Name: 无细胞测定中使用非洲爪蟾胚胎提取研究核的大小调节机制。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: 学习利用非洲爪蟾卵和胚胎提取物建立无细胞核大小调节测定法，通过操控提取物成分研究核动态变化。该方法为细胞生物学研究提供有价值的实验工具。

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Levy 实验室和 Gatlin 实验室的成员以及分子生物学系的同事们提供了有益的建议和讨论。Rebecca Heald 在本实验方案的早期开发阶段提供了支持。本研究工作由美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS，项目号 R15GM106318）和美国癌症协会（American Cancer Society，项目号 RSG-15-035-01-DDC）资助。

所有 Xenopus 相关操作和研究均遵循《美国国家研究委员会实验动物护理与使用指南》第8版。相关方案已获怀俄明大学机构动物护理和使用委员会（认证编号 # A-3216-01）批准。
1. 准备 X. laevis 卵母细胞提取物（改编自27,28)
<ol>
	<li>在采集卵子前至少三天至最多两周，对雌性&#160;X. laevis&#160;青蛙进行初次处理，注射一次100 IU的孕马血清促性腺激素（PMSG）。</li>
	<li>实验前一天，向已处理的青蛙注射800 IU的人绒毛膜促性腺激素（HCG），并将其置于每只青蛙1 L的1/3x Marc's改良林格液（MMR）中，温度保持在16 °C。所有缓冲液的配方见表1。 
	&#8203;注意：部分青蛙可能不产卵或产出质量较差的卵。通常需注射2–3只青蛙，以确保至少有一只青蛙能产出足够数量且质量良好的卵。平均每只青蛙产出的卵可制备至少1 ml的卵提取物。</li>
	<li>使用冷的去离子蒸馏水（ddH2O）配制1 L的1/3x MMR，并准备500 ml缓冲液B、1 L缓冲液C、500 ml缓冲液D和100 ml缓冲液E。</li>
	<li>将产出的卵转移至玻璃结晶皿（150 × 75 mm）中。使用剪去尖端的塑料巴斯德吸管，去除白色蓬松的已激活卵或破裂卵。仅保留具有清晰且均等的深色动物极和白色植物极的卵。</li>
	<li>准备13 × 51 mm离心管，每管加入1 ml缓冲液E，并在步骤1.7使用前立即加入355 µM细胞松弛素D。</li>
	<li>去胶并清洗卵子。
	<ol>
		<li>用适量烧杯中的冷1/3x MMR短暂清洗卵子，更换缓冲液3–4次。</li>
		<li>通过与缓冲液B孵育去除卵子的胶膜，此过程需3–10分钟。当浑浊的胶膜从卵子上脱落时，更换缓冲液。 
		&#8203;注意：当倾斜培养皿时，卵子紧密聚集在角落且植物极朝下，则表明去胶完成。去胶后的卵子更为脆弱，因此避免使用缓冲液B孵育过长时间，后续清洗操作也需格外小心。</li>
		<li>用缓冲液C更换3–4次，短暂清洗卵子。</li>
		<li>用缓冲液D更换2次，短暂清洗卵子。</li>
		<li>用缓冲液E更换2次，短暂清洗卵子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用宽口玻璃移液管或塑料滴管将卵子装入离心管中。吸除多余缓冲液。为压实卵子并尽可能去除缓冲液，在摆动桶转子中以212 × g离心60秒，随后以478 × g离心30秒。再次吸除多余缓冲液。 
	&#8203;注意：此步骤中应尽可能去除多余的缓冲液，以确保卵提取物的稀释程度最小。</li>
	<li>在摆动桶转子中，于4 °C条件下真空超速离心15分钟，转速为12,000 × g，以破碎卵子并使其分层，其中胞质为中间琥珀色层。取出离心管后立即置于冰上。</li>
	<li>收集提取物。
	<ol>
		<li>使用18号针头和注射器，在离心管底部深色色素层上方刺穿管壁，吸取中间琥珀色的胞质层。避免吸取顶部的脂质层。将胞质收集至适当大小的试管中。 
		注意：通常每只青蛙可产生至少1 ml提取物。</li>
		<li>向胞质中添加终体积1/1,000的19.7 mM细胞松弛素D、1/1,000体积的LPC储备液以及1/50体积的50×能量混合液。轻轻颠倒混匀。切勿反复吹打提取物。</li>
		<li>将提取物保持在冰上，并在制备后3小时内使用，以获得最佳效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 去膜精子的制备 X. laevis 精子（改编自29)
注意：此处提供的操作体积适用于最多8个睾丸。
<ol>
