而，逆行放置有时可能非常困难，因此本文将介绍这两种技术。
<ol>
	<li>将一根1.4 French的压力-容积导管连接至压力-容积环系统。根据制造商说明，在温热的KHB溶液中校准系统。确保实时可见波形。将导管和电缆尽量靠近左心室（LV）表面放置，以避免置入后发生移位。</li>
	<li>进行逆行置入时，打开可调节阀门，轻柔地将PV导管经主动脉瓣送入，直至获得稳定的压力和容积波形。避免使用过大力量，以防损伤主动脉瓣或刺穿心室心尖部。 
	注意：我们发现，尽量减少PV导管在接近主动脉瓣（AV）时所需通过的管路长度和弯折次数非常重要。必要时可剪短系统附带的管路。</li>
	<li>进行心尖部置入时，使用24 G套管针在左心室（LV）心尖处穿刺。注意避开左前降支冠状动脉。从心室心尖部将针尖指向主动脉瓣方向。将压力-容积导管推进至左心室腔内。一旦识别到左心室压力和容积波形，即停止推进导管。</li>
	<li>压力-容积导管就位后，将水浴套管移至心脏周围适当位置。用一小段胶带将导管固定在水浴套管壁上。</li>
	<li>在开始任何测量或干预操作前，确保系统至少稳定30分钟。</li>
</ol>
8. 药物输注
<ol>
	<li>（可选）输注药物（例如， 使用标准药物泵将多巴胺注入左心房阻滞部位。 
	注意：由于流经心房组织块的灌注液流量相当于整个心脏的输出量，我们已根据整个动物的体重来计算给药剂量；其中仅有小部分灌注液流经冠状循环，与体内情况相似。 体内或者，可配制含有预设浓度药物的第二套灌注液，用于心脏灌注。 
	注意：在本方案中，我们将在12分钟内输注药物，并在每次输注的最后10分钟内采集生理数据，与紧接其前的10分钟基线期数据进行比较。</li>
</ol>
9. 生理学操作
<ol>
	<li>心率
	<ol>
		<li>（可选）将两根起搏导线缝合至右心房壁，并连接至临时起搏装置。 
		注意：这可实现对心率（高于自身窦性心率）的精确控制，并独立于正性肌力药物来理解心率与心肌收缩力之间的关系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前负荷
	<ol>
		<li>通过调节供给左心房模块的液柱高度，改变前负荷（定义为左心室舒张末期容积）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血压
	<ol>
		<li>使用 IH-51 上的压力阀门调节血压（在此模型中为后负荷的主要决定因素）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冠状动脉氧含量
	<ol>
		<li>通过用不同气体混合物饱和的克氏液（KHB）灌注心脏，实现不同程度的心肌缺氧。为此，应使用独立的带夹套储液器（每个储液器配有独立的气体混合物），以确保气体与克氏液之间达到平衡。</li>
		<li>通过结扎远端冠状动脉，实现冠状动脉缺血。 
		注意：在工作心脏模式下结扎近端冠状动脉可能导致致命性心肌功能障碍。</li>
		<li>通过中断或延迟逆行灌注一段特定时间，诱导全心冠状动脉缺血。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该工作心脏模型可全面控制心室前负荷、后负荷、灌注液氧张力以及心率，从而实现对心室功能的评估。此外，该模型还可在排除后负荷和前负荷影响的情况下，独立评估正性肌力药物对心肌的内在作用效果，这是其他方法无法实现的 体内 模型。由于该模型采用晶体灌注液，可在无血红蛋白干扰的情况下评估心肌组织，从而简化对心肌能量状态的光谱分析等研究。14 在此模型中，尽管可以对右心房进行插管，但我们的操作并未将其作为常规插管部分。我们有意选择不进行右心房插管，以便采集冠状窦血流用于评估心肌耗氧量。然而需要强调的是，在该模型中右心仍需完成压力和容量做功，因其需将冠状窦血流泵入肺动脉插管。提供一定的右心室前负荷有助于改善室间隔的位置，并增强左心室功能，这是本模型的重要组成部分。15
