Name: 病毒颗粒和荧光微球侧脑室和血管内注入新生儿脑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 学习侧脑室和血管内注射病毒颗粒及荧光微球的方法，用于观察新生小鼠中枢神经系统急性感染期的病毒分布。该技术为神经病毒学研究提供直接的显微观察手段。

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作者感谢滨松医科大学再生与感染病理学系的金田正明先生、铃木宏美女士和川岛满惠女士提供的出色技术支持。本研究由日本促进科学基金（Japan Society for the Promotion of Science）资助，资助号为23590445。

所有实验方案均获得滨松医科大学动物护理委员会的批准。
1. MCMV（Smith株）及重组M32增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-MCMV的制备
<ol>
	<li>根据以下方法（1.2 - 1.9）及先前所述方法，生成重组M32-EGFP-MCMV8.</li>
	<li>使用源自野生型MCMV Smith株（登录号：U68299）的重组病毒。将EGFP（4,361个碱基对；bp）插入至37,089至41,450 bp之间（M32 - M31 通过同源重组在MCMV基因组中定位基因座（locus）。</li>
	<li>通过聚合酶链式反应扩增MCMV M32 (41,450 - 39,286 bp，左侧侧翼序列和 M31 （37,089 - 39,246 bp，右侧侧翼序列基因位点，使用以下引物： M32，5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3′（正向引物），5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3′（反向引物）； M31，5′-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3′（正向引物），5′-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3′（反向引物）。</li>
	<li>插入 M32 使用 NheI 和 BamHI 限制性酶切位点将目的片段插入 EGFP 表达载体中。插入 M31 位点插入到 M32-EGFP-使用 AflII 和 XbaI 位点切割重组质粒。 M32-EGFP-M31 使用 NheI 和 AflII 酶切序列 M32-EGFP-M31 重组质粒并溶于H2O.</li>
	<li>在感染MCMV（Smith株）后24小时（hpi），使用电穿孔系统将切割后的质粒转染至NIH3T3细胞的细胞核中，以诱导同源重组。</li>
	<li>感染后第3天，将细胞与未感染的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）按1/1,000的比例在六孔板中进行共培养，并筛选表达EGFP的感染细胞集落。</li>
	<li>从含有绿色荧光灶的孔中收集含病毒的上清液，并进行十倍稀释。用于纯化时，应选择呈现单个绿色荧光灶的孔。</li>
	<li>当有限稀释感染产生的所有病灶均显示EGFP表达时，表明病毒制备物已纯化，无野生型病毒残留。采用此前所述的噬斑测定法对病毒进行定量。17.</li>
	<li>在生物安全二级实验室的认证生物安全柜中操作MCMV，操作时需佩戴手套和口罩。</li>
	<li>传代MCMV（Smith株）及重组MCMV于源自12日龄ICR小鼠胚胎的MEF细胞中制备，方法如前所述17.</li>
	<li>通过在16 °C下以3,000 × g离心20分钟，从感染的MEF培养物上清液中去除细胞。</li>
	<li>将上清液在70,000 × g条件下超速离心40分钟。用1 ml Tris缓冲盐水重悬含有病毒颗粒的沉淀，并转移至预形成的线性山梨醇梯度（25% – 70%）上。再次于70,000 × g超速离心 g 60 分钟18.</li>
	<li>用注射器收集含有病毒颗粒的条带。将收集的病毒颗粒在70,000 × g条件下进一步超速离心40分钟，以获得病毒沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，于-80 °C保存，直至进行感染实验。</li>
	<li>采用此前所述的噬斑试验法测定病毒滴度19.</li>
	<li>通过荧光显微镜观察重组MCMV颗粒的EGFP表达（激发波长489 nm，发射波长508 nm）图1A以及通过透射电子显微镜（TEM）观察颗粒结构8 (图1B).</li>
</ol>
2. 罗丹明红荧光微球的制备
<ol>
	<li>购买羧基荧光尼罗红微珠，根据直径将500 µl微珠分装至离心管中（0.04 - 0.06 µm，约3.63 × 1012 粒子；0.1 - 0.3 µm，约5.75 × 1010 粒子；1.7 - 2.2 µm，约6.85 × 107 粒子）。</li>
	<li>用500 µl的0.1 M NaOH处理微珠约1天，以去除任何内毒素，随后在室温下将微珠重悬于无菌水中。</li>
	<li>使用前，在室温下用取自C57BL/6小鼠的10%小鼠血清对微珠进行过夜吸附处理。</li>
	<li>为分离聚集体，使用前需充分涡旋并超声处理微珠。</li>
</ol>
3. 新生小鼠脑室内注射MCMV和荧光微珠
<ol>
	<li>将怀孕的ICR小鼠饲养在温度受控、12小时光照/12小时黑暗循环的动物设施中。出生当天记为P 0.5。</li>
	<li>用70%酒精对10 µl注射器和27 G&#160;针头进行消毒。</li>
	<li>通过缓慢拉动注射器活塞，将含有MCMV或荧光微珠的注射液（5 µl）吸入针头中。</li>
	<li>将新生小鼠（P 0.5）置于冰上3–4分钟以进行固定。待动物进入麻醉状态后，采用脚趾夹捏反应法判断麻醉深度。</li>
	<li>使用无毒实验室记号笔标记注射位点，位置约为矢状缝外侧0.7–1.0 mm，前囟后方0.7–1.0 mm处（图2A）。</li>
	<li>在标记的注射位点，将针头垂直刺入颅骨表面以下2 mm深度。作为参考，可用无毒记号笔在针尖起始处2 mm位置做标记。</li>
	<li>缓慢将5 µl MCMV（约5 × 105 PFU）注入侧脑室，无需切开头皮（图2B）。</li>
	<li>在另一组小鼠中，采用相同方法注射含荧光微珠（0.1–0.3 µm，约5.75 × 108个颗粒）的5 µl溶液。</li>
	<li>停止推动活塞后10–20秒内缓慢拔出针头，以防止液体回流。</li>
	<li>将小鼠置于温暖容器中恢复5–10分钟，直至其活动能力和整体反应性恢复正常。</li>
	<li>按照第5节所述方法，在注射后不同时间点（3、12、24、48和72小时）取脑组织。</li>
</ol>
4. 新生小鼠的MCMV或荧光微珠静脉注射
<ol>
	<li>将新生小鼠（出生0.5天）置于冰上3–4分钟以进行固定。</li>
