Name: 联体斑马鱼胚胎一代发展囊胚的手术融合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习通过手术融合发育中的囊胚来生成联体斑马鱼胚胎的技术。该方法利用Danio rerio研究细胞自主性与非细胞自主性功能，为发育生物学和神经科学研究提供可靠工具。

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感谢朱莉·R·珀林对本文手稿提出的宝贵意见。D.I.S. 的研究得到了美国血液学会、库利氏贫血基金会以及美国国立卫生研究院（NIH，资助号 K01DK085217 和 R03DK100672）的资助。E.J.H. 是霍华德·休斯医学研究所海伦·海·惠特尼基金会研究员。B.L. 是霍华德·休斯医学研究所医学研究研究员。B.W.B. 的研究得到了癌症研究所欧文顿奖学金以及美国临床肿瘤学会（ASCO）征服癌症基金会青年研究者奖的资助。L.I.Z. 的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，资助号 R01CA103846、P01HL032262 和 R01HL04880）、塔布骨髓增生异常综合征研究基金会以及哈佛干细胞研究所的资助，同时是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

本方案已获波士顿儿童医院动物护理与使用委员会批准。本方案改编自先前发表的方法15。
1. 试剂的准备（提前数天或数周）
<ol>
	<li>制备1.5%琼脂糖包被的培养皿。 将1.5 g琼脂糖加入100 ml斑马鱼E3培养基中，置于锥形瓶内。加热溶解后，将约5 ml液体倒入直径100 mm、深度20 mm的培养皿中。 
	注意：这些培养皿用于胚胎去壳（步骤 3.1）和异体共生手术（步骤 3.3）。将琼脂糖包被的培养皿在 4 °C 下保存数周；在进行异体共生手术当天早晨，从冰箱中取出并恢复至室温。</li>
	<li>制备4%甲基纤维素溶液。 在锥形瓶中加入4 g甲基纤维素粉末和100 ml E3溶液，并放入搅拌子。将锥形瓶置于4 °C的搅拌台上，调至最低转速，持续搅拌最多2天。
	<ol>
		<li>间歇使用刮勺将甲基纤维素的白色结块打散。在此浓度下，甲基纤维素晶体不会完全溶解。当溶液变得澄清、均匀且无白色结块残留时，将溶液分装至1.5 ml离心管中，并于-20 °C冷冻保存以长期储存。 
		注意：可使用较低浓度的甲基纤维素；然而，这种较高百分比、黏稠度更高的甲基纤维素效果最佳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制高钙任氏液（HCR）溶液。 配制 400 ml HCR 溶液，需混合 8 ml 5M NaCl（终浓度 116 mM）、400 µl 3M KCl（终浓度 2.9 mM）、800 µl 5M CaCl2 （终浓度10 mM）以及2 ml 1 M HEPES（终浓度5 mM），用E3培养基定容至390 ml。 
	注意：将 HCR 溶液在 4 °C 下保存数周；在连体手术当天早晨恢复至室温。</li>
	<li>准备5-6个改良的巴斯德吸管用于转移囊胚对。将吸管末端在本生灯上短暂加热。然后，用大号镊子在吸管仍处于高温状态时将其末端弯曲至约45 °C。
	<ol>
		<li>为确保移液管尖端无锋利边缘而可能损伤胚胎，将移液管尖端在火焰中短暂灼烧约3秒，以使管口光滑/圆润。该经改造的玻璃巴斯德移液管需与10 ml移液器泵配合使用（图1在下面的步骤 3.5 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于囊胚对缝合手术的玻璃针工具。按照斑马鱼胚胎显微注射的方法，拉制2-3根玻璃针。使用实验室封膜将每根玻璃针固定在木质或塑料手柄解剖针的末端图1A）。使用镊子将针尖折断至直径约为 20 - 30 µm。此步骤可借助载物台测微尺进行引导 （图1B）. 
