Name: 器的子类型空肠弯曲菌 SSP。 doylei分离株使用基于光谱质谱PhyloProteomics（MSPP） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解基于质谱的蛋白质组系统发育学（MSPP）技术，用于空肠弯曲菌亚种doylei的菌株分型。该方法快速经济，可分析细菌亲缘关系并预测耐药性等表型特征。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Hannah Kleinschmidt提供的出色技术支持。本文由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）开放获取支持计划和哥廷根乔治·奥古斯特大学（Georg August Universität Göttingen）出版基金资助。

1. 通过考虑生物安全条件来准备安全的工作环境
<ol>
	<li>熟悉与微生物操作相关的实验室及安全规定。大多数人类致病性微生物必须在生物安全二级条件下操作，但某些微生物（如伤寒沙门菌 Salmonella enterica 伤寒血清型）需要在生物安全三级条件下操作。有关每种病原体操作级别的信息可通过 www.cdc.gov/biosafety 获取。</li>
	<li>无论特定微生物的生物危害分类如何，所有接触过感染性病原体的材料均应视为感染性废弃物，在丢弃前必须经过高压灭菌处理。遵守所在地区关于危险材料和生物物质的安全指南。确保配备适当的容器，以便立即并妥善处置可能被污染的材料（生物危害物）。</li>
	<li>在开始细菌培养前，确保已备好无菌器械（接种环）、溶液和培养基（琼脂平板）。</li>
	<li>处理感染性微生物后，应立即使用抗菌皂和温水洗手。</li>
</ol>
2. 选择参考菌株和菌株集合
<ol>
	<li>选择并获取一个标准的基因组测序参考菌株，以及其编码的蛋白质组序列，最好为 FASTA 格式。如果有更多已测序基因组的菌株，也应将其纳入分析。 
	注意：该菌株/这些菌株将在后续用于预测质谱中观察到的质谱峰的身份（见第 7 节）。</li>
	<li>选择并获取一系列可能具有多样性的菌株，使其涵盖目标物种或亚种的系统发育范围。 
	注意：这些菌株将在后续用于展示群体中生物标志物的变异性（见第 8 节）。</li>
	<li>确保整个菌株集合及参考菌株已通过针对该特定生物体的相应金标准方法进行了准确分型18-20。 
	注意：这可能包括多种（亚）分型方法，但通常依赖于多位点序列分型（MLST），因其仍是展示大多数微生物物种遗传多样性的标准方法。</li>
	<li>为推断菌株集合内的系统发育关系，基于分型数据计算系统发育树，例如，使用 MEGA6 软件中的非加权组平均法（UPGMA）分析 MLST 数据21。对于 MLST 数据，还应查询 MLST 数据库，并分配序列型及相应的克隆复合群22。 
	注意：该系统发育树将在后续用于分析 MSPP 与先前金标准分型方法结果的一致性（见第 9 节）。</li>
</ol>
3. 准备 MALDI 靶板
警告：三氟乙酸（TFA）是一种强酸。不当使用TFA可能导致严重皮肤灼伤、眼部损伤，以及吸入后对上呼吸道造成严重刺激。因此，操作TFA时必须严格遵守安全措施，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括护目镜、面罩、合适的手套、靴子，甚至全套防护服。必须在通风良好的条件下操作该物质，并配备有效的排风系统，以控制TFA可能造成的暴露风险。若通风不足，必须使用带有经认证滤芯的呼吸器。此外，TFA对水生生物有害，并具有长期持续影响。必须避免将TFA释放到废水或环境中。
注意：在将样品点样至MALDI靶板之前，若靶板曾使用过，需彻底清洁。
<ol>
	<li>使用30 ml去离子水和70 ml纯乙醇配制100 ml 70%水溶液乙醇。</li>
	<li>在反应管中加入50 µl去离子水和200 µl 100%三氟乙酸（TFA），涡旋混匀1分钟，配制250 µl 80%水溶液三氟乙酸（TFA）。</li>
	<li>将MALDI靶板放入玻璃皿中，用70%水溶液乙醇在室温下浸泡约5分钟，以清洁靶板。</li>
	<li>用热水冲洗靶板。</li>
	<li>使用纸巾蘸取70%水溶液乙醇，彻底擦拭靶板表面，以去除所有先前的样品及其他潜在残留物。</li>
	<li>如需进一步清洁，可在用纸巾擦拭的同时用热水冲洗。</li>
	<li>用约80%水溶液TFA（每96个点位约100 µl）在靶板表面覆盖一层薄液，再用纸巾擦拭所有点位，以去除残留的、可能不可见的污染物。</li>
	<li>最后，用水冲洗靶板以去除酸液，用纸巾擦干，并在室温下静置至少15分钟，使残留液体完全挥发。</li>
</ol>
4. 含内标校准物的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的制备
<ol>
	<li>通过将10 mg α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）溶解于50%乙腈、47.5%水和2.5%三氟乙酸（TFA）的混合液1 ml中，制备饱和基质溶液。若溶液已饱和，则会有未溶解的HCCA残留。</li>
	<li>加入重组人胰岛素作为内标校准物。为此，用50%水-乙腈溶液配制储存液，终浓度为10 pg/µl，分装后于-20 °C保存以备后续使用。</li>
</ol>
5. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
注意：必须使用针对目标生物体的特定培养条件。MALDI-TOF 质谱样品的制备可根据生物体的不同，采用涂布制样或提取法制备（见第 8.4.1 节）。乙醇-甲酸提取法可有效灭活病原体，而涂布制样则必须在符合要求的生物安全条件下进行（见第 1 节）。通常在基质点样后已无感染风险，但对于特定病原体仍需采用专门的灭活程序。例如，对 Nocardia 属细菌进行 MALDI-TOF 质谱分析前，需在沸水中裂解细菌，随后用乙醇沉淀蛋白质23。EI Khéchine et al. 建立了一种灭活 Mycobacteria 的方法，即将细菌菌落置于含有水和 0.5% Tween 20 的螺旋盖管中，在 95 °C 加热 1 小时24。
<ol>
	<li>涂片制备
	<ol>
		<li>取一针尖大小的细菌菌落，直接涂抹于MALDI靶板上的一个位置（“点”）。</li>
		<li>每个点上覆盖1 µl常规HCCA基质或含内标校准物的基质，室温下静置使其结晶。为确定校准峰的精确质量，另取一个对照点，加入1 µl测试标准品和1 µl含内标校准物的HCCA基质。
		 