	<li>使用带有35 G针头的1 ml注射器，对出生0.5天的新生小鼠进行静脉注射MCMV。</li>
	<li>使用透射光源（静脉显像仪）观察浅表颞部（面部）静脉。注射前，用外科胶带将新生小鼠固定在透射光源装置上（图2C）。</li>
	<li>佩戴放大镜（1.5倍）的情况下，缓慢将50 µl的MCMV（约5.45 × 109 粒子）或荧光微珠（0.04–0.06 µm，约3.63 × 1011 粒子；0.1–0.3 µm，约5.75 × 109 粒子；1.7–2.2 µm，约6.85 × 106 粒子）注入浅表颞静脉（图2D）。</li>
	<li>拔出针头后，使用含70%酒精的纱布按压注射部位，直至出血停止。</li>
	<li>将新生小鼠置于温暖容器中约5分钟，待其恢复后再放回鼠笼。</li>
	<li>按照第5节所述方法，在注射后不同时间点（3、12、24和72小时）取脑组织。</li>
</ol>
5. 石蜡切片用脑组织样本的制备
<ol>
	<li>将注射后的新生鼠置于小型塑料培养皿中&#160;置于碎冰上。</li>
	<li>动物麻醉后，使用脚趾夹捏反应法评估麻醉深度。</li>
	<li>通过肋骨笼进行一次中央或两次末端的水平切割，以打开胸腔。</li>
	<li>用锋利的剪刀在心房处剪开切口。将4%多聚甲醛（PFA）溶液注入心房。当观察到自发性运动（PFA舞蹈）和肝脏颜色变浅时，停止灌注。无需放血。</li>
	<li>解剖新生个体（如前所述）20用剪刀剪去头部。</li>
	<li>沿颈部至鼻部的皮肤做正中切口，以暴露颅骨。</li>
	<li>将虹膜剪的尖端从一侧枕骨大孔插入，沿颅骨内表面小心滑动。</li>
	<li>向后颅骨表面的远端边缘做一切口，并在对侧做相同的切口。清除小脑周围的颅骨。</li>
	<li>小心地将一侧颅骨剥离，以避免损伤脑组织。在脑的另一侧重复此操作。</li>
	<li>使用解剖刀切断大脑腹侧表面的嗅球及其神经连接。</li>
	<li>用剪刀小心剪除连接脑组织与颅骨的残余硬脑膜，轻柔地将脑组织从头部分离，并取出脑。</li>
	<li>将脑组织置于含有4% PFA的固定液小瓶中，固定液体积至少为脑组织体积的10倍，在4°C下固定24小时。</li>
	<li>通过一系列梯度乙醇溶液对组织进行脱水以置换水分，随后用石蜡浸润，形成组织块。使用切片机将石蜡包埋的组织块切成4 µm厚的切片21.</li>
	<li>脱蜡并复水感染脑组织切片22继续进行 原位 石蜡包埋切片的杂交</li>
</ol>
6. 冷冻切片脑组织样本制备
<ol>
	<li>按照 5.1 - 5.11 步骤取出脑组织。</li>
	<li>为观察荧光微珠和 M32-EGFP-MCMV，将切除的脑组织置于平底冷冻模具中，加入包埋介质完全覆盖脑组织样本，用镊子夹住模具边缘，将其放入预冷的 n-己烷（-80 ºC）中速冻，随后固定于持样头。</li>
	<li>进行切片时，将冷冻组织块固定在预冷的恒冷切片机持样头上，连同持样头一起将冷冻组织转移至恒冷切片机腔室，将温度调至 -10 至 -20 °C，切取约 8 - 10 µm 厚的切片23。</li>
	<li>使用细胞固定剂（异丙醇与聚乙二醇的混合物）喷雾固定切片，喷雾后于室温下晾干 30 分钟，并将切片储存于 -80 ºC，待后续使用。</li>
	<li>将切片恢复至室温，用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 Griffonia simplicifolia isolectin B4 抗体以 1:100 的浓度在 PBS 中室温孵育 10 分钟（图 5），或用藻红蛋白（PE）标记的 CD31 抗体以 1:100 的浓度在 PBS 中室温孵育 30 分钟（图 6）对切片进行染色。</li>
	<li>用 PBS 洗涤切片三次。</li>
	<li>洗涤后，使用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对切片进行染色以显示细胞核。将切片封片于抗荧光淬灭试剂中，使用荧光显微镜观察 DAPI（激发波长 345 nm，发射波长 455 nm）、EGFP（激发波长 489 nm，发射波长 508 nm）和尼罗红（Nile red，激发波长 553 nm，发射波长 637 nm）信号（图 3、图 5、图 6）。</li>
</ol>
7. 用于石蜡包埋切片的荧光原位杂交（FISH）
<ol>
	<li>制备用荧光染料直接标记的DNA FISH探针 原位 使用含有完整MCMV DNA基因组的细菌人工染色体（pSM3fr）通过缺口平移法进行杂交19FISH探针的浓度为0.1 µg/µl。</li>
	<li>脱蜡并复水感染脑组织切片22.</li>
	<li>用 RNase（100 µg/ml 溶于 PBS）处理组织切片以检测病毒 DNA。</li>
	<li>使用0.05% NP40、0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）在95–98°C条件下进行抗原修复20分钟。将切片冷却至室温20分钟。</li>
	<li>在玻璃染色缸中，用纯水洗涤载玻片，每次2分钟，共洗三次。随后在37 °C下，使用0.06%胃蛋白酶、0.01 N盐酸溶液进行额外的抗原修复步骤，持续5分钟。</li>
	<li>在玻璃染色缸中用纯水冲洗载玻片，每次2分钟，共冲洗三次。</li>
	<li>将载玻片依次从70%乙醇转移至85%乙醇，再转移至100%乙醇，再次脱水组织切片。</li>
	<li>配制10 ml杂交缓冲液，混合1.25 ml 原位 杂交盐溶液（3 M NaCl，100 mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM 磷酸钠 pH 6.8，50 mM EDTA）中加入 5 ml 去离子甲酰胺、2.5 ml 50% 硫酸葡聚糖、250 µl 50x Denhardt 溶液、125 µl 100 mg/ml tRNA 和 875 µl H₂O2O.</li>
	<li>将直接用荧光染料标记的、可随机识别整个MCMV基因组的DNA探针加入杂交缓冲液中进行稀释。最终体积应为10 µl（7 µl杂交缓冲液，1 µl探针（0.1 µg/µl），以及2 µl蒸馏水）。</li>
	<li>将探针混合液（10 µl）加入每张载玻片，盖上盖玻片（15 × 15 mm），用橡胶胶水密封盖玻片。在85 °C下变性探针混合液5分钟，然后在42 °C下过夜完成杂交步骤。</li>
	<li>用0.3% NP40、0.4x SSC在73°C洗涤载玻片2分钟；用0.1% NP40、0.4x SSC在73°C洗涤1分钟；再用2x SSC洗涤两次。</li>
	<li>用 DAPI（10 ng/ml）对细胞核进行复染，然后加盖盖玻片。</li>
	<li>使用抗荧光淬灭剂封片，然后在荧光显微镜下观察DAPI（激发波长345 nm，发射波长455 nm）和EGFP（激发波长489 nm，发射波长508 nm）的荧光信号图4).</li>
</ol>