	注意：针尖的大小非常重要。如果针尖过大，则难以精确控制，且可能造成过度损伤；如果针尖过小，则难以对胚胎造成足够的创伤。</li>
</ol>
2. 斑马鱼繁殖配对的设置及胚胎收集（第 -1 天至第 0 天）
<ol>
	<li>设置成年斑马鱼的繁殖配对。在准备进行异体共生手术的前一晚安排鱼类配对，并使用隔离板将雄鱼和雌鱼分开。为了提高获得目标胚胎的概率，应为每种品系设置多对繁殖鱼。我们发现通常有 20 - 50% 的配对会成功产卵。</li>
	<li>次日早晨，移除隔离板以允许交配。使用细网茶筛收集所有胚胎，然后将其转移至含有 E3 胚胎培养基18的培养皿中。</li>
	<li>在收集后 1 小时内，根据需要对胚胎进行显微注射（例如，注射 25 pg 质粒 DNA、200 pg mRNA，或 1 - 6 ng 形态学反义寡核苷酸）。让胚胎继续发育至 256 细胞期。如果 DNA 表达载体受热激启动子控制（例如，hsp70，图 4B），可在后续阶段（例如，36 hpf 时）将异体共生体在 37 °C 下进行热激处理，以控制基因表达的时间。 
	注意：除了使用荧光转基因外，还可将荧光葡聚糖加入 DNA、RNA 或形态学反义寡核苷酸的注射混合物中（例如，&#160;cascade blue 葡聚糖，2 mg/ml）。该葡聚糖染料不会干扰正常发育，并可在异体共生融合后，在适当的荧光光源下识别已注射的胚胎。或者，也可通过将色素型品系（例如，&#160;AB）与非色素型品系（例如，&#160;Casper）进行异体共生，以在后期识别已注射的胚胎。</li>
	<li>将胚胎在 28.5 °C 下孵育。当胚胎接近 256 细胞发育阶段（约 2.5 hpf）时，使用体视显微镜定期监测其发育情况。 
	注意：如有需要，可将胚胎置于不同温度下，以确保异体共生伙伴之间的发育阶段一致（例如，注射形态学反义寡核苷酸的胚胎通常比未注射的胚胎发育更慢。将未注射的胚胎置于室温下，而将注射形态学反义寡核苷酸的胚胎保持在 28.5 °C，经过数小时发育后可使两者的发育阶段趋于一致）。</li>
</ol>
3. 通过发育期囊胚的手术融合生成连体斑马鱼胚胎
<ol>
	<li>当胚胎接近256细胞期（约2.5 hpf）时，将不同遗传背景的胚胎分别转移即， 基因突变体、转基因品系和/或遗传操作材料）分别放入已涂布琼脂糖的培养皿中（例如， 一个培养皿用于注射吗啉环的胚胎，另一个培养皿用于对照组胚胎。或者，将胚胎转移至洁净无划痕的玻璃烧杯或玻璃培养皿中。 
	注意：避免使用未包被的塑料培养皿，因为胚胎会粘附在塑料表面，导致脱膜后受损。</li>
	<li>将E3培养基倒出，直至仅剩足以覆盖胚胎的液体（约7-10 ml）。加入200 µl浓度为50 mg/ml的蛋白酶混合液，该混合液来源于细胞外液 Streptomyces griseus （蛋白酶）。每隔几分钟轻轻摇动胚胎。
	<ol>
		<li>当50%的胚胎已脱去绒毛膜时（通常需要5 - 10分钟），用足量的新鲜E3胚胎培养基（约15 - 20 ml）清洗三次。
		<ol>
			<li>使用改良的玻璃巴斯德吸管轻轻吸取仍带有绒毛膜的胚胎，然后轻轻排出，以去除绒毛膜。胚胎去膜并洗涤后，将E3培养基替换为HCR溶液。作为蛋白酶处理的替代方法，可使用精细镊子手动去除绒毛膜。每种实验条件下应准备60至100个去膜胚胎。 
