通过手术融合发育中的囊胚生成连体斑马鱼胚胎

该方法的总体目标是生成共生型斑马鱼胚胎，可用于研究目的候选基因的细胞内在功能与细胞外在功能。该方法有助于解答细胞自主性方面的关键问题。例如，在造血系统中，造血干细胞（HSC）迁移过程中的重要缺陷究竟是源于HSC本身，还是源于其微环境（niche）。

本方案的主要优势在于能够更成功地制备连体（parabiotic）斑马鱼胚胎。通常，初次接触该方法的研究者会遇到较大困难，因为发育中的胚胎极为脆弱，容易受损。该方法的可视化演示至关重要，因为手术缝合步骤学习难度较高，需要极高的准确度和精确度。

本文提供了通过手术融合发育中的囊胚来制备共生斑马鱼胚胎的逐步操作说明。该方法展示了如何提高共生融合的效率，并增强联体胚胎的存活率。根据文本方案准备试剂和工具后，通过将巴斯德移液管末端在本生灯上短暂加热，制备两到三个经改造的巴斯德移液管。

然后，使用大号镊子，在移液管仍然温热时，将其末端弯曲约45度。为确保末端无锋利边缘而可能损伤胚胎，将移液管末端置于本生灯火焰上灼烧1至2秒。使用血浆DNA、mRNA或吗啉代寡核苷酸，在收集胚胎后一小时内进行显微注射，并让胚胎发育至256细胞期。

当胚胎接近256细胞阶段时，将每种遗传背景分别转移至单独的琼脂糖包被培养皿、无划痕玻璃烧杯或培养皿中。根据正文方案去壳后，解冻先前配制的甲基纤维素，并使用台式离心机以最高速度离心，使未溶解的晶体沉淀，以免这些晶体损伤胚胎或导致卵黄破裂。同时，使用记号笔在100毫升琼脂糖包被培养皿的底部标记12至15个预先确定的位置点。

然后，离心后取甲基纤维素的上清液，将1至1.5厘米的液滴转移至培养皿中标记的位置。接着，为刚刚制备的每个琼脂糖包被的培养皿准备一份40毫升的高钙林格液（HCR溶液）。向每份溶液中加入此处所列的抗生素。

准备进行囊胚融合时，使用含有抗生素的HCR分装液小心地填充每个含有甲基纤维素液滴的培养皿，注意不要破坏液滴。将先前制备的改良玻璃巴斯德吸管连接到10毫升移液器泵上。然后，在体视显微镜下，从每种遗传背景中各收集一个去壳胚胎。

在分配两个胚胎之前，先用巴斯德吸管在甲基纤维素液滴中央制造一个小凹陷。然后将两个胚胎放入该凹陷中。接着，使用末端带有凝胶上样尖端的解剖针，以轻柔的扫动动作在不直接接触胚胎的情况下，仔细调整胚胎在甲基纤维素中的位置，使它们的动物极彼此直接接触。

正确地定位正在发育的胚胎决定了胚胎将如何融合和发育。对于头对头的融合，需确保每个胚胎的动物极对齐。让胚胎静置五分钟，使甲基纤维素在其周围沉降稳定。

在此期间，将下一对胚胎放入另一个液滴中。进行手术时，使用玻璃针工具，在两个胚胎的接触点处小心地将其切开。然后以轻柔的缝合动作，将第一个胚胎的细胞拉入第二个胚胎，再返回第一个胚胎。

动作结束时，将玻璃针停留于原位两到三秒，再极其缓慢地抽出。玻璃针操作的精确性至关重要，以确保胚胎被正确缝合。操作时需格外小心，避免损伤卵黄囊，同时维持足够的连接以实现成功融合。

将胚胎在室温下静置10至15分钟。在此期间，继续缝合额外的胚胎对。孵育结束后，评估胚胎是否仍保持连接，必要时重复损伤步骤。

将胚胎置于同一培养皿和培养基中，在 28.5 摄氏度下过夜孵育。次日早晨，胚胎将从大部分已溶解的甲基纤维素中脱离。移除任何未成功融合的胚胎。

然后，倾去培养基，并用 25 毫升 E3 培养基替换。为了获取融合胚胎的图像，配制 0.8% 的低熔点琼脂糖。在仍处于高温状态时，将 1 毫升琼脂糖分装至置于 37 摄氏度加热块中的 1.5 毫升离心管中。

通过向含有胚胎的25毫升E3培养基中加入1毫升浓度为4毫克/毫升、pH值为7.0的三卡因，使异体共生胚胎麻醉。轻轻晃动培养皿，使胚胎聚集于中央。然后使用宽口塑料移液管，尽可能少地吸取液体，将胚胎吸起。

接下来，将移液枪垂直向上，轻轻弹动胚胎，使其沉降至移液枪吸头的最底部。然后，通过轻轻接触琼脂糖表面的方式，将胚胎转移至1毫升低熔点琼脂糖中。弃去移液枪中多余的液体，并用移液枪轻轻混匀琼脂糖中的胚胎。

然后，用移液器将琼脂糖和胚胎转移至玻璃底六孔板的孔中。在体视显微镜下，使用连接在解剖针末端的加样枪头将胚胎调整至靠近盖玻片的位置，并调整为成像所需的朝向。待琼脂糖凝固后，在孔中加入含三卡因的培养基，随后使用倒置的宽场落射荧光激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜采集图像。

对于整个胚胎的视野，使用 4X 物镜。使用 20X 物镜对特定组织进行成像。根据文本方案处理图像。

如图所示，在将两个囊胚的动物极相对排列后，小心地在其接触点处造成伤口。伤口程度越大，胚胎越有可能保持连接，从而实现成功融合，且不会产生额外的形态缺陷或发育延迟。如本图所示，通过将两个囊胚的动物极精确对齐，可稳定地获得头对头或卵黄囊对卵黄囊的融合体，并具有共用的循环系统。

大多数情况下，胚胎具有两个心脏，共同泵送一套共享的血液循环系统。为了证实这些胚胎确实共享血液循环，将表达GFP阳性红细胞的转基因胚胎与表达mCherry阳性血管内皮细胞的胚胎进行融合。如本视频所示，在受精后48小时，可观察到GFP阳性的红细胞在Flik1 HRAS mCherry标记的配体胚胎中循环流动。

最后，为了研究基因表达的时间调控，将其中一个胚胎注射了 hsp70 EGFP DNA 构建体。在37摄氏度下进行短暂的30分钟热激后，其中一个胚胎中明显出现了GFP信号，某些情况下，在未注射的配对胚胎中也观察到GFP阳性细胞在循环。一旦掌握，该技术若操作得当，可在五小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要注意在缝合两个囊胚时需格外小心，如果初次手术未能成功，应重新尝试融合。在完成该操作后，可采用活细胞成像等其他方法来进一步探究更多问题，例如野生型造血干细胞在突变型微环境中是否能正常发挥功能，或者相反情况下，突变型造血干细胞是否能在野生型微环境中正常运作。该技术为血液学领域的研究人员提供了一种强有力的手段，用于研究斑马鱼中血液发育的调控机制。

请务必注意，三卡因可能具有危险性，在进行本操作时应始终采取适当的安全防护措施，例如穿戴合适的防护装备。在观看本视频并遵循我们推荐的技术方法后，我们希望您能够更成功地获得高质量的斑马鱼胚胎。