有几点实验中的潜在问题需要指出。首先是初始的逆行插管，应迅速完成（即在不到2分钟内完成操作，以尽量缩短缺血时间。最关键的技术是高效地分离、准备和处理升主动脉。主动脉残端不宜剪得过短，以免在主动脉瓣上方留出的插管空间不足；但也不宜过长，否则可能导致主动脉围绕插管发生扭转。此外，主动脉插管与主动脉根部的尺寸应匹配得当。若主动脉过大而插管过小，也可能导致主动脉根部在插管上发生扭转。右锁骨下动脉通常从升主动脉发出，位置约在主动脉瓣上方7 mm处。在游离和修剪主动脉过程中，识别头臂动脉分支（直径约1 mm）可作为横向主动脉切口的重要解剖标志。建议在第一支头臂动脉起始处稍下方修剪主动脉。若将该血管包含在修剪后的主动脉根部内，通常会导致Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）泄漏，并在转换为工作心脏模式时丧失主动脉根部压力。
插管的另一个技术难点是左心房插管。尽管可以对左心耳进行插管，但我们发现导管常常卡在左心耳内，难以顺利进入左心房主体。因此，我们更倾向于在左心房主体部位做切口，位置大约在房室沟上方2 mm处。在插入导管前，必须将其置于合适的平面，以避免在固定导管时撕裂壁薄的左心房。
我们发现左心房切口的理想大小约为 3 mm。切口过小可能使左心房插管的放置更加困难，并可能导致左心房撕裂。我们在左心房阻断块上使用一段直的、8 mm 长、斜面的不透氧管路（内径 2.9 mm）。我们发现，与使用带斜面边缘的插管相比，使用这种管路可实现最稳定的左心房插管，并有助于固定左心房阻断块。无论使用何种管路，都必须确保管路末端不被房间隔或二尖瓣阻塞（如上图所示，我们发现左心房压力波形在此方面具有指导意义），因为心房插管的轻微移动都可能显著改变左心室前负荷及由此产生的血流动力学测量结果。出于同样原因，打开左心房阻断块后，必须确保左心房无渗漏。无论使用何种类型的管路，都必须确保该系统内的管路具有不透氧性，以保障向心脏充分供氧。
该操作中另一个技术上具有挑战性的环节是压力-容积（PV）导管的放置。我们最初倾向于通过主动脉阻断处逆行插入导管。尽管该方法在技术上可行，但我们发现经心尖穿刺放置PV导管更为简便快捷。在整个实验过程中必须密切监测导管的位置，因为导管有时可能会移入或移出左心室。可通过持续观察压力和容积随时间变化的波形来实现监测。
最后，应注意确保每次实验均使用新鲜配制的KHB溶液。可预先将KHB的各组分称量后以粉末形式分装于锥形管中保存。在实验当天，将这些粉末与无菌过滤水、二氧化碳/氧气混合，并向混合液中加入钙。此外，使用具有酶活性的粉状清洁剂（如Tergazyme或类似产品）清洗系统，并定期更换灌注液滤器，也十分重要。
该实验制备方法存在若干局限性，需予以注意。首先，与所有晶体灌注的Langendorff制备方法类似，KHB及其他无血灌注液相对于血液具有显著降低的携氧能力。尽管通过冠状动脉扩张和超生理水平的冠状动脉流量可在一定程度上代偿这一缺陷，但该制备方法因此仍不完全符合生理状态。其次，由于本仪器中使用的Windkessel腔室具有近乎无限的顺应性，收缩压与舒张压之间的分离程度极小（见图2A），导致冠状动脉灌注压不符合生理条件。这一问题在未来模型中可通过在后负荷模块中引入弹性元件加以克服。第三，与所有离体心脏制备方法一样，心脏会经历一段明确的（2–3分钟）温缺血期，这很可能导致心肌损伤或功能障碍。通过熟练掌握技术以尽量减少此类损伤，对于获得具有代表性的结果至关重要。此外，尽管吸入性麻醉剂的使用出于动物福利的必要考虑，但在再灌注早期可能对心肌产生抑制作用，不过预计随着心脏被KHB再灌注，这种效应会迅速消除。
所述的工作心脏系统可用于开展多种与患者护理、科研及教学相关的生理学研究。通过一些额外的改进，该系统还可用于模拟与先天性心脏病相关的重要生理状态，包括肺动脉高压和单心室生理。其局限性在于这是一种离体（ex vivo）制备模型，且心脏由缓冲液而非含氧量更高的血液进行灌注。