		注意：此处使用的测试标准品为大肠杆菌（Escherichia coli）DH5 alpha的提取物，其在MALDI-TOF质谱中表现出特征性蛋白质指纹图谱。该标准品中额外添加了两种蛋白质，以扩展可检测质量范围的上限。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取方法
	<ol>
		<li>用接种环从琼脂平板培养物中收集约五个菌落，充分悬浮于1.5 ml离心管中的300 µl双蒸水中。加入900 µl无水乙醇，通过反复吹打彻底混匀，直至细菌菌落完全悬浮。
		 
		注意：此步骤中，样品可在-20 °C条件下长期保存，该方法已被广泛采用。此外，可通过取1–10 µl提取物划线接种至适宜的琼脂平板，在最佳生长条件下培养，以检测病原体是否已被灭活。若无微生物生长，则表明灭活成功。</li>
		<li>样品在13,000 × g离心1分钟，弃去上清液，室温下干燥沉淀10分钟。用移液器反复吹打，将沉淀充分重悬于50 µl 70%甲酸中。</li>
		<li>加入50 µl乙腈并混匀。在13,000 × g离心2分钟以去除碎片。取1 µl上清液转移至MALDI靶板的样品位置，室温下干燥5分钟。</li>
		<li>每个点上覆盖1 µl含内标校准物的HCCA基质，室温下静置使其结晶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质谱采集
	 
	注意：质谱峰提取采用推荐的标准程序（质心算法；信噪比：2；相对强度阈值：2%；峰宽：3 m/z；基线扣除：TopHat）
	<ol>
		<li>根据仪器制造商的协议对仪器进行校准。</li>
		<li>对每个点，以每100次激光为一步，共采集600次谱图。
		<ol>
			<li>进入质谱仪配置软件的“AutoXecute”选项卡。通过左键点击“Method”按钮并从下拉菜单中选择方法（例如，“MBT_AutoX”）来打开“Method”设置。</li>
			<li>左键点击“Method”菜单右侧的“Edit…”按钮，打开“AutoXecute Method Editor”。进入“Accumulation”选项卡，将“Sum up”值设为“600”，将“satisfactory shots in _x_ shot steps”值设为“100”。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内标质谱校准程序
	 