			注意：此数量远超最终所需，但在操作或进行连体手术过程中，许多胚胎可能会受损。一旦胚胎脱去卵膜，应始终保持其完全浸没在液体中，避免接触液面，因为表面张力会导致胚胎破坏。需注意，使用较高浓度的蛋白酶可使胚胎更快速且更同步地从卵膜中释放；而使用较低浓度蛋白酶时，胚胎从卵膜中孵出所需时间更长，且孵出不同步，可能导致部分胚胎因长时间暴露于蛋白酶而受损。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻上述步骤1.2中制备的甲基纤维素，并在台式离心机中以最大速度离心10分钟&#160;离心去除未溶解的晶体，以免损伤胚胎或导致卵黄破裂。
	<ol>
		<li>离心后，取上层澄清部分（约占总体积的75%）。将直径1–1.5 cm的甲基纤维素液滴转移至经1.5%琼脂糖包被的培养皿中。注意避免吸取管底沉淀的晶体。</li>
		<li>用记号笔在培养皿底部预先标记每滴液滴的位置。每个直径100 mm的培养皿中加入12–15滴（相当于2–3份 aliquot）甲基纤维素。根据实验需要准备相应数量的培养皿。 
		注意：每个液滴用于一对囊胚的融合。&#160;该标记将用于指示加入培养基后每个液滴的位置，此时液滴会变得几乎不可见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每份经第3.3步制备的琼脂糖包被培养皿，需准备40 ml含抗生素的HCR溶液。向每份40 ml HCR溶液中加入青霉素-链霉素至终浓度50 U/ml、氨苄青霉素至终浓度50 U/ml，以及卡那霉素至终浓度0.5 µg/ml。
	<ol>
		<li>当准备进行囊胚融合时，小心地向每个含有甲基纤维素液滴的培养皿中加入40 ml添加抗生素的HCR溶液。若HCR溶液加入过快，可能会破坏液滴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将改良的玻璃巴斯德移液管（按上述步骤1.4制备）连接至10 ml移液器泵。在体视显微镜下，从每种遗传背景中各取一个去壳胚胎（例如，&#160;一个注射了吗啉代寡核苷酸的胚胎和一个野生型胚胎
	<ol>
		<li>在分配两个胚胎之前，使用巴斯德移液管在甲基纤维素液滴中央制造一个小凹陷。&#160;然后将两个胚胎轻轻放入凹槽中。 
		注意：转移过程中，将巴斯德吸管略微向上倾斜，使胚胎沉入吸管弯曲处，避免其接触吸管内液体表面的顶部或底部，以防胚胎破裂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胚胎放入甲基纤维素后，立即使用末端装有加样枪头的木柄或塑料柄解剖针图1A用移液器小心地在甲基纤维素中重新调整胚胎的位置，使其动物极彼此直接接触。
	<ol>
		<li>利用轻柔的扫动动作，通过靠近胚胎的甲基纤维素使其重新定位，避免直接接触胚胎。让胚胎静置5分钟，使甲基纤维素在周围充分沉降。在此期间，将下一组胚胎加载到另一滴液滴中。 
		注意：避免直接接触胚胎，并特别小心不要触碰卵黄囊的任何部分，以免其轻易破裂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用玻璃针工具，小心地在每个胚胎的接触点处进行缠绕。通过轻柔的缝合动作，可将第一个胚胎的细胞拉入第二个胚胎，然后再反向拉回。完成此动作后，将针头固定在原位 2 - 3 秒，随后极缓慢地抽出针头。 
	注意：胚胎受伤后约有 2 - 3 秒的时间，两种组织似乎黏附性更强，更易相互黏连。因此，我们认为在损伤后短暂地将针头保持原位，有助于使每个胚胎的受损组织在受伤后的初始阶段保持接触。</li>
	<li>让这些胚胎在室温下静置 10 - 15 分钟。在此期间，继续在其他甲基纤维素液滴中缝合新的配对。10 - 15 分钟后，评估第一对是否仍保持连接（图2A). 