	<li>从4中移除0.05%苯佐卡因（10%苯佐卡因储备液用乙醇配制，并用蛙养殖水稀释至0.05%） &#176;C，并升温至室温。麻醉并处死雄性 X. laevis 将青蛙置于室温下的苯佐卡因溶液中 20 - 30 分钟。通过检查并触摸胸部区域确认无心跳、对机械刺激无反应和/或进行断头，以确保动物死亡。</li>
	<li>沿腹部做U形切口，移除呈管状的黄色脂肪体。在肾脏上端找到睾丸，睾丸呈卵圆形、淡粉色，长约1 cm29切除睾丸，并在吸水纸上滚动以去除血液和其他组织。</li>
	<li>用Buffer T冲洗睾丸。将睾丸置于1.5 ml离心管中，加入1 ml Buffer T，使用紧密适配的研杵研磨至匀浆（10次或更多次）。在小型离心机中离心5–10秒，收集上清液，并去除较大的组织碎片。再次离心一次，收集上清液。</li>
	<li>将含有精子的溶液转移至一个15 ml塑料管中，用Buffer T将体积调至总共2 ml。在16℃下以1,411 × g离心10 min &#176;C 以沉淀精子。</li>
	<li>移去上清液，将沉淀重悬于 500 &#181;缓冲液T中，于16℃、1,411 × g离心10分钟 &#176;C. 根据需要重复此步骤一至两次，以清除沉淀中的体细胞和红细胞。</li>
	<li>将沉淀重悬于100 &#181;l 缓冲液 T 和 300 &#181;l 缓冲液 S。室温孵育 5 分钟。 
	注意：缓冲液 S 含有溶血卵磷脂，该成分负责去膜化。</li>
	<li>加入三倍体积的缓冲液 R（使用前新鲜配制）。将离心管颠倒一次。在 16℃ 下以 1,411 × g 离心 15 分钟 &#176;C.</li>
	<li>将沉淀重悬于 400 &#181;l 缓冲液 R，然后再加入 2 ml 缓冲液 R。在 16℃ 下以 1,411 x g 离心 15 分钟 &#176;C.</li>
	<li>将沉淀重悬于 50 &#181;缓冲液 T</li>
	<li>稀释 1 &#181;去膜精子核与9 &#181;l 缓冲液 T。将此稀释液加入血细胞计数板。计数一个大的 4 × 4 方格内细长 S 形精子核的数量，再将该数值乘以 100，得到原液中每微升精子核的浓度 &#181;l.</li>
	<li>将原液稀释至每微升含100,000个精子细胞核 &#181;用缓冲液 T 溶解，配制成 200 倍浓缩储备液。准备 3 - 5 &#181;l 分装。液氮中速冻，-80℃保存 &#176;C.</li>
</ol>
3. 细胞核组装
<ol>
	<li>在100 µl卵提取物中加入1.5 µl 35.5 mM环己酰亚胺（终浓度约0.5 mM）、6 µl 20倍钙储存液（终浓度约0.6 mM）和0.7 µl 200倍精子溶液（终浓度约700个精子核/µl）。根据需要调整反应体积。通过倒置或轻弹混匀。 
	&#8203;注意：从分裂中期转换至间期的提取物可为核组装提供更稳定且可靠的平台。</li>
	<li>在16 - 20 °C水浴中孵育90分钟。每隔15分钟轻弹混匀一次，以确保核在提取物中保持悬浮状态。</li>
	<li>在45分钟时通过制备压片监测核组装进程，步骤如下：
	<ol>
		<li>用移液器将2 µl提取物滴加到玻片上，再加入2 µl核固定液。</li>
		<li>覆盖22 mm2盖玻片。使用落射荧光显微镜，配合水镜、油镜或干镜20 - 100倍物镜以及DAPI滤光片进行成像。 
		&#8203;注意：可通过明场成像观察核，但荧光成像更易于观察。</li>
		<li>立即使用核，或在液氮中快速冷冻分装样品，并于-80 °C保存。 
		注意：在冷冻前向核中添加4%甘油有助于维持其完整性。冷冻后的核通常仍具有活性并能进行核输入，但冷冻过程可能导致核结构破坏或变得更为脆弱。冷冻后一年内的核仍可使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 准备 X. laevis 胚胎提取物
<ol>
	<li>诱导雌性 X. laevis 青蛙产卵，具体步骤如1.1和1.2所述。</li>
	<li>从雄性个体中分离睾丸 X. laevis 青蛙的处理如2.2所述。将睾丸浸入添加了50 IU/ml青霉素和链霉素的L15培养基中，置于玻璃培养皿（35 × 10 mm）内。4℃保存 &#176;C，最长可保存两周。</li>
	<li>收集并使卵子受精。
	<ol>
		<li>将青蛙置于可重复使用的玻璃培养皿上方，轻轻按压泄殖腔附近的下背部以促进排卵，收集 freshly laid 的卵。&#160;过度挤压青蛙可能导致受伤，引发腹部肿胀，并需要实施安乐死29.</li>