	注意：质谱测量本身存在微小的测量误差。根据仪器间歇性使用情况、仪器温度变化及重新校准状态，不同实验间获得的测量值可能会有所差异。在测量前对仪器进行校准，并在测量后使用内标校准物对质谱进行校准，是确保不同谱图之间可比性的最精确方法。
	<ol>
		<li>对每个校准峰列表执行以下操作：
		<ol>
			<li>启动谱图浏览器（例如，flexAnalysis），打开谱图：菜单“File”→“Open…”。</li>
			<li>创建含校准峰的质量控制列表：菜单“Method”→“Open…”。</li>
			<li>选择方法：MBT_Standard.FAMSMethod →“Open”。</li>
			<li>编辑质量控制列表：取消勾选所有校准物。</li>
			<li>在底部添加校准峰：峰标签：“Insulin_HIStag[M+H]+_avg”；m_z：“5808.29”；容差[ppm]：“50”；勾选“Calibrant”复选框。</li>
			<li>另存为，例如，“MSPP calibrant list”。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对每个谱图，从列表中选择校准峰，点击“Automatic Assign”，然后按“Ok”。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 验证内部校准程序
<ol>
	<li>实验测定校准峰的精确质量。
	<ol>
		<li>准备两个含有1的点 &#181;l 每个测试标准（步骤 5.1.1）。将第一个与 1 重叠 &#181;l 常规HCCA基质，第二个使用1 &#181;含内标校准物的基质</li>
		<li>从每个点获取质谱图（第5.3节），并使用测试标准品峰进行内标校准（第5.4节）。</li>
		<li>使用谱图浏览器打开两个谱图以进行叠加例如， flexAnalysis 和打开谱图：菜单 &#34;文件&#34;&#8594;&#34;打开&#8230;&#34;）并在预期质量处找到峰（胰岛素 m/z = 5,808.29），该峰应出现在添加校准物的谱图中，而不会出现在使用常规基质获得的谱图中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查校准物峰是否被目标生物体的任何其他生物标志物遮蔽。
	<ol>
		<li>准备两个点样位点（第5.1节），用参考菌株处理，并在第一个位点上覆盖1 &#181;l 常规基质，第二个使用 1 &#181;l 校准物掺入的基质。</li>
		<li>从两个点（第5.3节）获取质谱数据，并使用质谱浏览器打开所得谱图进行叠加例如， flexAnalysis 和打开谱图：菜单 &#34;文件&#34;&#8594;&#34;打开&#8230;&#34;确保在加标基质获得的谱图中，校准物峰清晰可见，且不被相邻的其他信号遮蔽。若无法满足此条件，则针对该特定生物体选择另一种校准物。 
		注意：使用添加的内标校准物可显著提高生物标志物质量变异测定的精确度。采用该方法可检测低至1 Da的质量差异。 alternatively，也可使用来源于生物体的不变质量作为校准物。然而，根据定义，所有来源于生物体的质量除非已被证实为不变，否则均应视为潜在可变的。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 在参考菌株中鉴定生物标志物离子
<ol>
	<li>使用掺入内标校准物的基质测定参考菌株的质谱。
	<ol>
		<li>取一针尖量的细菌菌落（第5.1节）或1 &#181;将细菌蛋白质提取物（第5.2节）直接点样至MALDI靶板位置（“点”）。</li>
		<li>每个点样位点覆盖1 &#181;加入含有内标校准物的HCCA基质溶液，并将靶板置于室温下结晶（第5.1.2/5.2.4节）。</li>
		<li>记录参考菌株的质谱图（第5.3节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用校准物质量（此处为胰岛素，m/z = 5,806.29）对参考谱图进行内部校准，随后通过基线扣除（TopHat）和平滑处理（参数：SavitzkyGolay；宽度：2 m/z，10 个循环）进行预处理。
	<ol>
		<li>启动质谱浏览器（例如， flexAnalysis 和打开谱图：菜单 &#34;文件&#34;&#8594;&#34;打开&#8230;&#34;.)</li>
		<li>选择方法：下拉菜单 &#34;方法&#34; &#8594;&#34;打开&#8230;&#34;，单击选择所需的方法， 例如， &#34;MBT_Standard.FAMS方法&#34;&#8594; &#34;打开&#34;.</li>
		<li>通过选择校准谱图 &#34;内部&#8230;&#34; 从下拉菜单中 &#34;校准&#34;. 一个窗口会打开，列出校准物峰（第5.4节）。左键单击校准物峰（Insulin） &#8594;左键单击 &#34;好的&#34;. 选择 &#34;处理质谱数据&#34; 从 &#34;流程&#34; 下拉菜单</li>
		<li>进行基线校正时，首先在右侧的谱图列表中激活目标谱图。选择 &#34;减去质谱基线&#34; 从 &#34;流程&#34; 下拉菜单</li>
		<li>为平滑谱图，激活右侧谱图列表中的谱图。选择 &#34;平滑质谱基线&#34; 从 &#34;流程&#34; 下拉菜单</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据参考菌株的基因组测序数据，使用序列比对编辑器将DNA序列翻译为相应的氨基酸序列，计算各编码蛋白的理论单一同位素分子量。将该蛋白质序列复制粘贴至ExPASy生物信息学资源门户（http://web.expasy.org/compute_pi/）的输入框中，然后点击 &#34;点击此处&#34; 计算等电点（pI）和分子量（Mw）。对于 C. jejuni 亚种 多尔氏空肠弯曲菌 计算14种可检测生物标志物的质量。</li>
	<li>将结果复制到电子表格中，其中一列包含基因标识符，下一列包含分子量。按计算得到的分子量对行进行排序，以便更方便地查找质量值。注意：其他列为可选内容，功能注释在后续结果解读中可能特别有用。</li>
	<li>在电子表格中插入第二列，用于记录去甲硫氨酸化形式的分子量，即从单一同位素分子量中减去135 Da。注意：这是因为某些蛋白质会经历翻译后修饰，即通过蛋白水解作用去除甲硫氨酸 N-末端甲硫氨酸</li>
	<li>通过查阅上文准备的基因组表格中的实测质量，将每个主要的实测生物标志物质量与参考菌株的计算质量相对应表1).</li>
	<li>如果生物标志物离子无法被归因于预测的基因产物，请考虑其他翻译后修饰（甲基化、乙酰化、异戊二烯化， 等等。；有关修饰及其相应质量变化的汇总，请参见 http://www.abrf.org/delta-mass。对于在目标生物中常见且已知的其他任何翻译后修饰，应在表中新增一列，并参照去甲硫氨酸化形式的计算方法重新计算其分子量。</li>
	<li>新建另一个电子表格工作表，为每个生物标志物离子分别在独立的表格列中记录其质量和标识符。</li>
</ol>
8. 评估群体中生物标志物的变异性
<ol>
	<li>校准从分离株收集物获得的质谱，方法与参考菌株的校准相同（第5.4.2节）。</li>
	<li>在质谱中识别变异的生物标志物。变异质量的特征是缺少参考谱图中已知的质量，并出现参考谱图中不存在的新质量。质量差异必须符合单个氨基酸替换（表2），或其组合。</li>
	<li>每行对应一个分离株，将每个生物标志物的实测质量及其预测的异构体分别记录在表格的相应列中。 
	注意：极少数情况下，某些质量偏移可能由多种不同的氨基酸替换引起，例如，天冬酰胺（N）被天冬氨酸（D）替换，以及谷氨酰胺（Q）被谷氨酸（E）替换，反之亦然，均会导致0.985 Da的质量偏移（表2）。这一内在问题仅靠质谱技术无法解决。因此，在蛋白质序列水平上具有相同质量的不同异构体应被视为同一种MSPP类型。本研究中对C. jejuni ssp. doylei分离株收集物进行MSPP分型时，通过平行进行的Sanger测序确认了该问题并未发生。</li>
	<li>通过PCR扩增并测序相应的生物标志物基因，以确认新的MSPP类型。此步骤同时也可验证生物标志物的身份已被正确指认。
	<ol>
		<li>在最佳生长条件下培养细菌分离株。C. jejuni ssp. doylei菌株在补充5%绵羊血的哥伦比亚琼脂培养基上，于37 °C、微需氧条件（5% O2、10% CO2、85% N2）下培养约48小时。每个分离株使用单独的琼脂平板，以避免交叉污染。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用合适的DNA提取试剂盒或自动化设备提取细菌分离株的基因组DNA。</li>
		<li>使用表3中列出的引物扩增相应的生物标志物基因。所有PCR反应均在以下条件下进行：94 °C变性30秒；55 °C退火30秒；72 °C延伸30秒。</li>
		<li>使用适量的基因组DNA（通常浓度约为100 ng/µl时，600–700 ng DNA已足够）和其中一条扩增引物，通过Sanger测序确定每个扩增产物的DNA序列（通常由服务提供商完成）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在另一张表格中（见表4），使用适当的翻译工具（例如，Transseq：&#160;http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/）25，记录每种新异构体推导出的蛋白质序列。</li>
</ol>
9. 计算基于 MSPP 的系统发育关系并与金标准进行比较
<ol>
	<li>使用序列比对编辑器（如 BioEdit（http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html）26）或生物标志物电子表格，将属于各分离株 MSPP 型别的特定生物标志物氨基酸序列连接成一条连续的序列。</li>
	<li>采用与金标准分型数据相同的聚类方法进行系统发育分析，e.g.，UPGMA 聚类21。</li>
	<li>将基于 MSPP 的系统发育关系与基于金标准方法获得的系统发育关系进行比较4,13。</li>
</ol>