	注意：如果胚胎仍保持连接，只要胚胎发育阶段早于约30%上胚层延伸期，可重复缝合操作。通常情况下，最多可进行三次胚胎缝合尝试。若观察到胚胎似乎已连接，但连接不够牢固，可在连接边缘处进行额外缝合以加强固定。在寄生手术及孵育期间，避免摇动或移动培养皿。 
	注意：尽管胚胎处于早期发育阶段且看似脆弱，但其细胞团能够耐受较大幅度的操作即， 损伤与缝合）后仍能正常发育。然而，卵黄即使受到最轻微的触碰也可能破裂，导致胚胎死亡。使用玻璃针缝合两个囊胚时，切勿接触每个胚胎的细胞团与卵黄之间的界面。</li>
	<li>过夜孵育胚胎&#160;在28.5 °C条件下，将胚胎保留在同一培养皿和培养基中（不更换培养基）。至次日早晨，胚胎将从基本溶解的甲基纤维素液滴中释放出来。移除未成功融合的胚胎。倾去原有培养基，更换为25 ml新鲜E3培养基。 
	注意：若使用色素型品系，需加入500 µl 0.15%（50倍浓度）苯硫脲（PTU），使终浓度为0.003%，以抑制色素形成。胚胎需持续保留在PTU中，以维持对色素生成的抑制。</li>
</ol>
4. 显微镜设置、图像采集、处理与分析
<ol>
	<li>制备 0.8% 低熔点（LMP）琼脂糖：将 0.8 g LMP 琼脂糖加入 100 ml E3 溶液中，加热至完全溶解。趁热将 1 ml LMP 琼脂糖分装至 1.5 ml 微量离心管中，并置于 37 °C 加热块中。LMP 琼脂糖在 37 °C 下保持液态。在 37 °C 条件下，向每份 1 ml LMP 琼脂糖中加入 40 µl 的 4 mg/ml（25 倍浓度）、pH 7.0 的三卡因（tricaine）。注意：若操作色素型品系，需向每 1 ml 琼脂糖中额外加入 20 µl 的 0.15%（50 倍浓度）PTU。
	<ol>
		<li>将剩余的 LMP 琼脂糖密封于 50 ml 管中，可在 4 °C 保存数月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将待成像的异源嵌合胚胎麻醉：向已含有胚胎的 25 ml E3 溶液中加入 1 ml 的 4 mg/ml（25 倍浓度）、pH 7.0 的三卡因。</li>
	<li>轻轻晃动培养皿，使胚胎聚集于中央。然后使用宽口塑料移液管尽可能少地吸取液体中的胚胎。将移液管竖直，轻弹管体使胚胎沉降至移液管最底部。
	<ol>
		<li>当胚胎位于移液管底部时，将移液管尖端轻轻接触琼脂糖表面，将胚胎转移至 1 ml LMP 琼脂糖中。避免转移过多液体，以免稀释琼脂糖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>排出移液管中多余液体后，用同一移液管轻轻混匀琼脂糖中的胚胎，随后将全部琼脂糖和胚胎转移至玻璃底（No. 1.5 盖玻片）6 孔板的孔中。 
	注意：将胚胎转移至成像板后，务必丢弃该移液管。残留的琼脂糖会在管内凝固，导致其无法再次使用。每次操作均应使用新的移液管。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用固定在木柄解剖针末端的加样枪头将胚胎轻柔推至盖玻片一侧，使其贴近盖玻片（以确保其处于物镜工作距离内），并调整至理想的成像方向。 
	注意：在琼脂糖完全凝固前需持续调整胚胎位置。安装异源嵌合胚胎时，应根据需要成像的胚胎个体进行定位。由于连体胚胎的连接方向随机，部分组合可能难以同时成像两个个体。在此情况下，可用镊子和宽口塑料移液管将胚胎从琼脂糖中回收，并从不同角度重新包埋以进行成像。</li>
	<li>待琼脂糖凝固后，加入 2–3 ml 含三卡因（必要时加入 PTU）的 E3 溶液覆盖样本。</li>
	<li>使用倒置宽场落射荧光、激光扫描共聚焦或转盘共聚焦显微镜对胚胎进行成像。根据成像需求选择最合适的物镜。若需全胚胎视野，使用 4x 物镜；若需观察特定组织，可选用更高倍率物镜，如 20x 物镜16, 19。 
	注意：若使用正置显微镜，可将样本以类似上述方法包埋于 LMP 琼脂糖中，置于盖玻片上。随后将盖玻片倒扣于载玻片上，载玻片周围需涂有一圈真空脂，并填充相同的 E3-三卡因-PTU 溶液16, 19。</li>
	<li>使用免费图像分析软件（如 NIH Image J/FIJI16, 19）处理所获取的图像。 
	注意：利用分割与追踪算法对细胞数量进行计数，并量化细胞迁移、细胞分裂等动态过程16, 19。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

异体共生融合技术一直是研究成年小鼠模型和鸡胚中候选基因细胞功能的有力工具10-14。最近，已有研究描述了一种囊胚融合方法，用于生成连体的斑马鱼胚胎15。在本实验方案中，通过基于视频的教程演示并更详细地描述如何创建具有不同遗传背景的异体共生斑马鱼胚胎，以研究目标候选基因在造血发育及其他过程中所发挥的时间特异性、细胞内在性和细胞外在性作用。