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<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863(2014).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在动物模型中，已采用脑室内注射（ICV）、腹腔注射、直接胎盘注射和静脉注射（IV）感染方法来研究病毒性脑炎的发病机制。我们选择新生小鼠的ICV和IV注射模型，因其操作简便，且可将病毒颗粒直接注入靶区域。尽管腹腔注射是一种较为简便的方法，但病毒颗粒通过间接途径在体内系统性扩散5,24。直接胎盘注射是研究胚胎期系统性感染的良好方法，但该方法需要特殊技术培训才能获得稳定结果，且成功率较低。此外，该感染方式需通过胎盘实现，属于间接过程，每次实验难以精确控制注入胎儿体内的病毒量6。由于新生小鼠对巨细胞病毒（CMV）等病毒高度易感，本研究能够在感染的极早期阶段比较病毒颗粒的分布与被感染细胞的分布情况。ICV注射模型有助于研究绕过血脑屏障（BBB）的病毒感染行为25，而IV感染模型则是一种模拟自然感染过程的系统性感染模型，包含病毒与血脑屏障之间的相互作用。
采用脑室内注射（ICV）方法时，我们确保针头至少深入颅骨2 mm。针头在脑室中保留约10 - 20秒，以防止液体从脑室回流26。若操作得当，脑室内注射是一...

