利用人肝干细胞构建人源化小鼠肝脏

本手术干细胞移植程序的总体目标是利用可进行细胞增殖、成熟和分化的未成熟人肝干细胞前体细胞，建立一种具有人肝脏功能的新型嵌合小鼠模型，以实现药物代谢能力的获得。该方法提供了一种强有力的工具，可创建支持人供体肝干细胞前体细胞增殖、分化并重建受损小鼠受体肝脏的微环境。该技术的主要优势在于，所扩增的细胞能够成熟，并且肝脏几乎能够完全重建。

首先，通过将1毫升含苯酚的0.85%氯化钠溶液加入1毫克白喉毒素（DT）中，配制浓度为1毫克/毫升的白喉毒素或DT储备液。将Albtrek scid小鼠置于仰卧位，于腹中线左侧或右侧、膝盖弯曲处下方，以45度角插入针头，进行腹腔注射。使用胰岛素注射器，按每20克体重小鼠注射100微升新鲜配制的0.3微克/毫升DT溶液。在注射DT后48小时，将小鼠放入固定器中，并将其尾巴置于30°C水浴中加热约10分钟，以扩张血管。

然后从尾尖向内2厘米处，使用锋利的手术刀片在尾部做一个1毫米的切口，用毛细管收集血液。将含有血液的微量毛细管以1500 × g离心5分钟，通过分离上清液与细胞沉淀来收集血清。取50 µL血清1:20稀释液，用移液器将其加到GOT ASTP3载玻片上。

然后使用多功能全自动干化学分析仪，根据制造商的说明书，测定反应产物在650纳米处的吸光度。利用细胞分选仪，从人原代胎肝细胞中分选表达CDCP1、CD90和CD66细胞抗原的人肝干细胞，获得CDCP1阳性、CD90阳性、CD66阴性的亚群。将细胞接种于IV型胶原包被的培养皿中，在37摄氏度下孵育。

当细胞融合度达到80%至90%时，使用PBS洗涤细胞一次。随后加入0.05%胰蛋白酶-EDTA，并在室温下孵育。在显微镜下观察到细胞开始漂浮或自由流动时，加入8毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基以终止酶消化反应。

使用10毫升血清移液管，在将细胞转移至15毫升锥形管前缓慢悬浮细胞。在4摄氏度条件下，以100 × g离心5分钟。加入10毫升含10% FBS的DMEM/F12培养基，小心重悬细胞沉淀，并使用细胞计数仪测定细胞数量。

将细胞分装，每份含1 × 10⁶个细胞，溶于50 µL PBS中，每只小鼠一份，置于冰上保存直至移植。按照文本方案麻醉小鼠后，轻捏后肢足垫以检查反射。然后在眼睛上涂抹兽用眼膏，防止干燥。

使用电动剪刀剃除手术区域的毛发，并用70%乙醇和聚维酮碘进行消毒。在左侧肋缘下方的左 flank 区做一厘米长的皮肤切口，随后切开左侧腹壁，再切开腹膜。

接下来，小心地暴露脾脏。然后以5度角将一支100微升微量注射器（配32号、1/2英寸针头）插入脾脏，深度约为脾脏厚度的一半，从器官一端至另一端直接注入50微升PBS缓冲液中含1×10⁶个人肝干细胞的细胞悬液，随后拔出针头。为防止注射后细胞外漏，用手指轻轻按压注射部位持续2分钟。

将脾脏放回小鼠体内，使用常规连续缝合方式缝合肌肉和皮肤以关闭切口。立即将小鼠侧卧置于已预热至37摄氏度的笼盒中。避免笼盒垫料与手术部位接触，并按照文本方案所述进行动物监测。

移植后4至6周，按照文本方案处死小鼠，用手术剪同时剪开皮肤和筋膜，打开腹腔。以手术剪作为撑开器，沿腹白线分离腹膜上方的结缔组织，打开腹膜腔。用镊子提起胸骨。

然后刺破膈肌，并沿胸骨两侧向上剪至颈肩带。切断肝脏胸腔侧的下腔静脉，将食管从肝脏前方拉出。移除膈肌，然后以其作为手柄，开始将肝脏从腹腔中拉出。

下腔静脉会将肝脏固定在原位，因此需切断下腔静脉，注意避免过早分离右侧肾上腺。在肝叶交界处将各肝叶彼此分离，并按照试剂盒说明书中的方案将其包埋于OCT中。

将含有肝组织的OCT置于冷冻切片机的金属网格中并进行冷冻。在冷冻切片机中，于-18 °C下切取5 µm厚的组织切片，并将其贴附于室温载玻片上。将样品储存于-80 °C环境中。

最后，根据已报道的方法制备用于苏木精-伊红（H&E）染色的切片，并根据文本方案进行ELISA操作。如这些H&E染色切片所示，DT处理的小鼠表现出肝组织结构紊乱，并伴有血清AST活性升高所提示的充血改善。在移植后六周，由人肝干细胞衍生的细胞通过替代小鼠原有的肝细胞，重建了肝脏结构。

移植后第4天，肉眼可见小的人类肝细胞簇均匀分布于肝脏周围。至第45天，这些细胞簇已增殖形成较大的细胞团。如图所示，通过人源细胞核以及细胞角蛋白8/18抗体染色，于移植后6周首次证实小鼠肝脏中存在人类肝细胞。

人ALB阳性且CK19阴性的肝细胞类似于功能性肝细胞，而同时表达人ALB和CK19的细胞则表现出向肝细胞和胆管细胞分化的双潜能特性。在人源化肝脏中，可见围绕肝小叶分布的多个圆形细胞簇，其具有清晰的人源细胞核并表达CK8/18，表明人肝干细胞具有克隆形成能力。最终，移植后一个月内肝脏细胞的重殖水平达到约90%，并在重殖的小鼠肝脏中检测到人白蛋白的分泌。

一旦掌握，若操作得当，手术细胞移植可在10分钟内完成。进行该操作时，需注意肝损伤应局限于柔软的肝脏组织。为防止细胞泄漏，应避免发生细胞移植外漏。

结合该操作，还可采用其他方法，例如利用人源细胞进行体外直接重编程的基因转染，以探索人源细胞与本研究模型的融合。该技术建立后，为肝病学领域的研究人员提供了探索人源药物代谢、药物相互作用、肝毒性以及肝炎病毒的类人肝脏模型。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离与扩增肝干细胞、诱导肝损伤，以及通过脾脏移植细胞以构建具有人源肝功能的嵌合小鼠模型。

请务必注意，白喉毒素可以被控制，但在进行此操作时，应始终采取重要预防措施，例如避免心脏和肝脏发生坏死。