<ol><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology%3A+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li>
<li>Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF-MS-based+species+identification+and+typing+approaches+in+medical+mycology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology.</a> Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).</li>
<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+multilocus+sequence+typing-based+Campylobacter+jejuni+subgroups+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> BMC Microbiol. 13, 247(2013).</li>
<li>Reil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Clostridium+difficile+PCR-ribotypes+001%2C+027+and+126%2F078+using+an+extended+MALDI-TOF+MS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).</li>
<li>Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discrimination+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhi+from+other+serovars+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> PLoS One. 7 (6), e40004(2012).</li>
<li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+fingerprinting+allows+for+discrimination+of+major+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages.</a> Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).</li>
<li>Josten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrum+of+Staphylococcus+aureus+identifies+mutations+that+allow+differentiation+of+the+main+clonal+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages.</a> J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).</li>
<li>Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+biomarker+discovery+for+identification+of+methicillin-resistant+and+vancomycin-intermediate+Staphylococcus+aureus+strains+by+MALDI-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF.</a> Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).</li>
<li>Novais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+the+discrimination+of+high-risk+Escherichia+coli+clones+from+phylogenetic+groups+B2+%28ST131%29+and+D+%28ST69%2C+ST405%2C+ST393%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393).</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).</li>
<li>Matsumura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Escherichia+coli+ST131+and+ST405+clonal+groups+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).</li>
<li>Christner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+Strain+Typing+during+a+Large+Outbreak+of+Shiga-Toxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (7), e101924(2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-based+PhyloProteomics+%28MSPP%29%3A+A+novel+microbial+typing+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/">http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/</a> (2013).</li>
<li>Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+a+brief+overview+on+pathogenicity-associated+factors+and+disease-mediating+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+campylobacteriosis+and+relevant+post-infectious+sequelae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni+-+The+Search+for+virulence-associated+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+Fur+Lebensmittelhygiene%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors.</a> Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+system+for+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni.</a> J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Campylobacter+jejuni+clones%3A+a+basis+for+epidemiologic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).</li>
<li>Cody, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+genomic+epidemiological+evaluation+of+human+Campylobacter+isolates+by+use+of+whole-genome+multilocus+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing.</a> J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).</li>
<li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA6%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+version+6.0%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.</a> Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).</li>
<li>Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mlstdbNet+-+distributed+multi-locus+sequence+typing+%28MLST%29+databases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases.</a> BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).</li>
<li>Verroken, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nocardia+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species.</a> J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).</li>
<li>El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+Identification+of+Mycobacteria+in+Routine+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice.</a> PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).</li>
<li>Goujon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bioinformatics+analysis+tools+framework+at+EMBL-EBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI.</a> Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).</li>
<li>Hall, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioEdit%3A+a+user-friendly+biological+sequence+alignment+editor+and+analysis+program+for+Windows+95%2F98%2FNT%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.</a> Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).</li>
<li>Jolley, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+multilocus+sequence+typing%3A+universal+characterization+of+bacteria+from+domain+to+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain.</a> Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).</li>
<li>Suarez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+proteins+as+biomarkers+for+bacterial+identification+by+mass+spectrometry+in+the+clinical+microbiology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory.</a> J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).</li>
<li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+of+Pseudomonas+putida+strains+by+MALDI-MS+using+ribosomal+subunit+proteins+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers.</a> Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).</li>
<li>Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Rhodococcus+erythropolis+based+on+the+variation+of+ribosomal+proteins+as+observed+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-mass+spectrometry+without+using+genome+information%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information.</a> J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).</li>
<li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+on-target+lysis+%28YOTL%29%2C+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li>
<li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