本文所述方法最近被用于追踪一个胚胎中造血干细胞（HSC）的出现、通过血液循环迁移至遗传背景不同的另一胚胎，以及随后的植入与分化过程16。与Kissa研究组的发现一致，胚胎的发育阶段和相对位置被证实会影响异种共生融合的成功率及解剖学特征。通过对实验方案进行几项关键性改进，异种共生体的存活率显著提高。这些改进包括：对囊胚造成更明显的损伤，刺穿后将针头保持在原位2–3秒，随后在15分钟后重新检查囊胚配对情况，如有必要，通过额外的损伤操作加强初始连接。根据这些补充建议，几乎100%的异种共生体存活并保持连接状态，其中75%实现了共用血液循环。
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野生型与基因修饰动物之间遗传嵌合体（嵌合体）的制备&#160;是研究候选基因细胞内在功能与细胞外在功能的一种成熟且经典的方法1-6囊胚移植在斑马鱼中已被广泛用于生成嵌合胚胎，以研究细胞自主性7-9然而，根据所关注的组织类型，可能难以可重复地将供体细胞靶向至目标组织例如， 血液 1-3, 7-9小鼠遗传学家长期以来一直采用异种共生手术方法来构建具有共享血液循环系统的连体生物 10-14由于共血动物共享血液循环系统，因此可以研究来自一只动物的细胞与另一只具有不同遗传背景的动物的细胞之间的相互作用 10-16最近，Karima Kissa 团队巧妙地展示了构建连体斑马鱼胚胎的能力，并利用该系统研究造血干细胞和祖细胞（HSPC）的迁移。15此外，斑马鱼异种共生模型最近被用于研究内皮钙黏蛋白5在造血干细胞（HSC）出现与迁移过程中的作用，16 并研究斑马鱼发育过程中基质细胞在造血干细胞和祖细胞微环境中的作用 17.&#160;
与小鼠不同，斑马鱼胚胎具有透明性，可在异种共生发育过程中直接观察细胞，这使得该系统具有独特的强大优势。然而，斑马鱼异种共生技术的应用受限于较高的学习难度，且在精细的胚胎上进行异种共生手术在缺乏详细指导和可视化演示的情况下具有较高的技术挑战性。本实验方案旨在提供一套清晰、分步的操作指南，配合基于视频的教程，介绍如何通过手术融合发育中的囊胚来构建异种共生斑马鱼胚胎，以研究候选基因在时间依赖性、细胞内在或细胞外在方面的功能。文中还包括提高异种共生体存活率的关键改进措施以及新的实验应用建议。

<table><tbody><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>E3/HCR 所需的单独组分：</td><td></td><td>配制 1L 溶液：14.61 g NaCl，0.63 g KCl，2.43 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，1.99 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl（氯化钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl（氯化钾）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（二水合氯化钙）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（七水合硫酸镁）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Hepes（1 M）缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗生素：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）</td><td>Life technologies 公司旗下 Gibco</td><td>15140-120</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>来自卡那链霉菌的硫酸卡那霉素</td><td>Sigma Life Science</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>来自灰色链霉菌的 50 mg/ml 蛋白酶 K（Pronase）</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>用于制备针头的毛细玻璃管（Capillary Glass &amp;amp; Filaments）</td><td>Sutter Instrument</td><td>货号：BF 100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>带木质手柄的解剖镊（Teasing needles）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S07894</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 移液泵（绿色）（Pipette Pump Pipettor）</td><td>Novatech International</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>直径 