小鼠后肢急性与亚急性缺血模型的建立方法

本方案的总体目标是通过在小鼠股动脉上放置缝线或氨甲酰环状缩窄器，分别诱导急性或亚急性后肢缺血，从而建立人类外周动脉疾病模型。外周动脉疾病是一种重要的临床问题，而这些利用动物模型的技术已被开发出来，以更真实地模拟人类疾病。这些技术的主要优势在于，研究者可以控制肢体缺血发生的严重程度和时间进程。

演示该操作的将是来自我实验室的技术员 Mike Padgett。在操作前一到两天，通过脚趾夹捏无反应确认小鼠已完全麻醉，并涂抹眼膏。接着，使用小型电动剃毛器剃除后肢两侧的毛发。

当所有毛发修剪完毕后，涂抹预热的脱毛膏。一分钟后，用湿润的纱布轻轻擦去脱毛膏。随后将小鼠置于铺有纸巾的空恢复笼中，直至其能够维持胸卧位。

手术当天，将完全麻醉的小鼠仰卧位置于体视解剖显微镜下，并用手术胶带固定其两条后肢。若使用温度控制加热垫，需连接温度探头，并用手术胶带将探头固定在手术平台底部。随后，使用碘伏和酒精棉片交替擦拭手术区域三次以清洁术区，然后用无菌手术单覆盖动物体表，手术单上的开口应对准切口位置。

使用手术刀，从膝盖向腹部方向沿大腿内侧中线做初始切口。然后使用精细剪刀将切口延长至约一厘米。用镊子打开切口，暴露覆盖在腹股沟脂肪组织上的膜。

然后使用闭合的镊子刺穿膜，进入脂肪组织与腹壁之间的间隙。轻轻松开镊子的压力，将脂肪组织与腹肌分离，暴露神经血管束。在解剖神经血管束之前，必须准确认识主要血管及其分支。

缩窄环的位置或结扎部位的差异会显著改变缺血的严重程度，从而导致结果出现较大变异性。将拉钩插入切口，将腹侧组织向动物头部方向牵拉，以暴露近端缩窄环位置，该位置位于股侧副动脉近端附近。然后在切口远端插入一个内侧和一个外侧拉钩，以扩大手术视野，将腹股沟脂肪组织向足部方向牵拉，使其远离手术区域。

股动脉的近端和浅层尾侧分支应易于观察。股外侧旋动脉位于尾侧分支近端约五毫米处，可能被膜组织遮挡。现在轻轻地将一把镊子的尖端滑入连接血管的膜组织下方，将镊子尖端的一半插入静脉与动脉之间。

然后闭合镊子，轻轻撕除膜组织。当所有膜组织被完全去除后，将闭合的镊子尖端插入静脉与动脉之间，松开镊子压力，以在血管间形成间隙。对于亚急性肢体缺血情况，将镊子尖端滑入股动脉下方，以分离血管神经束中的血管。

使用第二把有角度的镊子夹住缩窄器的边缘，将缩窄器引导至股动脉下方。然后将股动脉放入缩窄器的槽中。接着，将远端缩窄器置于股动脉上，位置在股动脉分叉为腘动脉和隐动脉处的近端紧邻区域，并将股动脉置入缩窄器的槽内。

对于急性肢体缺血，将一根7-0缝线穿过与近端缩窄环相同位置的动脉下方，结扎动脉。然后在第一结扎线远端约一毫米处打第二个结扎线，使用弹簧剪在两条结扎线之间横断动脉。对于远端动脉横断，将两条结扎线相距约一毫米放置，位置位于股动脉分叉为腘动脉和隐动脉之前的近端附近。

然后使用间断的5-0薇乔缝线关闭切口，并将小鼠转移至激光多普勒血流成像仪下方的37摄氏度加热垫上。现在打开成像仪，启动图像采集软件。单击“新建单幅图像”图标以打开扫描设置窗口，将扫描尺寸设为“大”，扫描速度设为每像素4毫秒。

在扫描区域单位面板下，将 X 和 Y 值更改为适当的数值，然后单击视频和距离选项卡，调整两只后肢使其位于扫描区域内。单击自动距离，然后单击下一步以打开受试者信息窗口，并输入受试者信息。单击下一步，进入扫描窗口。

然后点击“开始测量”按钮，打开“确认或覆盖扫描距离”对话框，点击“确定”开始扫描过程。扫描完成后，将小鼠移至一个空的恢复笼中，并持续监测直至其完全恢复。除了动物实验本身固有的变异性外，其他因素也可能导致激光多普勒血流成像结果的变异，包括动物的体温和体位。

亚急性后肢缺血模型的效果依赖于缩窄环的质量，而同一批次的缩窄环质量可能存在较大差异。应在手术后立即对仍处于麻醉状态的动物进行激光多普勒灌注成像，以验证手术效果并建立术后灌注的基线水平。在急性肢体缺血模型中，应观察到后肢灌注完全丧失；而在亚急性模型中，放置缩窄环后通常仅出现灌注的轻度下降。

这些操作可用于研究不同程度的缺血对小鼠血管重塑和骨骼肌再生的影响，小鼠作为人类外周动脉疾病的模型。一旦掌握，若操作正确，这些操作可在约15分钟内完成。在进行这些手术时，重要的是要持续监测动物的体温和麻醉是否充分。

通过调整结扎线或缩窄装置的位置，可以改变缺血性损伤的严重程度，这可能是一个重要的变量，具体取决于动物的遗传背景或是否存在心血管危险因素。观看本视频后，您应能够充分理解如何在小鼠中诱导急性及亚急性后肢缺血，并掌握血管解剖结构的界定方法，以确保手术结果的准确性和可重复性。