		<li>将培养皿倾斜约45&#176; 角度倾斜，使卵子聚集于培养皿边缘，除去所有过量缓冲液，加入足量1/3x MMR溶液以刚好浸没卵子。在收集后15分钟内进行卵子受精。</li>
		<li>使用紧密贴合的研杵在1.5 ml离心管中研磨并匀浆1/4个睾丸，加入500 &#181;高盐改良 Barth 氏生理盐水（High Salt MBS）中。将研碎的睾丸加入卵子中，在室温下孵育 15 - 20 分钟以完成受精，随后用 1/3x MMR 液淹没卵子。 
		&#8203;注意：睾丸组织的效力随储存时间延长而降低，因此当使用储存超过一周的睾丸组织进行受精时，可能需要更多组织以确保受精成功。</li>
		<li>通过观察深色色素动物极的收缩以及胚胎旋转后动物极朝上来确认受精，通常在加入破碎睾丸后约 20 - 30 分钟进行。预期第一次卵裂在 90 分钟内发生。</li>
		<li>使用宽口玻璃移液管仔细去除死亡（发白、肿胀或卵黄与色素分布不均）、裂解或未受精的卵即，未切割），因为它们会迅速导致邻近胚胎死亡。</li>
		<li>受精后1至2.5小时，在含2%–3%半胱氨酸（溶于1/3倍浓度MMR溶液并用10 N KOH调节pH至7.9）的溶液中去除胚胎的胶状膜。更换缓冲液两次，每次持续3–4分钟。用1/3倍浓度MMR溶液快速换液6–10次，彻底清洗胚胎，以完全去除残留的半胱氨酸。 
		注意：去胶胚胎具有卵黄膜，不像去胶卵子那样脆弱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用宽口玻璃移液管，转移健康的已受精（即， 将切割后的胚胎转移至含有新鲜1/3x MMR的培养皿中，在室温下培养至所需发育阶段；若需减缓发育速度，可于16℃培养 &#176;C. 继续移除已死亡或裂解的胚胎，其特征为未发生第一次分裂或呈现白色蓬松状外观。</li>
	<li>通过检查胚孔是否几乎完全闭合，并与参考材料中已知发育阶段胚胎的图示进行比对，以确认胚胎的发育阶段24. 
	注意：在 16 ℃ 培养的胚胎 &#176;C 将在约 12 小时内达到 11.5 - 12 期。</li>
	<li>在室温下，将11.5–12期胚胎孵育于新鲜的1/3×MMR溶液中，加入0.5 mM环己酰亚胺，孵育1小时，以使胚胎停滞于晚间期。</li>
	<li>使用宽口玻璃或塑料移液管，将至少15个（最好30个或更多）处于分裂间期阻滞的胚胎转移至微量离心管中。 
	注：15个胚胎足以产生约20 &#181;提取物的量。根据需要按比例放大。</li>
	<li>加入1 ml补充有1的卵裂解缓冲液（ELB） &#181;加入1毫升LPC储备液，轻轻倒置以清洗胚胎，待胚胎沉降至管底后，吸除缓冲液。重复此清洗步骤两次。</li>
	<li>将胚胎重悬于 500 &#181;ELB 加 0.5 升 &#181;5 μl 的 LPC 储液 &#181;19.7 mM 环己酰亚胺溶液 5 μl &#181;35.5 mM 细胞松弛素 D 溶液（用于抑制肌动蛋白聚合）。在台式微量离心机中以 200 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>除去多余缓冲液，用研杵充分研碎胚胎。在16℃下，以10,000 × g离心10分钟，使用摆桶转子。 &#176;C.</li>
	<li>从顶部用200 μL枪头刺破脂质层 &#181;l 移液器吸头。使用一个洁净的 200 &#181;用移液器吸头吸取中间琥珀色的细胞质层至适当大小的离心管中。</li>
	<li>向胚胎提取物中添加体积为1/50的50倍能量混合液（以提供ATP再生系统）、体积为1/100的35.5 mM环己酰亚胺、体积为1/500的19.7 mM细胞松弛素D，以及体积为1/1,000的LPC储备液。</li>
	<li>按照3.3节所述制备压片，以观察提取物中的内源性胚胎细胞核。 
	注意：此时可将含有内源性细胞核的胚胎提取物分装后冻存，以减少冻融次数，并于 -80 ℃ 保存。 &#176;C.</li>
	<li>为去除胚胎提取物中的细胞核，用等体积的 ELB 稀释提取物，其中包含 1/50 体积的 50x 能量混合液、1/100 体积的 35.5 mM 环己酰亚胺、1/500 体积的 19.7 mM 细胞松弛素 D 和 1/1,000 体积的 LPC 储存液。在 16°C 下，使用水平转子于 17,000 × g 离心 15 分钟 &#176;C.</li>
	<li>收集上清液，注意避免触及顶部残留的脂质，切勿扰动试管底部的沉淀细胞核。按照3.3步骤所述制备压片，以确认大部分细胞核已被去除。提取物可新鲜使用，或分装后于-80℃保存。 &#176;C.</li>