离体器官的研究能够实现对生理条件的控制，其程度超过了体内（in vivo）实验所能达到的范围。离体（ex vivo）心脏制备方法最早由 Otto Langendorff 描述1，他建立了一种逆行灌注的离体模型。随后，其他研究者提出了“工作心脏”&#34;&#34;模型，在该模型中心肌同时完成压力功和容量功2。此类制备方法在阐明心肌活动机制3、心肌代谢过程4-6以及强心药物作用效应7-9方面发挥了关键作用。
在危重患者中，使用增强心肌收缩力的药物较为常见。然而，目前关于这些药物对心肌收缩力和心肌氧耗量相对影响的比较数据较为有限，而这些数据对于有心力衰竭临床表现的患者或术后患者的治疗可能具有重要价值。10 但由于大多数强心药物不仅影响心肌本身，还会影响小动脉阻力、静脉容量11以及患者的代谢率12，因此离体（ex vivo）分离心脏模型仍是研究此类药物对心肌本身作用的最佳方法。
我们描述了一种的使用方法 离体 用于在不受负荷影响的情况下研究正性肌力药物对心肌功能和氧耗影响的模型。采用左心室工作心脏模型对Sprague Dawley大鼠心脏进行插管，并使用改良的Krebs Henseleit灌注液进行灌注。控制主动脉压和左心房压。通过心尖穿刺将压力-容积阻抗导管置入左心室，以连续监测收缩和舒张功能。通过测定左心房灌注液与肺动脉流出液之间的氧含量差异，并进行指数化处理，连续测量氧耗量。待测药物被注入左心房回路，记录心脏功能和氧代谢的变化，并与紧接之前的基线值进行比较。

<table><tbody><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>8.401 g/4 L</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>0.744 g/4 L</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>1.580 g/4 L</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>0.578 g/4 L</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>0.220 g/4 L</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>27.584 g/4 L</td></tr><tr><td>右旋葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>7.208 g/4 L</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>1.470 g/4 L</td></tr><tr><td>双心室工作心脏模型</td><td>Harvard Apparatus</td><td>IH-51</td><td></td></tr><tr><td>压力-容积导管</td><td>Millar, Inc</td><td>SPR-944-1</td><td>使用6 mm间距导管</td></tr><tr><td>LabChart Pro 8</td><td>AD Instruments</td><td>Version 8.1</td><td></td></tr></tbody></table>

用于心肌功能与氧耗研究的啮齿类动物工作心脏模型

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

离体工作心脏模型已被用于研究负荷条件、心率和药物对心肌功能的影响，这些研究是无法通过其他方法实现的 体内例如，正性肌力药物通常也会影响前负荷和后负荷，从而无法对其心肌效应进行负荷无关的评估 体内此外，该模型可在不受到体循环静脉回流污染的情况下采集冠状窦流出液，从而评估心肌耗氧量。同时，微型化压力-容积导管的出现使得能够精确定量收缩期和舒张期功能的多种指标。本文描述了一种可在受控条件下，使左心室同时进行容积和压力做功的模型，用于相关研究。 
