使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

本实验的总体目标是利用非洲爪蟾卵和胚胎提取物建立一种检测方法，使较大的细胞核能够缩小较小的细胞核。该方法有助于回答细胞核生物学中的关键问题，例如调控细胞核大小的机制是什么？该技术的主要优势在于，可以轻松操控非洲爪蟾无细胞提取物的组成和活性，以评估影响细胞核大小的因素。

根据文本方案制备好非洲爪蟾卵提取物、去膜精子和组装的细胞核后，通过将青蛙置于玻璃制的可重复使用培养皿上方来收集 freshly laid 卵。通过轻压靠近泄殖腔的下背部来促进排卵。将培养皿以约 45 度角倾斜支撑，使卵沿培养皿边缘聚集。

然后，去除多余的缓冲液，并加入足量的三分之一倍 X MMR，以刚好浸没卵子。使用贴合紧密的研杵，在1.5毫升离心管中将四分之一个睾丸与500微升高盐改良巴氏生理盐水（Modified Barth's Saline，MBS）一起研磨并均质化。随后将研磨后的睾丸组织加入卵子中，在室温下孵育15分钟以完成受精过程。

孵育后，用三分之一浓度的X MMR溶液浸没卵子。随后，5至10分钟后，通过观察深色色素动物极是否收缩以及胚胎是否发生旋转（动物极朝上）来确认受精情况。使用宽口塑料移液管仔细去除死亡、裂解或未受精、未分裂的卵子，因为这些卵会迅速导致邻近胚胎死亡。

受精后1至2.5小时，在含2%至3%半胱氨酸且pH值调至7.9的1/3倍浓度MMR溶液中去除胚胎胶质膜。去胶前，胚胎占据相对较大的体积。更换缓冲液两次，每次持续3至4分钟。

随后，用六到十次短暂更换三分之一倍浓度的MMR溶液彻底清洗胚胎，以去除所有半胱氨酸残留。去胶膜后，胚胎会紧密聚集，占据相对较小的体积。接下来，使用宽口玻璃移液管将健康且已受精的胚胎转移至含有新鲜三分之一倍X MMR溶液的培养皿中。

在室温下让胚胎发育至所需阶段。根据未发生第一次分裂或呈现白色、肿胀外观来判断，及时清除死亡或裂解的胚胎。当胚胎发育至11.5至12期时，将其转移至新鲜的1/3倍浓度X MMR溶液中，该溶液需添加0.5毫摩尔的环己酰亚胺，于室温下孵育胚胎1小时，以使其停滞在晚间期。

使用宽口玻璃或塑料移液管，将至少15个处于分裂间期阻滞的胚胎转移至一个微量离心管中。向胚胎中加入1毫升裂解缓冲液（ELB），并添加1微升LPC储备液。轻轻颠倒混匀管子，以洗涤胚胎。

然后让胚胎沉降到管底。在去除缓冲液前，重复洗涤两次。将胚胎重悬于500 µL ELB中，并加入0.5 µL LPC储备液、5 µL 19.7 mM环己酰亚胺和5 µL 35.5 mM细胞松弛素D，以抑制肌动蛋白聚合。

将样品在台式离心机中以200 × g离心1分钟，然后去除多余的缓冲液，并用研杵充分研磨胚胎。将研磨后的样品置于摆桶转子中，于16 °C以10,000 × g离心10分钟。用200 µL移液器枪头从顶部刺穿脂质层，再用新的洁净枪头吸取中间的琥珀色细胞质层至适当大小的离心管中。

向胚胎提取物中加入以下试剂，然后轻轻倒置离心管以混匀。接着，按照文本方案制备压片，观察提取物中内源性胚胎细胞核，随后通过加入等体积含有此处所列试剂的ELB缓冲液，从提取物中去除细胞核。

轻轻倒置离心管以混匀。将样品在摆动桶转子中以17,000 × g、16 °C离心15分钟。随后小心收集上清液，注意避免吸取顶部残留的脂质，同时保持底部沉淀的细胞核不受扰动。