	<li>为进行对照实验而热灭活胚胎提取物时，将30 - 100 &#181;l 提取物的等分试样在 56 &#176;使用热循环仪在30分钟内升至C温度。使用前，让热灭活的提取物恢复至室温。</li>
</ol>
5. 细胞核收缩检测与免疫荧光
<ol>
	<li>在卵提取物中组装的细胞核，通过稀释25 - 150 &#181;将1 ml ELB中的预组装细胞核加入1.5 ml离心管中。在4℃下以1,600 × g离心3分钟 &#176;在台式微量离心机中离心。移除上清液，注意不要扰动管底脆弱的细胞核沉淀。</li>
	<li>将核重悬于与5.1步骤中所用卵提取物体积相等的胚胎提取物中。对照反应根据需要使用ELB或热灭活提取物。</li>
	<li>轻轻敲击离心管以打散沉淀并重悬细胞核。室温孵育90分钟，每隔15至30分钟轻轻敲击管壁以混匀。注意：大部分细胞核收缩发生在前30分钟内。</li>
	<li>通过制备压片来监测细胞核收缩的进程。
	<ol>
		<li>移液器 2 &#181;将 l 提取物加到玻璃载片上，加入 2 &#181;l 细胞核固定。</li>
		<li>覆盖一个22 mm2 盖玻片。在落射荧光显微镜下观察成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻敲击试管，使核充分重悬，然后加入500 &#181;加入由ELB、15%甘油和2.6%多聚甲醛组成的固定液。立即颠倒混匀，并将试管置于旋转仪上，室温孵育15分钟。</li>
	<li>通过在15 ml圆底玻璃管中安装圆底塑料插入件（设计和示意图可应要求提供）来准备离心管。加入5 ml核缓冲液。将12 mm圆形盖玻片轻轻放入管中，确保其平放在塑料插入件顶部。</li>
	<li>使用宽口移液吸头，将含有固定细胞核的溶液轻轻铺加到细胞核垫上。在摆动桶转子中以1,000 × g离心15分钟，温度设为16℃ &#176;C.</li>
	<li>使用移液器吸除所有缓冲液，并将塑料插入物拉至管子顶部。用精细镊子小心取下盖玻片，注意记录细胞核被离心附着的一侧。在预冷的甲醇（-20℃保存）中进行后固定&#176; C）在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将盖玻片（细胞面朝上）转移至铺有塑料石蜡膜的大号塑料培养皿中。在培养皿边缘放置湿润的一次性擦拭巾，以防止脱水。</li>
	<li>用500 μL缓冲液重悬盖玻片上的细胞核 &#181;PBS-NP40（1× PBS 加 0.1% NP40）中孵育，5–10 秒后吸除</li>
	<li>小心地分层加入75 &#181;将1毫升PBS-3%牛血清白蛋白（BSA）加入盖玻片上，室温孵育1小时或4℃过夜以进行封闭。 &#176;C.</li>
	<li>去除封闭液，加入一抗（例如， 针对核孔复合体的 mAb414 抗体，1:1,000，用 PBS-3% BSA 稀释，在室温下孵育 1 小时或 4 ℃ 过夜 &#176;C. 用 PBS-NP40 立即更换五次进行洗涤。</li>
	<li>在 PBS-3% BSA 中稀释二抗，室温孵育 1 小时。用 PBS-NP40 快速更换洗涤五次。</li>
	<li>孵育 10 &#181;g/ml Hoechst 溶于 PBS-3% BSA，室温孵育 5 分钟。用 PBS-NP40 洗涤五次。去除所有过量缓冲液。</li>
	<li>将盖玻片用 5 &#181;l 抗荧光淬灭封片剂。用透明指甲油封片。立即使用配备20 - 100倍物镜的落射荧光显微镜观察成像，或于4℃保存 &#176;C，用于后续成像。 
	注意：按照先前所述方法进行定量分析23.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种研究细胞核大小调控机制的新方法 X. laevis 发育。发育进程伴随着细胞生理学、代谢、分裂速率和迁移的显著变化，以及细胞和细胞内结构大小的改变。这些多样化的过程复杂且至关重要，因此很难单独研究发育的某一个方面 体内 环境。 X. laevis 此处描述的胚胎提取物及细胞核收缩实验可用于研究尺寸调控机制 体外 环境，绕过复杂的信号和物理限制 体内 系统。此外，该提取物的开放性使其易于进行生化操作。
该实验方案中某些步骤可能需要进行故障排查。核组装和生长过程中出现问题，可能源于卵子质量差、精子核去膜不完全、精子核浓度过高，或核组装反应孵育温度过低。由于晚期胚胎提取物中的内源性胚胎核体积较小，去除这些核可能较为困难。该步骤可能需要进行多轮离心，或使用其他类型的转子，才能完全去除所有核。在核收缩实验中，若核未出现体积缩小，可能是由于胚胎质量不佳、起始核体积过小，或孵育温度过低所致。卵子和胚胎质量差的表现包括：大量呈白色蓬松状的激活卵、卵黄和色素颗粒分布不均，以及卵呈串状产出。将固定后...