在研究病毒性脑炎时，病毒颗粒的初始分布对于理解疾病发病机制以及确定病毒在脑内的靶细胞至关重要。大多数病毒的大小在20至300 nm之间，尽管潘多拉病毒（Pandoravirus）的尺寸可超过700 nm1。在感染急性期，病毒颗粒的分布可能取决于颗粒大小、细胞受体的分布或细胞受体对病毒的亲和力。在动物模型中，已采用脑室内（ICV）、腹腔内、直接胎盘内和静脉内（IV）感染等方式来研究病毒性脑炎的发病机制。通过ICV途径接种病毒常用于在小鼠中建立中枢神经系统（CNS）感染。使用该技术的研究报道显示感染范围广泛，尤其累及脑室周围区域以及直接与脑脊液（CSF）接触的脑区细胞，类似于病毒性脑室脑炎的表现。腺相关病毒（AAV）颗粒体积较小（直径20–25 nm），有助于其在ICV感染后在整个脑组织中扩散2–4。腹腔内5、直接胎盘内6和静脉注射7属于血源性全身给药方式。病毒颗粒穿过血脑屏障（BBB）后可进入新生脑实质，表现为弥散性小胶质细胞结节8,9。
巨细胞病毒（CMV）是一种属于疱疹病毒科的常见病毒。在美国，到40岁时，50%至80%的人群曾感染过CMV。CMV感染通常无害，但可在免疫功能低下患者及胎儿中引起疾病。在所有分娩中，有0.2%至2%的新生儿患有先天性CMV感染10，导致小头畸形、室管膜周围钙化、小脑发育不全、小眼球、视神经萎缩等严重症状11,12。此外，约10%的非致死性CMV感染婴儿会出现智力障碍、感音神经性听力损失、视觉缺陷、癫痫发作和癫痫等后遗症13,14。中枢神经系统功能障碍是先天性CMV感染最常见的特征性表现。每年因先天性CMV导致永久性残疾的儿童数量超过唐氏综合征、胎儿酒精综合征或脊柱裂所导致的残疾人数15。目前尚无可用的CMV疫苗，因此迫切需要开发安全有效的疫苗。研究CMV颗粒在感染最初阶段与其受体的相互作用，对于理解疫苗的作用机制具有重要意义。
室管膜脑炎和弥漫性小胶质细胞结节是巨细胞病毒性脑炎的两种主要病理特征16。目前尚不清楚在感染急性期，巨细胞病毒颗粒（150 - 300 nm）如何在脑内扩散，以及细胞受体的分布及其对病毒的亲和力如何影响病毒的传播。Kawasaki et al. 从感染最早期阶段病毒颗粒及其受体（β1整合素）分布的角度，评估了脑室内（ICV）和静脉内（IV）感染的情况。我们发现，在ICV和IV感染的最早期阶段，巨细胞病毒颗粒的播散与β1整合素的表达具有良好的相关性8。ICV感染是室管膜脑炎的模型，而IV感染是弥漫性小胶质细胞结节的模型。研究病毒颗粒或荧光颗粒的动态行为，将有助于了解颗粒大小、病毒与细胞受体的相互作用以及病毒穿透血脑屏障的机制。以下方案可用于研究中枢神经系统中的任何病毒感染及病毒载体。