建立多重选择性反应监测（MSPP）方案最关键的步骤是明确确定生物标志物离子的遗传特性。如果无法明确鉴定某一生物标志物，则应将其排除在方案之外13。
C. jejuni ssp. doylei 分型方案包含14种不同的生物标志离子，比 C. jejuni ssp. jejuni 的MSPP分型方案13少5种。可检测的 C. jejuni ssp. jejuni 与 C. jejuni ssp. doylei 生物标志物之间最显著的差异在于L31(-M)和L35(-M)的翻译后N端甲硫氨酸的去除13。
如在测试的C. jejuni 亚种 doylei 分离株集合中所示，MSPP 能够区分所有七种不同的 MLST 序列型。这意味着每个被测试的分离株均属于一种特定的 MSPP 序列型。此外，M...

在过去的十年中，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已发展成为临床微生物学中微生物属和种鉴定的一种高度可靠的常规方法。1,2物种鉴定基于对完整细胞或细胞裂解物中小分子蛋白质指纹图谱的检测。临床微生物学常规检测中所用质谱仪的典型质荷比范围为2-20 kDa。此外，所获得的质谱图可用于在种以下及亚种以下水平区分菌株。3早期的开创性研究已鉴定出特定菌株亚群的特异性生物标志物离子 空肠弯曲菌4, 艰难梭菌5, 肠道沙门氏菌 ssp. enterica 血清型 Typhi6, 金黄色葡萄球菌7-9，以及 大肠杆菌10-12.
多个对应于等位基因亚型的可变生物标志物质量组合，可实现更深入的亚型分类。此前，我们成功建立了一种方法，可将质量谱图中的这些变异转化为有意义且可重复的系统发育蛋白质组学关系，该方法被称为基于质谱的系统发育蛋白质组学（MSPP），并已应用于空肠弯曲菌空肠亚种（C. jejuni ssp. jejuni）分离株样本集13。MSPP 可作为多基因座序列分型（MLST）等基于DNA序列分型技术的质谱等效方法使用。
Campylobacter 物种是全球细菌性胃肠炎的首要病因14,15。由弯曲杆菌感染引发的感染后后遗症，如吉兰-巴雷综合征、反应性关节炎和炎症性肠病，也可能随之发生16。主要感染来源包括受污染的家禽（鸡、火鸡）、猪、牛、羊和鸭肉、牛奶以及地表水15,17。因此，开展食品安全背景下的常规流行病学监测研究十分必要。MLST 是 &#34;金标准&#34;，用于 Campylobacter 物种的分子分型18。由于基于桑格测序的 MLST 方法耗时耗力且相对昂贵，其应用通常局限于较小规模的分离菌株队列。因此，亟需更经济、快速的亚型分型方法。质谱技术如 MSPP 有望满足这一需求。
本文介绍了一种利用空肠弯曲菌多相位可变数目串联重复序列分型（MSPP-typing）对Campylobacter jejuni ssp. doylei分离株进行分型的详细实验方案，并将其分型潜力与多位点序列分型（MLST）进行了比较。

