器的子类型空肠弯曲菌 SSP。 doylei分离株使用基于光谱质谱PhyloProteomics（MSPP）

这种质谱程序的总体目标称为 MSPP 或基于质谱的系统蛋白质组学，是在菌株水平上对细菌进行亚型分析。这种方法可用于回答微生物学、流行病学和卫生学领域的关键问题。例如，它可用于通过可视化系统原型相关性来分析疫情爆发情况。

与其他分型方法相比，MSPP 每个样品的成本较低，而且速度非常快。院内感染是一个日益重要的问题，我们希望我们的 MSPP 计划可以扩展到其他细菌甚至真菌的流行病学分型。我们的 MSPP 方案提供了对菌株相关性的见解，因此对于相关表型的预测，例如耐药性，甚至毒力，在这些表型与特定基因型相关的情况下应用它是有意义的。

要开始此程序，通过将 2.5 毫克 HCCA 溶解在 250 微升有机溶剂混合物（50% 异腈）中来制备两管基质溶液。将重组人胰岛素作为内部校准剂添加到其中一种中，然后加入 47.5% 双蒸水和 2.5% 三氟乙酸。接下来，从参考菌株中涂抹针头大小的菌落，直接涂在 maldi 靶板上。

为了测定校准峰的精确质量，请将微升测试标准品放在另一个位置。用 1 μL HCCA 加标基质溶液覆盖每个细菌点和标准品，并在室温下结晶。对于要分析的每种菌株，重复涂片制备。

用 1 μL 加标 HCCA 基质溶液覆盖每个点，并在室温下结晶。或者，可以从难以躺着的细胞中提取蛋白质。为此，从带有接种环的琼脂平板培养物中收获大约 5 个菌落。

将它们悬浮在 1.5 毫升反应管中的 300 微升双蒸水中，并通过重复移液彻底混合，直到细菌菌落完全悬浮。然后加入 900 微升无水乙醇并混合。将样品以 13， 000 g 离心 1 分钟。

干燥沉淀后，通过在 50 微升 70% 甲酸中上下移液来重新悬浮。然后，加入 50 微升乙酰丁腈并混合。以 13， 000 g 离心 2 分钟，去除碎屑。

完成后，将 1 μL supernamed 转移到 maldi 目标板上的样品位置。让样品干燥后，用 1 μL HCCA 基质溶液覆盖每个点，并在室温下结晶。此时，通过为每个点收集 100 个拍摄步骤的 600 个光谱来执行 MALDI-TOF 分析。

首先，单击质谱仪配置软件中的"自动执行"选项卡。通过左键单击方法按钮并从下拉菜单中选择方法来打开方法。接下来，左键单击编辑按钮以打开自动执行方法编辑器。

在 累积 选项卡下，将满意的镜头值设置为 100，将汇总值设置为 600。对于每个谱图，从列表中选择校准品峰，单击"自动分配"，然后按"确定"从每个点获取质谱后，通过使用谱图浏览器打开谱图并找到与无校准品的谱图相比，在预期质量数处找到峰，从而通过实验确定校准峰的精确质量数。检查校准品峰是否未被目标生物体的任何其他生物标志物遮挡。

从参考菌株的基因组测序数据中，通过将 DNA 序列翻译成相应的氨基酸序列，计算出每个编码蛋白质的理论单同位素分子量。上传文件'或复制粘贴'这个蛋白质序列到相应的生物信息学资源面板的输入框中，并计算理论等电点和分子量。将结果复制到电子表格中，其中一列包含基因标识符，另一列包含分子量。

按计算的分子量对行进行排序，以便于查找质量。在电子表格中插入一列额外的列，表示去数学形式的分子量，从单同位素分子量中减去 135 个 dautons。通过从基因组表中查找测量的质量，将每个主要测量的生物标志物质量分配给参考菌株的计算质量。

在另一个电子表格中，记录每个生物标志物离子的质量数和标识符。现在校准从收集分离株获得的质谱，就像对参考菌株所做的那样。对于每行一个分离株，在质谱中识别变异生物标志物，在相应列中记录每个生物标志物的测量质量数和预测的亚型。

C-空肠亚种 doylei ATCC 49349 的 MALDI-TOF 质谱包含 14 个带奇异电荷的生物标志物离子，可以通过将计算的分子量与参考光谱进行比较来鉴定。在集合中，检测到不含蛋氨酸的 L32、L33 和由 gil152939117、S20 M 和 S15 M 编码的假设蛋白质的不同 iso 形式。通过使用此处列出的引物对特定基因进行 PCR 扩增和 sanger 测序，确定了与质量变化相对应的氨基酸替换。

此处显示了 MSPP 方案中包含的所有生物标志物离子的氨基酸序列，以及检测到的 alelic 亚型。由检查的空肠弯曲亚种 doylei 分离株构建的基于 MLST 的 UPGMA 树状图表明，每个分离株都属于不同的 MLST 序列类型。菌株 LMG7790 具有最长的系统发育距离。

从 MLST alaysis 中可以看出，在所检查的空肠弯曲亚种 doylei 分离株的 MSPP 分析中，分离LMG7790具有最长的系统发育距离。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一天内完成。在遵循此程序时，重要的是要记住实验期间使用的一些物质的毒性。

例如，乙酰丁腈会引起皮肤刺激。此外，对于 MSPP，可以执行其他方法（如 DNA 测序）来分析进一步的参数，例如抗性基因的存在。这项技术的发展为微生物学领域的研究人员探索光原性铺平了道路。

观看此视频后，您应该对 MSPP 的工作原理以及如何将其应用于特定问题有很好的了解。不要忘记，与猛烈的病原体一起工作可能非常危险，应始终采取预防措施，例如 S2 实验室设备。