该技术中，在全身麻醉下整体切除一只 Sprague-Dawley 大鼠（体重 300–500 g）的心脏和肺脏。游离主动脉并插管，用于以含氧 Krebs 缓冲液进行逆向灌注。结扎肺动脉和肺静脉，并将肺脏从标本中移除。随后切开左心房，并使用另一根静脉插管插入，连接至前负荷控制模块。确认无泄漏后，对左心进行负荷加载并停止逆向灌注，从而建立工作心脏模型。切开肺动脉并插管，用于收集冠状静脉流出液并测定心肌耗氧量。将压力-容积导管经逆向途径或心尖穿刺插入左心室。如有需要，可放置心房起搏导线以更精确地控制心率。该模型可精确控制前负荷（使用左心房压力控制模块）、后负荷（使用后负荷控制模块）、心率（使用起搏导线）以及氧张力（通过灌注液中的氧气混合气体）。

完全仪器化的心脏在逆向灌注（图1A）和左心室工作心脏模式下（图1B）的示意图。图2A - D展示了典型的主动脉、左心房和左心室压力及容积波形。在此模型中，典型的舒张末期压力约为3 - 5 mmHg，收缩期峰值压力约为100 mmHg。图2E显示了在插管放置和定位过程中，当左心房插管移离房间隔时，左心房波形的变化。在这些实验中，主动脉压力设定为90 mmHg，左心房压力设定为10 mmHg。
为了检测儿茶酚胺的作用，将每个生理参数（主要来源于压力-容积导管及其配套软件）与紧邻的基线期进行比较。在所示示例中，多巴胺以15 μg/kg/min的剂量注入左心房腔室。尽管在两种条件下舒张末期压力相同（由于本模型中固定了心房压力），左心室舒张末期容积减少了2.5%，左心室收缩末期容积减少了4.9%，从而导致每搏输出量增加（图3A）。与安慰剂输注相比，治疗剂量多巴胺使左心室每搏功（定义为压力-容积环路内的面积）增加了32%（图3B，P &lt; 0.001，t检验，每组n = 10）。这一变化伴随着心肌氧耗量相对于安慰剂输注的更大增幅（图3C）。通过这种方法，可在不受负荷条件影响的情况下，相互比较不同强心药物及其剂量的相对效力与能量消耗。
<img alt="显示主动脉阻断和压力-容积导管的心脏血流示意图；描绘了灌注动力学。" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 逆行灌注和工作心脏模式下完全置入仪器的心脏血流示意图。（图A： Langendorff模式；图B： 工作心脏模式。在逆行模式下，Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）以设定的灌注压力注入主动脉根部。该模式用于在缺血后恢复心肌功能以及置入仪器期间的心肌保护。在工作心脏模式下，灌注液先流经左心，再进入冠状循环。在此模式中，心肌必须自主产生其灌注压力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏压力-容积波形；主动脉根部、左心房、左心室压力和容积随时间变化的示意图。" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：基线测量期间获得的典型压力与容积记录曲线。（A） 主动脉根部压力，（B） 左心房压力，（C） 左心室压力，以及 （D） 基线测量期间的左心室容积记录曲线。每搏输出量、每搏功、心输出量、tau 值及其他参数可由软件自动实时计算并显示。在工作心脏模式下，左心房记录曲线低平 （E） 且伴随心输出量降低，可能提示插管在左心房内位置不当。请注意，在插管位置良好的情况下，左心房压力曲线中出现明显的 v 波较为常见，可能与动物完全置入仪器后左心房顺应性降低有关。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏功能图；心室压力-容积图，附每搏功和耗氧量的柱状图。" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3：多巴胺对压力-容积曲线的影响。 多巴胺输注导致压力-容积（PV）曲线向左移动（A），表现为每搏输出量增加、收缩末期容积减小，与基线测量值相比差异明显。