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex III TOF/TOF 200 系统</td><td>布鲁克道尔顿公司，德国不来梅</td><td>GT02554 G201</td><td>质谱仪</td></tr><tr><td>细菌检测标准 BTS</td><td>布鲁克·道尔顿公司，德国不来梅</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>布鲁克道尔顿公司，德国不来梅</td><td>263564</td><td>软件包</td></tr><tr><td>布鲁克 IVD 细菌检测标准</td><td>布鲁克道尔顿公司，德国不来梅</td><td>8290190</td><td>5 支试管</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;空肠弯曲菌&lt;/em&gt; 亚种 &lt;em&gt;doylei&lt;/em&gt; 分离&amp;nbsp;</td><td>比利时协调微生物保藏中心/根特大学微生物学实验室 BCCM/LMG 比利时根特</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349；IMVS 1141；NCTC 11951；菌株 093</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;空肠弯曲菌&lt;/em&gt; 亚种 &lt;em&gt;doylei&lt;/em&gt; 分离&amp;nbsp;</td><td>比利时微生物协调收集中心/根特大学微生物学实验室 BCCM/LMG 比利时根特</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;空肠弯曲菌&lt;/em&gt; 亚种 &lt;em&gt;doylei&lt;/em&gt; 分离&amp;nbsp;</td><td>比利时微生物协调收集中心/根特大学微生物学实验室 BCCM/LMG 比利时根特</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350；CCUG 18265；Kasper 71；LMG 8219；NCTC 11847</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;空肠弯曲菌&lt;/em&gt; 亚种 &lt;em&gt;doylei&lt;/em&gt; 分离&amp;nbsp;</td><td>比利时协调微生物保藏中心/根特大学微生物学实验室 BCCM/LMG 比利时根特</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;空肠弯曲菌&lt;/em&gt; 亚种 &lt;em&gt;doylei&lt;/em&gt; 分离&amp;nbsp;</td><td>比利时微生物协调收集中心/根特大学微生物学实验室 BCCM/LMG 比利时根特</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;空肠弯曲菌&lt;/em&gt; 亚种 &lt;em&gt;doylei&lt;/em&gt; 分离&amp;nbsp;</td><td>比利时微生物协调收集中心/根特大学微生物学实验室 BCCM/LMG 比利时根特</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;空肠弯曲菌&lt;/em&gt; 亚种 &lt;em&gt;doylei&lt;/em&gt; 分离&amp;nbsp;</td><td>比利时微生物协调收集中心/根特大学微生物学实验室 BCCM/LMG 比利时根特</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>哥伦比亚琼脂基础&amp;nbsp;</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>FlexSeries 1.2 SR1 指南针</td><td>布鲁克道尔顿公司，德国不来梅</td><td>251419</td><td>软件包</td></tr><tr><td>脱纤维羊血&amp;nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH，韦塞尔，德国</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>02854 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HCCA基质</td><td>布鲁克·道尔顿公司，德国不来梅</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Sigma-Aldrich 公司旗下的 Kimtech Science，德国陶夫基兴</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>布鲁克道尔顿公司，德国不来梅</td><td>259935</td><td>软件包</td></tr><tr><td>Mast Cryobank 冻存管</td><td>Mast Diagnostica，德国赖因费尔德</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 抛光钢靶</td><td>布鲁克道尔顿公司，德国不来梅</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>重组人胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>水，分子生物学级</td><td>Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

基于质谱的系统蛋白质组学（mspp）对空肠弯曲菌多氏亚种（campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株进行分型

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）不仅能够在物种和亚种水平上区分某些细菌，甚至可在菌株水平上实现区分。可检测生物标志物离子的等位基因同工型会导致菌株特异性的质荷比偏移。基于质谱的系统发育蛋白质组学（MSPP）是一种新兴技术，该技术将质谱可检测的生物标志物质量整合到一个分析框架中，通过将分离菌株的特异性质荷比偏移与已完成基因组测序的参考菌株进行比较，推断出系统发育蛋白质组学关系。随后利用推导出的氨基酸序列计算基于MSPP的系统发育树状图。
本文通过分析7株人源空肠弯曲菌多尔斯亚种（Campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株的菌株库，描述了MSPP分型的工作流程。多位点序列分型（MLST）结果显示这些菌株具有遗传多样性。MSPP分型共获得七种不同的MSPP序列型，充分反映了它们之间的系统发育关系。
C. jejuni 亚种 doylei 的MSPP分型方案包含14种不同的生物标志物离子，主要为2至11 kDa质量范围内的核糖体蛋白。原则上，MSPP技术可适配于具有更宽质量范围的其他质谱平台。因此，该技术有望成为菌株水平微生物分型的有用工具。