按照文本方案中的描述制备匀浆，以确保大部分细胞核已被去除。然后使用新鲜提取物，或对样品进行分装，并在负80摄氏度下保存。通过在1.5毫升离心管中将25至150微升预组装的细胞核稀释于1毫升ELB缓冲液中，从卵提取物中分离组装的细胞核。

在 1600 × g、4 °C 条件下离心 3 分钟。然后小心去除上清液，注意不要扰动沉淀。向沉淀中加入与原始卵提取物体积相等的胚胎提取物，轻轻敲击离心管以破碎沉淀并重悬细胞核。

室温孵育90分钟，每15至30分钟轻轻敲击管壁以混匀。孵育结束后，在加入500 µL含15%甘油和2.6%多聚甲醛的ELB缓冲液前，轻敲管壁使细胞核重新悬浮。立即颠倒混匀管子，并将管子置于室温旋转仪上旋转15分钟。

通过在15毫升圆底玻璃管中安装圆底塑料内衬来制备沉降管。加入5毫升细胞核缓冲垫溶液，然后将12毫米圆形盖玻片轻轻放入管中，确保其平放在塑料内衬上。使用宽口移液器吸头，将固定后的细胞核溶液轻柔地铺加在细胞核缓冲垫上方。

在1,000 × g、16 °C条件下，使用水平转子离心机离心15分钟。随后，用抽吸装置移除所有缓冲液，并将塑料插件固定在管子顶部。然后，用一对精细镊子小心取出盖玻片，注意记录细胞核被离心到的盖玻片面。

将盖玻片在室温下用冷甲醇固定5分钟。将盖玻片有细胞核的一面朝上转移至一个大型塑料培养皿内衬的石蜡膜上。然后在培养皿边缘放置湿润的一次性擦拭巾，以防止脱水。

用 500 微升 PBS NP40 将盖玻片上的细胞核重悬，孵育 5 至 10 秒后吸去。然后，小心地在盖玻片上覆盖 75 微升 PBS 3% BSA，室温下封闭 1 小时，或 4 摄氏度过夜。移除封闭液后，加入用 PBS 3% BSA 稀释的一抗进行孵育。

然后用五次快速更换的 PBS NP40 溶液洗涤样品。用二抗重复上述孵育和洗涤步骤。在室温下，用含 3% BSA 的 PBS 稀释的 10 µg/mL Hoechst 溶液孵育 5 分钟。

然后用 PBS NP40 洗涤五次，并彻底去除多余的缓冲液。最后，将盖玻片用 5 µL 抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片边缘，并立即使用落射荧光显微镜进行成像，或于 40 °C 保存以备后续成像使用。

该图展示了卵提取物中细胞核的组装过程。反应开始后30-45分钟，细长的S形精子核应逐渐增厚，形成蛞蝓状的染色质团块。随着细胞核的组装完成，核形态将变得更加圆润，同时核膜扩张并导入核蛋白，导致核体积增大。

如图所示，取少量胚胎提取物进行Hoechst染色后压片，可见大量染色的细胞核，表明提取物制备成功。经离心去除细胞核后，与第一次压片相比，本图中显示提取物中仅残留极少细胞核，从而确保内源性细胞核不会干扰后续分析。若仍有细胞核残留，需进行第二次离心。

在此细胞核收缩实验中，将卵提取物中的细胞核重悬于晚期胚胎提取物中，细胞核会随着时间推移成功缩小。然而，在加热失活的胚胎提取物中孵育的细胞核则不会发生收缩。为应对该实验固有的变异性，重复多次实验至关重要。

一旦掌握，整个实验方案可在两天内完成，其中细胞核收缩检测本身约需四小时。在进行此操作时，重要的是要始终对卵子和胚胎进行质量检查，并在离心后收集胞质提取物时格外小心，避免触及沉淀和脂质层。通过遵循本方案所获得的结果应经过验证。

例如，我的胚胎显微注射或细胞培养转染实验。此外，该方法还可用于探索其他细胞器大小的调控机制。该技术建立后，为核细胞生物学领域的研究人员探索核大小的调控机制，以及核大小在发育和致癌过程中的功能作用开辟了道路。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何组装和分离非洲爪蟾卵提取物中的细胞核，制备非洲爪蟾胚胎及胚胎提取物，开展细胞核收缩实验，并对实验结果进行可视化观察。