<table><tbody><tr><td>Tris；三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 载体&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&amp;nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% 小鼠血清</td><td>DAKO&amp;nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICR 小鼠</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>改良微量注射器（7000 系列）</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 号针头</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight 透射照明器</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液（pH 6）×10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt 溶液（50×）</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA（10 mg/ml）</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20×</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的扁豆凝集素 Griffonia simplicifolia isolectin B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD31（PECAM-1）PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&amp;nbsp; Gold</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

新生小鼠脑室内及血管内注射病毒颗粒与荧光微珠

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

在研究病毒性脑炎的发病机制时，感染途径至关重要。进入大脑的两种主要感染途径之一是血行途径，该途径涉及感染脑部的内皮细胞和周细胞；另一种是脑室内（ICV）途径。一旦进入中枢神经系统（CNS），病毒可通过脑脊液扩散至蛛网膜下腔、脑膜和脉络丛。在实验模型中，中枢神经系统内病毒分布的最早阶段尚未被充分阐明，尚不清楚是否仅有特定细胞在初始阶段被感染。本文中，我们分析了在新生小鼠脑内经脑室内（ICV）或血管内（IV）注射后，急性感染期（即原发性病毒血症阶段）巨细胞病毒（CMV）颗粒的分布情况。在ICV注射模型中，使用10 µl注射器配27 G针头，将5 µl小鼠巨细胞病毒（MCMV）或荧光微珠注射至耳眼连线中点处的侧脑室。在IV注射模型中，使用1 ml注射器配35 G针头，通过透射光源可视化新生小鼠浅表颞（面部）静脉，并向该静脉注入50 µl MCMV或荧光微珠。注射后在不同时间点采集脑组织，采用以下方法检测MCMV基因组 原位 杂交方法。通过荧光显微镜观察荧光微珠或表达绿色荧光蛋白的重组MCMV颗粒。这些技术可应用于多种其他病原体，以研究脑炎的发病机制。

在研究病毒性脑炎发病机制的过程中，感染途径的选择至关重要。血源性途径代表了病毒对脑部内皮细胞和壁细胞的急性感染，而脑室内注射（ICV）途径则模拟了病毒通过脑脊液在蛛网膜下腔扩散，进而累及脑膜和脉络丛的急性感染过程。为分析急性脑炎中病毒颗粒的初始分布情况， 原位 采用杂交技术检测MCMV基因组，并直接观察M32-EGFP-MCMV颗粒或荧光微珠。
重组MCMV（M32-EGFP-MCMV）的制备
本实验方案说明了如何构建重组M32-GFP-MCMV。通过同源重组，将EGFP插入MCMV基因组的37,089至41,450 bp位置（M32-M31 位点）。EGFP蛋白与一种病毒蛋白（M32）融合，并在病毒颗粒内表达EGFP。同源重组完成后，当有限稀释感染所产生的所有病...