此前，我们已成功建立了一种用于多光子光谱成像的方案 C. jejuni 亚种 jejuni13在此，我们旨在将该方法拓展至其兄弟亚种 C. jejuni 亚种 doylei在此特定条件下，七个 C. jejuni 亚种 doylei 分离株来自比利时微生物保藏中心/根特大学微生物学实验室（BCCM/LMG），比利时根特。本研究分析所用的七株分离株均来源于人类。基因组已测序的菌株ATCC 49349（LMG 8843）作为参考菌株，该菌株最初分离自一名患有腹泻的2岁澳大利亚儿童的粪便样本。从保藏中心还可获得另外六株菌株：LMG 9143、LMG 9243和LMG 9255，均分离自比利时布鲁塞尔患有腹泻儿童的粪便样本；LMG 7790（ATCC 49350）分离自一名德国个体的胃活检样本；LMG 8870（NCTC A613/87）和LMG 8871（NCTC A603/87）则分别分离自两名南非儿童的不同血液样本。
<p class="...

采用基于质谱的系统发育蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株进行菌株水平分型，并与多位点序列分型（MLST）进行比较。

基于质谱的系统蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株进行分型

MALDI-TOF MS 提供了区分某些细菌的可能性，不仅可在物种和亚物种水平上进行区分，甚至可进一步在菌株水平上实现区分。

这种称为MSPP或基于质谱的系统发育蛋白质组学（Mass Spectrometry-based PhyloProteomics）的质谱分析方法，其总体目标是在菌株水平上对细菌进行亚型分类。该方法可用于解答微生物学、流行病学和卫生学领域的关键科学问题。例如，可通过可视化系统发育蛋白质组学相关性来分析疫情暴发情况。与其他分型方法相比，MSPP 每个样本的成本较低，且速度非常快。医院感染问题日益重要，我们希望 MSPP 方案能够扩展应用于其他细菌甚至真菌的流行病学分型。我们的 MSPP 方案可揭示菌株间的亲缘关系，因此在特定表型（如药物耐药性或毒力）与特定基因型相关联的情况下，应用该方案进行预测具有重要意义。开始此操作前，准备两管基质溶液：将 2.5 毫克 HCCA 溶解于 250 微升有机溶剂混合液（含 50%乙腈）中。向其中一管加入重组人胰岛素作为内标校准物，随后加入 47.5%双蒸水和 2.5%三氟乙酸。接着，用移液枪头取少量参考菌株的菌落，直接涂抹于 MALDI 目标板上。为确定校准峰的精确质量，将1微升测试标准品点在另一个位置。在每点细菌和标准品上各覆盖1微升添加了HCCA的基质溶液，并在室温下使其结晶。对每株待分析的菌株，重复涂片制备过程。每个点样位置覆盖1微升掺入标准品的HCCA基质溶液，室温下静置结晶。或者，可从难以处理的细胞中提取蛋白质。具体操作为，用接种环从琼脂平板培养物中收集约5个菌落。将菌落悬浮于1.5毫升离心管中的300微升双蒸水中，通过反复吹打充分混匀，直至细菌菌落完全悬浮。然后加入900微升无水乙醇并混匀。在13,000 g离心1分钟。干燥沉淀后，加入50 µL 70%甲酸，通过上下吹打重悬。然后，加入50 µL乙腈并混匀。在13,000 ×g下离心2分钟，以去除碎片。完成后，取1微升上清液转移至MALDI靶板的样品位点。待样品干燥后，每个位点覆盖1微升HCCA基质溶液，室温下静置结晶。随后，对每个位点采集600张谱图（每100次激光采集为一步），进行MALDI-TOF分析。首先，在质谱仪的配置软件中点击自动执行选项卡。通过左键单击方法按钮，并从下拉菜单中选择相应方法来打开方法。接着，左键单击编辑按钮，以打开自动执行方法编辑器。在“累积”选项卡下，将满意的拍摄次数设为100，累加值设为600。对于每个质谱，从列表中选择校准物峰，点击“自动分配”并按“确定”。在从每个点位获得质谱后，通过使用质谱浏览器打开谱图，并与不含校准物的谱图进行对比，找到预期质量处的峰，从而实验测定校准峰的精确质量。检查校准峰是否未被目标生物体的任何其他生物标志物所遮蔽。根据参考菌株的基因组测序数据，通过将DNA序列翻译为相应的氨基酸序列，计算各编码蛋白质的理论单一同位素分子量。将文件上传或复制粘贴蛋白质序列至相应生物信息学资源面板的输入框中，计算其理论等电点和分子量。将结果复制到电子表格中，其中一列包含基因标识符，另一列包含分子量。按计算出的分子量对行进行排序，以方便查找质量。在电子表格中插入一列，用于表示去甲酰化形式的分子量，即从单同位素分子量中减去135道尔顿。通过在基因组表格中查找实测质量，将每个主要测得的生物标志物质量与参考菌株的计算质量进行匹配。在另一个电子表格中，记录每种生物标志物离子的质量和标识符。现在，对从收集的分离株获得的质谱数据进行校准，校准方法与参考菌株相同。每行对应一个分离株，在质谱图中识别变异的生物标志物，将每种生物标志物的实测质量及其预测的同工型分别记录在相应的列中。通过将计算得到的分子质量与参考谱图进行比对，可鉴定出空肠弯曲菌 Doylei 亚种 ATCC 49349 的 MALDI-TOF 质谱图中包含 14 个单电荷生物标志物离子。在该菌株中，检测到多种异构形式，包括缺失甲硫氨酸的 L32、L33，以及由基因 gil152939117 编码的假定蛋白、S20 M 和 S15 M。其余被指认为生物标志物离子的分子质量在所检测的分离株中保持不变。通过使用下表所列引物对特定基因进行 PCR 扩增及 Sanger 测序，已确定对应于质量偏移的氨基酸替换。此处列出了 MSPP 方案中包含的所有生物标志物离子的氨基酸序列以及检测到的等位基因同工型。基于 MLST 构建的 UPGMA 系统发育树由所检测的空肠弯曲菌多氏亚种分离株生成，结果显示每个分离株属于不同的 MLST 序列型，其中菌株 LMG7790 具有最长的系统发育距离。如MLST分析所示，在对所检测的空肠弯曲菌多依尔亚种分离株进行的MSPP分析中，分离株LMG7790具有最长的系统发育蛋白质组学距离。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一天内完成。在执行该实验步骤时，必须注意实验中所用某些物质的毒性。例如，乙腈可引起皮肤刺激。此外，除MSPP外，还可进行DNA测序等其他方法，以分析更多参数，如耐药基因的存在情况。该技术的开发为微生物学领域的研究人员探索光遗传学奠定了基础。观看本视频后，您应该能够充分理解微流控斑点分析（MSPP）的工作原理及其在特定科学问题中的应用。请务必注意，操作高致病性病原体可能具有极高危险性，必须始终采取相应防护措施，例如使用生物安全二级（S2）实验室设备。