细胞器的大小通常与细胞大小成比例，其中细胞核大小与细胞大小的比例关系可能是这方面记录最为详尽的例子1-10这一点在胚胎发生和细胞分化过程中尤为明显，此时通常会观察到细胞和细胞核尺寸的显著减小11,12此外，细胞核大小的改变是癌症诊断和预后判断的关键参数13-17核大小调控机制在很大程度上尚不清楚，部分原因在于核结构与功能的复杂性和重要性。本文所述方法是作为一种 体外 一种适用于生化操作并可用于阐明细胞核大小调控机制的细胞核大小比例测定方法。
Xenopus laevis 卵母细胞提取物是用于重现和研究复杂细胞过程的成熟体系 体外 这些提取物揭示了关于多种细胞过程（包括有丝分裂纺锤体、内质网和细胞核的组装与功能）的新基本信息18-22提取系统的一个关键优势在于 X. laevis 卵母细胞提取物几乎代表了未稀释的细胞质，其成分易于改变，例如通过添加重组蛋白或进行免疫耗竭。此外，可通过使用某些处理手段来操控关键的生物学过程，而这些处理在完整细胞中可能会导致细胞死亡 体内 背景下。对卵提取物实验步骤的改进可实现从不同来源分离提取物 X. laevis 胚胎而非卵子，且这些胚胎提取物同样适用于生化操作23. 在……期间 X. laevis 发育过程中，单细胞受精卵（直径约1 mm）经历连续十二次快速细胞分裂（阶段1–8），产生数千个直径为50 µm及更小的细胞，达到称为中囊胚转换（midblastula transition, MBT）或阶段8的发育时期24-26MBT 的特征包括合子转录的启动、细胞迁移、不同步的细胞分裂、获得裂期（gap phases），以及核体积稳态的建立，而非 MBT 前胚胎中持续的核扩张。从 4 期到原肠胚形成期（10.5–12 期），单个细胞核的体积减少了 10 倍以上。11.
本研究的目的是确定在发育过程中导致细胞核尺寸减小的机制。该方法首先在X. laevis卵提取物中组装细胞核，并将这些细胞核从卵细胞质/提取物中分离出来。随后将这些细胞核重悬于晚期原肠胚阶段胚胎的细胞质中。经过一段时间的孵育后，来源于卵提取物的细胞核在晚期胚胎提取物中体积变小。我们推断，该实验体系可用于鉴定晚期胚胎细胞质中参与发育过程中细胞核尺寸缩放的组分。结合该检测方法与体内验证，我们证明了蛋白激酶C（PKC）参与了X. laevis23发育过程中细胞核尺寸的减小。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP 二钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>苯佐卡因</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>离心机转子</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸二钠</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素 D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>一次性擦拭纸（kimwipes）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>玻璃结晶皿（150 × 75 mm）</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - 双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - 人绒毛膜促性腺激素&amp;nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>溶血卵磷脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>麦芽糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 + 链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>塑料石蜡膜（parafilm）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - 孕马血清促性腺激素</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>研钵</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>圆底玻璃试管，15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>二抗（Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG）</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机转子</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield（抗荧光淬灭封片剂）</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

