改进的肠道组织包埋卷制技术用于免疫组织化学和免疫荧光分析

该技术的总体目标是高效处理小鼠肠道组织的长段样本，以实现沿其全长均匀的组织学染色。在获取肠道切片时，整个肠道长度上的染色可能存在不一致。我尝试使用标准的瑞士卷技术，但发现其产生的肠道组织非常僵硬，难以展开。

经过一些尝试，我提出了一种快速固定方法，该方法使用毒性较低的化学试剂，并能显著改善肠道组织的瑞士滚切效果。这种改良的固定液也可用于快速固定其他较厚的组织。在操作前，根据文本方案对实验动物实施安乐死，并准备好手术环境。

首先，使用解剖镊和剪刀在腹部中线处做一侧向切口，切口位置位于肋骨下方约一至两厘米处，具体位置根据小鼠体型而定。然后轻轻分开并剪除皮肤，以暴露腹肌。接着，抓住腹肌并轻轻提起，注意不要夹住或牵拉肠道。

然后，小心地在腹肌上做初始切口，并仔细剪开腹肌以暴露肠管。现在辨认结肠，并沿其走向追踪至远端与直肠连接处。接着用剪刀尽可能靠近肛门开口处横断结肠。

接着找到胃与小肠的连接处，用剪刀在距离胃约一厘米处将肠管剪下。然后将游离的小肠和结肠整体转移至一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的干净培养皿中。接下来固定结肠的远端，轻轻展开整个结肠长度，去除附着的肠系膜组织。

然后识别盲肠，并在盲肠与结肠连接处横断肠道，从而分离出结肠。同样地，将剩余的小肠从相连的肠系膜结缔组织和脂肪组织中分离出来。随后在小肠与盲肠连接处横断小肠。

随后可移除并弃去盲肠。现在用改良的Bouin固定液填充一支10毫升注射器，并连接灌胃针。将针头插入肠段前端开口约0.5厘米深处。

在牢固固定灌胃针于肠段内部的同时，缓慢用固定液冲洗组织内容物。注意操作，压力过大会导致肠段破裂。如果小肠过长难以操作，可先将其切成三个等长的肠段，再分别进行冲洗。

固定会使肠段颜色变得不透明。接下来，用剪刀沿肠系膜缘将肠段纵向剪开，然后用镊子夹住肠段使其敞开，于盛有 PBS 的培养皿中短暂冲洗。随后将小肠切成三个等长的片段：近端、中段和远端，分别大致对应十二指肠、空肠和回肠。

从宏观上看，各节段之间没有明显的特征差异。务必做好标记，以区分每段的近端和远端。然后将一段组织管腔面朝上放置在培养皿的盖子上。

在结肠节段上，通过近端横跨其宽度的皱褶来识别管腔面。中段和远端区域具有一些纵向延伸的变异结构。在小肠上，通过较粗糙的表面来识别管腔面，该表面为绒毛的标志。

显微镜下观察显示，每个节段近端区域的绒毛最长，而结肠隐窝在近端区域最短，在中段达到最高。继续进行结肠的瑞士卷操作。将结肠平展打开，腔面朝上，用镊子从其近端向培养皿边缘方向牵拉。

保持管腔面朝上，用镊子夹住近端，将近端边缘缠绕在牙签上，并将缠绕的边缘紧贴牙签夹紧。然后缓慢而轻柔地将结肠围绕牙签卷成瑞士卷状。当整个结肠完全卷好后，用另一把镊子小心地将卷好的组织滑入组织处理盒中。

然后将组织盒转移至10%中性缓冲福尔马林中，在室温下孵育过夜。对一段小肠进行瑞士卷式处理时，将其管腔面朝上打开，用镊子从近端向培养皿边缘方向轻轻拉平。随后采用与结肠相同的技术方法卷成瑞士卷状，并用福尔马林固定。

采用所述方法，对C57黑6小鼠大肠进行HND染色，可清晰显示结肠各部分，从而实现全面的组织学评估。随后，该制备方法用于检测由LGR5启动子驱动表达EGFP的小鼠，该启动子仅在周围增殖性肠隐窝中具有活性。该EGFP转基因的外显率约为5%至10%，但目标区域仍可轻松识别。

使用具有 EGFP LGR5 表达的相同小鼠，对 KLF5 和 KI67 进行染色。首先研究了具有正常 LGR5 表达的对照小鼠。EGFP 阳性细胞用蓝色箭头标记，EGFP 阴性细胞用白色箭头标记。

随后在KLF5基因敲除小鼠中表达了相同的转基因。在EGFP阳性的干细胞中，KLF5与KI67的共染色缺失，但在EGFP阴性的隐窝中仍然存在。显然，用于多重荧光染色的样本制备质量非常好。

一旦掌握，若同时采集小肠和结肠，则每只小鼠的操作可在约15分钟内完成。请注意，使用Bouin固定液对眼睛有极高危害性，因此在进行该操作时，务必采取适当的眼部防护等安全措施。

感谢观看，祝您的实验顺利。