100 mm、深度 20 mm 的塑料培养皿（PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS,&lt;br/&gt; HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG）</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664102</td><td></td></tr><tr><td>右旋糖酐，级联蓝（Cascade Blue），分子量 10,000，阴离子型，赖氨酸可固定</td><td>ThermoFisher</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>PTU。工作液浓度为 0.003%（50 倍浓缩液为 0.15%）。配制 500 ml 溶液需加入 0.75 g N-苯硫脲</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>三卡因（Tricaine，粉末）（Tricaine Methanesulfonato，Tricaine-S）</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS 222</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖（Ultrapure LMP agarose）</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>塑料移液管（仅使用宽口端）</td><td>Fisherbrand</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>用于成像的玻璃底六孔板</td><td>MatTek</td><td>P06G1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>固定在木质手柄解剖针末端的塑料 Western 上样枪头（GELoader tips）</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>若需为直立显微镜封片，则需玻璃盖玻片、载玻片及真空脂：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空脂（Dow Corning&amp;reg; 高真空硅脂&lt;br/&gt; 无色，5.3 盎司/管）</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2960-244</td><td></td></tr></tbody></table>

通过手术融合发育中的囊胚生成连体斑马鱼胚胎

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

将两种不同遗传背景的动物进行手术性异种共生（parabiosis），可创建一种独特的情境，用于研究目的基因的细胞内在作用与细胞外在作用、细胞的迁移行为以及在不同遗传背景下分泌信号分子的功能。由于异种共生动物共享血液循环系统，来自其中一只动物的血液或血液携带的任何因子都会与其伴侣动物相互交换。因此，可以在另一种遗传背景下研究源自某一遗传背景的细胞和分子因子。成年小鼠的异种共生已被&#160;广泛应用于衰老、癌症、糖尿病、肥胖和大脑发育等领域的研究。近年来，斑马鱼胚胎的异种共生被用于研究造血作用的发育生物学。与小鼠不同，斑马鱼胚胎具有透明特性，使得在异种共生环境下可直接观察细胞行为，使其成为研究基本细胞与分子机制的一种极为强大的方法。然而，该技术的应用受限于制备异种共生斑马鱼胚胎所需较高的技术学习曲线。本实验方案提供了逐步操作指南，介绍如何通过手术将两个不同遗传背景的斑马鱼胚胎的囊胚进行融合，以研究目的基因的功能。此外，异种共生的斑马鱼胚胎可耐受热激处理，从而实现基因表达的时间特异性调控。该方法无需复杂的设备，广泛适用于在胚胎发育过程中对细胞迁移、命运决定和分化等过程的体内（in vivo）研究。

与先前已发表的研究一致15，斑马鱼胚胎成功进行异时共体融合取决于两个胚胎的发育时期、相对方向以及甲基纤维素的浓度。仅使用几种简单且低成本的工具，即可通过手术融合正在发育的囊胚，使其发育为具有共享血液循环的异时共体胚胎。这些工具包括一支经改造的巴斯德移液管、一个10 ml移液泵，以及带木质手柄的解剖针，后者可单独使用，也可在末端通过实验室封膜固定加样枪头或玻璃显微注射针后使用（图1）。
将两个囊胚置于4%甲基纤维素中，并使用加样枪头调整其位置，使它们的动物极相对（图2A），然后用玻璃显微注射针在两个胚胎接触点处小心地造成损伤（图2B）。更严重的损伤（比较图2B与图2C），以及对胚胎对重新进行额外损伤以加强初始连接，可提高胚胎维持连接并成功融合的可能性（<strong...