使用xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

细胞生物学中的一个基本问题是细胞和细胞器的大小是如何被调控的。长期以来人们认识到，细胞核的大小通常与细胞大小成比例，尤其是在胚胎发生过程中，细胞和细胞核的尺寸会发生显著减小。目前，调控细胞核大小的机制在很大程度上仍不清楚，但可能与癌症相关，因为在癌症中，细胞核大小的改变是一个重要的诊断和预后指标。 在体 鉴定细胞核大小调控因子的方法因细胞核功能的重要性和复杂性而变得复杂。 体外 此处描述的用于研究细胞核大小调控的方法，利用了细胞在正常发育过程中发生的细胞核尺寸减小现象 Xenopus laevis 发育。首先，细胞核被组装起来 X. laevis 卵母细胞提取物中。随后，将这些细胞核分离并重悬于晚期胚胎的细胞质中。经过30至90分钟的孵育后，细胞核表面积减少20%至60%，该方法可有效用于鉴定晚期胚胎细胞质中参与发育过程中细胞核大小缩放调控的组分。该方法的主要优势在于卵母细胞和胚胎提取物易于进行生物化学操作，有助于鉴定调控细胞核大小的新蛋白和活性成分。与任何 体外 方法，结果验证在 an 体内 系统很重要，且显微注射 X. laevis 胚胎特别适用于这些研究。

卵提取物中细胞核的组装
本方案的第一步是准备 X. laevis 卵母细胞提取物（方案1）和去膜精子核（方案2）。这些试剂随后用于组装细胞核 从头合成 （方案3） 图1 显示一些代表性数据。加入钙离子可使处于减数分裂阻滞的卵提取物进入间期，而环己酰亚胺可使提取物持续阻滞在间期。在反应启动后30至45分钟，最初细长的S形精子核应开始增厚，形成蛞蝓状的染色质团块。可通过荧光标记的核输入货物（如GST-GFP-NLS，数据未显示）的入核与滞留，或使用识别含FG重复序列核孔蛋白的mAb414对核孔复合体进行边缘染色，来评估完整核膜的形成情况。图1A）。在细胞核组装完成后，随着核膜的扩张以及核蛋白的输入，核形态应变得更加圆润，核体积应增大（图1B-C）。若未观察到完整核膜的形成或细胞核生长，则...