subtyping-campylobacter-jejuni-ssp-doylei-isolates-using-mass

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

器的子类型<em&gt;空肠弯曲菌</em&gt; SSP。<em&gt; doylei</em&gt;分离株使用基于光谱质谱PhyloProteomics（MSPP）

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

尽管粪便培养用于 弯曲杆菌 不精确，但仍被视为鉴定的金标准。用于确定检测限及在转运培养基中存活情况的方法 C. jejuni...

Campylobacter jejuni 在人粪便标本中于转运培养基内的检出限与存活能力的培养检测方法

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

本文介绍一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自主开发的软件进行自上而下蛋白质组学分析，快速鉴定基因组测序的致病菌所产生蛋白质的实验方案。由于天冬氨酸效应，亚稳态蛋白质离子发生断裂，该特异性被用于蛋白质鉴定。...

抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

使用台式仪器进行全基因组测序（WGS）策略的可行性，已使实验室环境下对所有与公共卫生相关的微生物进行基因组分析变得更加简便。本文描述了细菌全基因组测序工作流程的方法学改进，并提供了一套用于分析的生物信息学流程。...

利用全基因组测序对源自罗非鱼（Oreochromis spp.）养殖场的一种致病性Escherichia coli菌株进行表征

弯曲杆菌是全球细菌性食源性胃肠炎的首要致病原因。尽管各生产机构已采取措施以降低其在生产设施中的污染率，但受污染的产品仍持续流入消费者手中。过去十二年间开发的这一技术，解决了现有方法在从生肉中分离和检测Campylobacter...

从生肉中检测与分离Campylobacter spp.

本方案通过将培养组学与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）相结合，实现对乳制品中微生物组成的快速、低成本评估。该方法获得的分类学结果与16S...

利用细菌蛋白质组学分析评估乳制品的微生物安全性 通过 基质辅助激光解吸电离方法

了解基于质谱的蛋白质组系统发育学（MSPP）技术，用于空肠弯曲菌亚种doylei的菌株分型。该方法快速经济，可分析细菌亲缘关系并预测耐药性等表型特征。

基于质谱的系统蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株进行分型

探索更多视频