需注意，由于缺乏动脉和静脉弹性，这些PV曲线中某些组成部分的形态与通常在体内测得的曲线有所不同（见图 4）。（B） 与紧接其前的基线状态相比，多巴胺输注期间每搏功的增加显著高于安慰剂组（**，P = 0.0017，t检验），心肌耗氧量也显著升高（*，P = 0.013，t检验，C）。在本模型中，基线时平均心肌耗氧量为0.22 ± 0.02 mmol O2/克组织/分钟，该计算基于在40 °C条件下生理盐水中溶解氧含量估计值165 µmol/L。此类测量可用于比较不同药物对心肌耗氧量的影响。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="压力-容积关系、心动周期示意图；ESPVR/EDPVR、弹性、收缩力、前负荷。" src="/files/ftp_upload/54149/54149fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4： 压力-容积环分析。所示理论压力-容积环描述了正常心动周期。 主动脉瓣（AV）关闭后 (1)，发生等容舒张 (1 - 2)，此时心室压力下降至低于心房压力。该阶段持续时间用 Tau 表示。随后，在心房收缩的同时二尖瓣（MV）开放，使心室充盈 (2 - 3)。接着，心室开始收缩，经历等容收缩期 (3 - 4)，直至心室内压力超过舒张期动脉压，此时 AV 打开。每搏输出量为 1 - 2 与 3 - 4 两条线之间的差值。每搏功为 1 - 2 - 3 - 4 曲线所围成的面积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

离体工作心脏模型可用于评估负荷条件、心率和药物对心肌功能及氧耗量的影响。本文描述了制备啮齿类动物左心工作模型的方法，该模型可在不同条件下用于研究收缩期和舒张期功能以及氧耗量。

离体工作心脏模型已被用于研究负荷条件、心率和药物对心肌功能的影响……

本实验的总体目标是建立一种可精确控制啮齿类动物心室负荷条件的离体左心工作心脏模型。该方法有助于回答心血管生理学中的关键问题，包括药物对心肌收缩力、织物性能以及耗氧量的影响。该技术的主要优势在于能够对心脏的负荷条件进行精确控制。该方法的可视化演示至关重要，因为主动脉的解剖与分离、左心耳的去颗粒化以及肺静脉的分离均需经过训练和实践才能熟练掌握。在对供体大鼠实施适当的镇静、镇痛以及肝素抗凝后，开始手术操作。首先，用镊子将腹部皮肤拉开，然后使用剪刀切开腹膜腔。沿膈肌曲线向后至肋骨后角。一旦可见膈肌，使用剪刀沿膈肌前表面，与先前切口平齐剪开，以进入胸腔。将切口沿双侧腋前线延长至腋窝。然后用镊子从剑突处向前方牵拉肋骨。接着切开心包膜和胸膜。由于膈肌被切开后通气功能会受损，因此后续操作应迅速进行。在膈肌上方识别下腔静脉和主动脉，并使用钝头镊子将它们向前方阻滞牵开。接着，使用大型弯剪迅速横断下腔静脉和主动脉。在不切断升主动脉的情况下，切断食管、气管、头臂动脉及头臂静脉。然后将胸腺组织连同心肺整体切除。立即将心肺组织浸入冰冻的KHB溶液中，并转移至Langendorff装置。将心肺复合体置于平底培养皿中，调整心脏方向，使胸腺及大血管面向实验操作者。肺的后部朝向台面。接着，分开胸腺的两个叶，辨认出从主动脉发出的头臂动脉。现在将主动脉搭在培养皿边缘。然后使用小剪刀，在主动脉瓣上方约五毫米处、右锁骨下动脉起始部近端横断主动脉。需要获得一个圆形的横截面。持续重复切割，直至形成理想的横断面。以下视频显微技术清晰展示了该操作中的关键步骤——为插管做准备而进行的主动脉分离与横断。如图所示，应从中间切开胸腺，即可轻松将其分开。使用弯头镊子轻轻操作，以分离心包膜并梳理主动脉周围组织。避免使用过度力量。应辨认无名动脉残端，并将其作为主动脉牵引的着力点。随后，于主动脉瓣与锁骨下动脉起始处之间的中点位置，使用小型锐利剪刀横向剪开主动脉。若切断位置过高，主动脉会变得冗余，可能导致心脏围绕插管发生扭转。此外，臂头动脉残端可能出现克氏缓冲液泄漏。