细胞及细胞内比例调控的机制仍不明确。Xenopus 胚胎提取物的使用已日益普遍，用于阐明细胞器大小调控的机制。本方法描述了胚胎提取物的制备以及一种新型的细胞核比例调控检测方法，可用于鉴定细胞核大小调控的机制。

使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

细胞生物学中的一个基本问题是细胞和细胞器的大小是如何被调控的。长期以来人们认识到，细胞核的大小通常……

本实验的总体目标是利用非洲爪蟾卵和胚胎提取物建立一种检测方法，使较大的细胞核能够缩小较小的细胞核。该方法有助于回答细胞核生物学中的关键问题，例如调控细胞核大小的机制是什么？该技术的主要优势在于，可以轻松操控非洲爪蟾无细胞提取物的组成和活性，以评估影响细胞核大小的因素。根据文本方案制备好非洲爪蟾卵提取物、去膜精子和组装的细胞核后，通过将青蛙置于玻璃制的可重复使用培养皿上方来收集 freshly laid 卵。通过轻压靠近泄殖腔的下背部来促进排卵。将培养皿以约 45 度角倾斜支撑，使卵沿培养皿边缘聚集。然后，去除多余的缓冲液，并加入足量的三分之一倍 X MMR，以刚好浸没卵子。使用贴合紧密的研杵，在1.5毫升离心管中将四分之一个睾丸与500微升高盐改良巴氏生理盐水（Modified Barth's Saline，MBS）一起研磨并均质化。随后将研磨后的睾丸组织加入卵子中，在室温下孵育15分钟以完成受精过程。孵育后，用三分之一浓度的X MMR溶液浸没卵子。随后，5至10分钟后，通过观察深色色素动物极是否收缩以及胚胎是否发生旋转（动物极朝上）来确认受精情况。使用宽口塑料移液管仔细去除死亡、裂解或未受精、未分裂的卵子，因为这些卵会迅速导致邻近胚胎死亡。受精后1至2.5小时，在含2%至3%半胱氨酸且pH值调至7.9的1/3倍浓度MMR溶液中去除胚胎胶质膜。去胶前，胚胎占据相对较大的体积。更换缓冲液两次，每次持续3至4分钟。随后，用六到十次短暂更换三分之一倍浓度的MMR溶液彻底清洗胚胎，以去除所有半胱氨酸残留。去胶膜后，胚胎会紧密聚集，占据相对较小的体积。接下来，使用宽口玻璃移液管将健康且已受精的胚胎转移至含有新鲜三分之一倍X MMR溶液的培养皿中。在室温下让胚胎发育至所需阶段。根据未发生第一次分裂或呈现白色、肿胀外观来判断，及时清除死亡或裂解的胚胎。当胚胎发育至11.5至12期时，将其转移至新鲜的1/3倍浓度X MMR溶液中，该溶液需添加0.5毫摩尔的环己酰亚胺，于室温下孵育胚胎1小时，以使其停滞在晚间期。使用宽口玻璃或塑料移液管，将至少15个处于分裂间期阻滞的胚胎转移至一个微量离心管中。向胚胎中加入1毫升裂解缓冲液（ELB），并添加1微升LPC储备液。轻轻颠倒混匀管子，以洗涤胚胎。然后让胚胎沉降到管底。在去除缓冲液前，重复洗涤两次。将胚胎重悬于500 µL ELB中，并加入0.5 µL LPC储备液、5 µL 19.7 mM环己酰亚胺和5 µL 35.5 mM细胞松弛素D，以抑制肌动蛋白聚合。将样品在台式离心机中以200 × g离心1分钟，然后去除多余的缓冲液，并用研杵充分研磨胚胎。将研磨后的样品置于摆桶转子中，于16 °C以10,000 × g离心10分钟。用200 µL移液器枪头从顶部刺穿脂质层，再用新的洁净枪头吸取中间的琥珀色细胞质层至适当大小的离心管中。向胚胎提取物中加入以下试剂，然后轻轻倒置离心管以混匀。接着，按照文本方案制备压片，观察提取物中内源性胚胎细胞核，随后通过加入等体积含有此处所列试剂的ELB缓冲液，从提取物中去除细胞核。轻轻倒置离心管以混匀。将样品在摆动桶转子中以17,000 × g、16 °C离心15分钟。随后小心收集上清液，注意避免吸取顶部残留的脂质，同时保持底部沉淀的细胞核不受扰动。按照文本方案中的描述制备匀浆，以确保大部分细胞核已被去除。然后使用新鲜提取物，或对样品进行分装，并在负80摄氏度下保存。通过在1.5毫升离心管中将25至150微升预组装的细胞核稀释于1毫升ELB缓冲液中，从卵提取物中分离组装的细胞核。在 1600 × g、4 °C 条件下离心 3 分钟。然后小心去除上清液，注意不要扰动沉淀。向沉淀中加入与原始卵提取物体积相等的胚胎提取物，轻轻敲击离心管以破碎沉淀并重悬细胞核。