本方案详细介绍了如何制备具有不同遗传背景的嵌合型斑马鱼胚胎。结合斑马鱼胚胎无与伦比的成像能力，该方法为研究目的基因的细胞自主性与非细胞自主性功能提供了极为强大的手段。

通过将两种不同遗传背景的动物进行手术性异种共生，可创建一种独特的情境，用于研究细胞内在因素与细胞外在因素在……中的作用

本方法的总体目标是构建共生斑马鱼胚胎，可用于研究目的基因的细胞自主性与非细胞自主性功能。该方法有助于解答细胞自主性的关键问题。例如，在造血系统中，造血干细胞迁移过程中的重要缺陷究竟是源于造血干细胞本身，还是其所在的微环境。本方案的主要优势在于能够更成功地制备连体共生斑马鱼胚胎。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，因为发育中的胚胎极为脆弱，容易受损。该方法的视觉化演示至关重要，因为手术缝合步骤学习难度较高，需要极高的准确度与精确度。本文提供了通过手术融合发育中的囊胚来制备共生斑马鱼胚胎的逐步操作说明。该方法展示了如何提高共生融合的效率，并增强连体胚胎的存活率。根据文本方案准备试剂和工具后，通过在本生灯上短暂加热移液管末端，制备两到三根改良的巴斯德移液管。然后，使用大号镊子，在移液管仍然温热时，将其末端弯曲约45度。为确保末端无锋利边缘而可能损伤胚胎，将移液管末端置于本生灯火焰上灼烧1至2秒。使用血浆DNA、mRNA或吗啉代寡核苷酸，在收集胚胎后1小时内进行显微注射，并让胚胎发育至256细胞期。当胚胎接近256细胞阶段时，将每种遗传背景的胚胎分别转移至经琼脂糖包被的无划痕玻璃烧杯或培养皿中。根据正文方案去壳后，解冻先前配制的甲基纤维素，并使用台式离心机以最高速度离心，使未溶解的晶体沉淀，以免这些晶体损伤胚胎或导致卵黄破裂。同时，使用记号笔在100毫升琼脂糖包被培养皿的底部标记12至15个预先确定的位置。然后，离心后取甲基纤维素的上清液，将1至1.5厘米的液滴转移至培养皿中标记的位置。接着，为刚刚准备好的每个琼脂糖包被的培养皿，分别准备一份40毫升的高钙林格液（HCR溶液）。向每份溶液中加入此处列出的抗生素。当准备进行囊胚融合时，使用含有抗生素的HCR分装液小心地填充每个含有甲基纤维素液滴的培养皿，注意不要破坏液滴。将先前制备的改良玻璃巴斯德吸管连接到10毫升移液器泵上。然后，在体视显微镜下，从每种遗传背景中各收集一个去壳胚胎。在分配两个胚胎之前，先用巴斯德吸管在甲基纤维素液滴中央制造一个小凹陷。然后将两个胚胎放入该凹陷中。接着，使用末端带有凝胶上样尖端的解剖针，以轻柔的扫动动作在不直接接触胚胎的情况下，仔细调整胚胎在甲基纤维素中的位置，使它们的动物极彼此直接接触。正确地定位正在发育的胚胎决定了胚胎的融合方式和发育过程。对于头对头融合，需确保每个胚胎的动物极对齐。让胚胎静置五分钟，使甲基纤维素在其周围充分沉降。在此期间，将下一对胚胎放入另一个液滴中。进行手术时，使用玻璃针工具，在两个胚胎的接触点处小心地将其切开。然后以轻柔的缝合动作，将第一个胚胎的细胞拉入第二个胚胎，再返回第一个胚胎。动作结束时，将玻璃针停留于原位两到三秒，再极其缓慢地抽出。玻璃针操作的精确性至关重要，以确保胚胎被正确缝合。操作时需格外小心，避免损伤卵黄囊，同时维持足够的连接以实现成功融合。将胚胎在室温下静置10至15分钟。在此期间，继续缝合其他胚胎对。孵育结束后，评估胚胎是否仍保持连接，必要时重复损伤步骤。