若切断过短，插管尖端可能穿过主动脉瓣。接下来，使用两把弯头镊子将主动脉引导至主动脉插管上，插管内应缓慢滴加KHB。主动脉瓣应位于插管尖端下方1至2毫米处。然后，将镊子重新垂直夹住主动脉，以固定主动脉位置。也可使用夹子固定。然后让助手使用4-0丝线在心脏两侧对套管进行多重打结以固定。现在完全打开套管，开始完全的逆行主动脉灌注。心脏应有力地跳动。其中一个可能的陷阱是主动脉插管尖端穿过主动脉瓣进入左心室。如图所示，如果发生这种情况，心脏将显得苍白，左心房会膨胀。必须立即纠正，方法是短暂停止冠状动脉血流，并将心脏重新向下放置到主动脉套管上。需要注意的是，啮齿类动物的主动脉组织较为脆弱，容易撕裂。另一个潜在问题是主动脉根部出现泄漏，可能是由于组织撕裂，或主动脉切口过高所致，导致头臂动脉漏出KHB。这可以通过停止冠状动脉血流，将心脏从主动脉插管上取下并重新定位来解决。此步骤的目的是建立一个封闭系统，使前负荷块产生的所有压力均能传递至左心结构。若未能完全阻断肺静脉，则可能导致前负荷丢失，造成心脏制备不稳定，或使结果失真。手动旋转主动脉插管，使心脏的背侧朝向操作者。随后解剖通向左肺的血管。为便于暴露血管，可用镊子提起左肺组织。然后使用一个中号外科夹夹闭左侧肺动脉、肺静脉和支气管。接着，在夹闭远端切除左侧肺。现在对右侧肺重复此操作。当两条肺动脉完全阻塞时，右心房将扩张，心脏可能出现心动过缓。根据需要，可增加夹子或缝线以封堵漏口，并高效操作。现在进行肺动脉切口。旋转主动脉插管以暴露心脏的前表面，并识别肺动脉。使用小剪刀，在肺动脉瓣上方约三毫米处做一横向切口。肺动脉可在后续步骤中进行插管。接下来，插管左心房。观察左心房时，使用小型剪刀在左心房上部、房室沟上方约3毫米处做一个2至3毫米的切口。然后将左心房插管垂直于二尖瓣平面放置，方向指向房间隔。打开左侧前灌注管，直至可见温热的KHB缓冲液开始流动。确保KHB触感温热，以免发生低体温。在插管过程中，将KHB的流速调整为滴注速度。现在，用镊子夹住以提供反向牵引力，将心房插管插入左心房主体内。切勿使用过大力量，因为心房组织较为脆弱。调整插管位置，使其位于心房中央，且对心房壁无任何张力。现在用4-0丝线在左心房主体周围（包括左心房后部）缝合一针，将套管固定于心房。根据需要可添加额外缝线。密封后，将套管向后回撤1至2毫米，使其位于心房中部，而非紧贴房间隔。可通过观察左心房波形来确认这一点。现在完全打开插管阀门，以向左心房施加全部的前负荷。监测心脏滴速至关重要。当套管打开时，应保持稳定。若不稳定，需重新结扎套管周围的左心房以封堵可能引起问题的漏液处。为检测冠状静脉流出液中的物质（如气体、药物或细胞因子），可将柔性导管插入肺动脉切口。为了实现压力和容积的连续测量，将一根经过校准的压力-容积导纳导管插入左心室。最佳方法是经主动脉瓣逆行插入。当此操作在技术上存在困难时，也可通过心尖部心室穿刺进行。DPDT 最大值应至少达到 3500 至 4000，以确保充分的制备。使用量筒收集来自肺动脉和心脏的冠状窦流出液，进行定时定量测定冠状动脉血流量。随后计算心肌耗氧量。最终，关闭逆行主动脉泵，以转换至工作心脏模式。逆行灌注按前述方法进行准备。在初始设置阶段，灌注流方向为逆行。当逆向泵关闭时，灌注液流向转为顺行，使心脏进入工作状态。在此模型中，典型的舒张末期压力约为3至5毫米汞柱，而收缩压峰值约为100毫米汞柱。当左心房插管移离房间隔时，可观察到左心房压力描记图发生改变。在这些实验中，主动脉压力设定为90毫米汞柱，左心房压力设定为10毫米汞柱。在一项实验中，多巴胺以每分钟每毫克15微克的剂量注入左心房阻断区。尽管舒张末期压力未改变，多巴胺使左心室舒张末期容积减少了2.5%，左心室收缩末期容积减少了4.9%，从而导致每搏输出量增加。与安慰剂输注相比，多巴胺治疗期间，以压力-容积环面积表示的左心室每搏功增加了32%。这也伴随着心肌氧耗量更显著的增加。一旦掌握，若操作得当，该技术可在15分钟内完成。

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