室温孵育90分钟，每15至30分钟轻轻敲击管壁以混匀。孵育结束后，在加入500 µL含15%甘油和2.6%多聚甲醛的ELB缓冲液前，轻敲管壁使细胞核重新悬浮。立即颠倒混匀管子，并将管子置于室温旋转仪上旋转15分钟。通过在15毫升圆底玻璃管中安装圆底塑料内衬来制备沉降管。加入5毫升细胞核缓冲垫溶液，然后将12毫米圆形盖玻片轻轻放入管中，确保其平放在塑料内衬上。使用宽口移液器吸头，将固定后的细胞核溶液轻柔地铺加在细胞核缓冲垫上方。在1,000 × g、16 °C条件下，使用水平转子离心机离心15分钟。随后，用抽吸装置移除所有缓冲液，并将塑料插件固定在管子顶部。然后，用一对精细镊子小心取出盖玻片，注意记录细胞核被离心到的盖玻片面。将盖玻片在室温下用冷甲醇固定5分钟。将盖玻片有细胞核的一面朝上转移至一个大型塑料培养皿内衬的石蜡膜上。然后在培养皿边缘放置湿润的一次性擦拭巾，以防止脱水。用 500 微升 PBS NP40 将盖玻片上的细胞核重悬，孵育 5 至 10 秒后吸去。然后，小心地在盖玻片上覆盖 75 微升 PBS 3% BSA，室温下封闭 1 小时，或 4 摄氏度过夜。移除封闭液后，加入用 PBS 3% BSA 稀释的一抗进行孵育。然后用五次快速更换的 PBS NP40 溶液洗涤样品。用二抗重复上述孵育和洗涤步骤。在室温下，用含 3% BSA 的 PBS 稀释的 10 µg/mL Hoechst 溶液孵育 5 分钟。然后用 PBS NP40 洗涤五次，并彻底去除多余的缓冲液。最后，将盖玻片用 5 µL 抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片边缘，并立即使用落射荧光显微镜进行成像，或于 40 °C 保存以备后续成像使用。该图展示了卵提取物中细胞核的组装过程。反应开始后30-45分钟，细长的S形精子核应逐渐增厚，形成蛞蝓状的染色质团块。随着细胞核的组装完成，核形态将变得更加圆润，同时核膜扩张并导入核蛋白，导致核体积增大。如图所示，取少量胚胎提取物进行Hoechst染色后压片，可见大量染色的细胞核，表明提取物制备成功。经离心去除细胞核后，与第一次压片相比，本图中显示提取物中仅残留极少细胞核，从而确保内源性细胞核不会干扰后续分析。若仍有细胞核残留，需进行第二次离心。在此细胞核收缩实验中，将卵提取物中的细胞核重悬于晚期胚胎提取物中，细胞核会随着时间推移成功缩小。然而，在加热失活的胚胎提取物中孵育的细胞核则不会发生收缩。为应对该实验固有的变异性，重复多次实验至关重要。一旦掌握，整个实验方案可在两天内完成，其中细胞核收缩检测本身约需四小时。在进行此操作时，重要的是要始终对卵子和胚胎进行质量检查，并在离心后收集胞质提取物时格外小心，避免触及沉淀和脂质层。通过遵循本方案所获得的结果应经过验证。例如，我的胚胎显微注射或细胞培养转染实验。此外，该方法还可用于探索其他细胞器大小的调控机制。该技术建立后，为核细胞生物学领域的研究人员探索核大小的调控机制，以及核大小在发育和致癌过程中的功能作用开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何组装和分离非洲爪蟾卵提取物中的细胞核，制备非洲爪蟾胚胎及胚胎提取物，开展细胞核收缩实验，并对实验结果进行可视化观察。

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生物学

无细胞测定中使用<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;胚胎提取研究核的大小调节机制。

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学习利用非洲爪蟾卵和胚胎提取物建立无细胞核大小调节测定法，通过操控提取物成分研究核动态变化。该方法为细胞生物学研究提供有价值的实验工具。

使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

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