在此，我们介绍一种向新生小鼠脑内进行脑室内和血管内注射病毒颗粒或荧光微珠的简单方法。通过显微镜观察或 原位 杂交。

在病毒性脑炎发病机制的研究中，感染方式至关重要。进入大脑的两种主要感染途径中的第一种是……

本实验的总体目标是观察病毒感染急性期中枢神经系统内病毒颗粒的分布情况。该方法有助于解答神经病毒学领域的关键问题，例如：在急性感染期，病毒颗粒在未成熟中枢神经系统中的分布方式是怎样的。该技术的主要优势在于，可通过显微镜结合两种简单方法直接观察病毒颗粒的初始分布，例如脑室内注射和血管内注射。首先，用70%酒精对10微升注射器和27号针头进行消毒。然后，通过缓慢拉动注射器的活塞，将 5 微升小鼠巨细胞病毒注射液或荧光微珠加入针头中。将出生后 0.5 天的新生小鼠置于冰上 3 至 4 分钟以进行麻醉并固定，随后使用脚趾夹捏反应法判断麻醉深度。使用无毒实验室记号笔在麻醉后的小鼠头部标记注射位点，位置约为矢状缝外侧 0.7 至 1.0 毫米，前囟后方 0.7 至 1.0 毫米处。该示意图更详细地展示了注射位点。作为参考，使用无毒标记笔在针尖尖端上方 2 mm 处做一标记。随后，将针头垂直于颅骨表面插入至标记的注射位点，深度为 2 mm。然后在不切开头皮的情况下，将5 µL小鼠巨细胞病毒缓慢注入侧脑室。在另一组小鼠中，采用相同方法注入含有荧光微珠的5 µL溶液。注射后，让针头在原位停留10至20秒，以防止回流。然后缓慢拔出针头。将注射后的动物置于温暖的容器中恢复5到10分钟，直至活动能力和一般反应性恢复正常。进行静脉注射时，用手术胶带将麻醉后的新生儿固定在透射光源仪上，以清晰观察浅表颞静脉。接下来，佩戴1.5倍放大眼镜后，使用带有35号针头的1 ml注射器，将50 µL小鼠巨细胞病毒缓慢注入浅颞静脉。对照组则重复上述操作，注射适当大小的荧光微珠。拔出针头后，用含70%酒精的纱布按压注射部位，直至出血停止。在急性感染期，脑室内注射两小时后，绿色重组 M32 EGFP MCMV 颗粒主要出现在边缘区域（如箭头所示，并在放大区域中可见）。此时，M32 EGFP MCMV 颗粒也可在脉络丛和室下区观察到。将新生小鼠置于温暖容器中恢复约五分钟，然后再放回笼中。小鼠巨细胞病毒（MCMV）基因组在脑室内注射后3小时首次在脑室下区被检测到。通过荧光和C2杂交技术，MCMV基因组在此放大区域中显示为绿色斑点，并以箭头标示。在静脉注射后3小时，如该更高倍数的图像所示，可见MCMV颗粒（显示为绿色斑点，并以箭头标示）位于脑实质血管区域的内部和外部。此时，MCMV颗粒在脉络丛和室下区仍可见。通过荧光和C2杂交，在静脉注射后12小时可在血管区域和脑膜中检测到MCMV基因组。如箭头所示。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何观察病毒在中枢神经系统感染急性期的分布情况。请务必注意，操作病毒具有极高危险性，进行该操作时应始终采取佩戴口罩和手套等防护措施。

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科研

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神经科学

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胚胎和成体神经干细胞的扩增 子宫内 电穿孔或病毒立体定位注射

来源：Smit, R. D., et al．利用脑部与脊柱联合手术通过双病毒载体靶向新生大鼠皮质脊髓束．J. Vis. Exp.

向新生大鼠皮质脊髓神经元靶向递送病毒以研究脊髓损伤

本视频演示了脑室内注射以研究小鼠巨细胞病毒（MCMV）在新生小鼠脑组织中的分布。经基因工程改造后可表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以便观察的MCMV，被注射至幼鼠脑的侧脑室。注射后的病毒通过脑脊液循环，感染脑室周围区域的细胞，包括边缘带、脉络丛和室下区。...

通过脑室内注射分析新生小鼠脑内小鼠巨细胞病毒分布

人巨细胞病毒（HCMV）感染新生儿是导致智力障碍的重要原因，然而病毒引发致病的分子机制仍不甚清楚。为了研究脑部感染的动态过程，我们改进了整体动物 体内...

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本文展示了一种通过向新生小鼠脑内脑室内注射腺相关病毒实现广泛神经元转导的技术。该方法可快速、简便地实现病毒递送的转基因在生命全程中的持续表达。...

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本文介绍了一种在小鼠中建立寨卡病毒诱导的小头畸形模型的方法。该方案包括在胚胎期、新生期和成年期对小鼠进行脑内接种寨卡病毒的技术。...

建立寨卡病毒诱导的神经系统疾病小鼠模型：采用脑内注射策略的胚胎期、新生期及成年期研究

胚胎期、新生期、成年期、脑内注射、寨卡病毒、神经系统疾病、小鼠模型

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新生小鼠鞘内注射用于基因组编辑与药物递送

学习侧脑室和血管内注射病毒颗粒及荧光微球的方法，用于观察新生小鼠中枢神经系统急性感染期的病毒分布。该技术为神经病毒学研究提供直接的显微观察手段。

新生小鼠脑室内及血管内注射病毒颗粒与荧光微珠

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