将胚胎留在同一培养皿和培养基中，在28.5摄氏度下过夜孵育。次日早晨，胚胎将从大部分已溶解的甲基纤维素中脱离。移除任何未成功融合的胚胎。然后，倾去培养基，并用 25 毫升 E3 培养基替换。为了获取融合胚胎的图像，配制 0.8% 的低熔点琼脂糖。在仍处于高温状态时，将 1 毫升琼脂糖分装至置于 37 摄氏度加热块中的 1.5 毫升离心管中。通过向含有胚胎的25毫升E3培养基中加入1毫升浓度为4毫克/毫升、pH值为7.0的三卡因，使异体共生胚胎麻醉。轻轻晃动培养皿，使胚胎聚集于中央。然后使用宽口塑料移液管，尽可能少地吸取液体，将胚胎吸入管中。接下来，将移液枪垂直向上，轻轻弹动胚胎，使其沉降至移液枪吸头的最底部。然后，轻轻将移液枪尖接触低熔点琼脂糖表面，将胚胎转移至1毫升低熔点琼脂糖中。弃去移液枪中多余的液体，并用移液枪轻轻混匀琼脂糖中的胚胎。然后，用移液器将琼脂糖和胚胎转移至玻璃底六孔板的孔中。在体视显微镜下，使用固定在解剖针末端的加样枪头将胚胎调整至靠近盖玻片的位置，并使其处于成像所需的方位。待琼脂糖凝固后，向孔中加入含三卡因的培养基，随后使用倒置的宽场落射荧光激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜采集图像。对于整个胚胎的视野，使用 4X 物镜。使用 20X 物镜对特定组织进行成像。根据文本方案处理图像。如图所示，在将两个囊胚的动物极相对排列后，小心地在其接触点处造成伤口。伤口程度越大，胚胎越有可能保持连接，从而在不产生额外形态缺陷或发育延迟的情况下实现成功融合。如本图所示，通过将两个囊胚的动物极精确对齐，可稳定地获得头对头或卵黄囊对卵黄囊的融合体，并具有共用的循环系统。大多数情况下，胚胎具有两个心脏，共同泵送一套共享的血液循环系统。为了证实胚胎确实共享血液循环，将表达GFP阳性红细胞的转基因胚胎与表达mCherry阳性血管内皮细胞的胚胎进行融合。如本视频所示，在受精后48小时，可观察到GFP阳性的红细胞在Flik 1 HRAS mCherry标记的伙伴胚胎中循环流动。最后，为了研究基因表达的时间调控，将其中一个胚胎注射了 hsp70 EGFP DNA 构建体。在 37 摄氏度下进行短暂的 30 分钟热激后，其中一个胚胎中出现了明显的 GFP 信号，某些情况下，在未注射的配对胚胎中也观察到 GFP 阳性细胞在循环。一旦掌握，该技术若操作得当，可在五小时内完成。在进行该操作时，需注意在缝合两个囊胚时务必小心谨慎；若首次手术未能成功，应重新尝试融合。在完成该操作后，可进一步采用活细胞成像等其他方法来回答更多科学问题，例如野生型造血干细胞在突变型微环境中是否能正常发挥功能，或反之，突变型造血干细胞在野生型微环境中是否具备正常功能。该技术为血液学领域的研究人员提供了一种强有力的手段，可用于研究斑马鱼血液发育的调控机制。请务必注意，三卡因可能具有危险性，在进行本实验操作时，应始终采取佩戴适当安全防护装备等预防措施。在观看本视频并遵循我们推荐的技术方法后，我们希望您能够更成功地获得高质量的斑马鱼胚胎。

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发育生物学

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