Name: 优化慢病毒生产和细胞培养必要条件，成功转导初级人支气管上皮细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学习使用慢病毒高效转导原代人支气管上皮细胞的方法，优化培养条件并在分化过程中维持高转导效率。该技术适用于呼吸道研究中的基因功能分析。

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我们感谢迈阿密大学生命联盟器官回收机构提供肺组织。同时感谢Lisa Künzi博士为图2B和图3-D所示实验提供的DNA样品，感谢Ben Gerovac博士和Lisa Novak提供用于图3A至图3C实验的mCherry病毒。我们还感谢迈阿密大学眼科系影像中心的Gabriel Gaidosh。
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、囊性纤维化基金会和空乘人员医学研究所向Matthias Salathe博士提供的资助支持。

1. 第一阶段：HEK 293T 细胞培养
<ol>
	<li>配制HEK细胞培养基（简称HEK培养基），即将10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素/链霉素加入高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。</li>
	<li>用I型胶原包被一个10 cm组织培养皿。将30 µl I型胶原与2 ml蒸馏水混合，将混合液均匀涂布于培养皿表面，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。2.</li>
	<li>移除混合液，将培养皿置于超净工作台中干燥15分钟。</li>
	<li>将HEK细胞以1 x 10的密度接种至包被的培养皿中6 细胞置于10 ml HEK培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养2.</li>
	<li>当 HEK 细胞融合度达到 50-60% 时（图1a，铺板后2-3天，进入第2阶段。通过肉眼评估汇合度即可，无需定量。 
	注意：HEK 细胞在 HEK 培养基（见上文）中培养。当细胞达到汇合状态时，可进行传代例如 1/5）或冷冻保存以备后续使用。</li>
</ol>
2. 第二阶段：在 HEK 细胞中生产与浓缩慢病毒（LVs）
注意：在美国，这些实验方案应在符合机构和政府法规的前提下，在 BSL-2+（加强型 BSL-2）条件下实施。
<ol>
	<li>使用钙沉淀法进行转染（脂质体转染试剂和其他转染试剂的效果均不如钙沉淀法）。建议使用商业化的转染试剂盒以确保可重复性，但需按以下步骤进行修改：将所有试剂恢复至室温。此为第0天。</li>
	<li>对于每10 cm的HEK293细胞培养皿，在15 ml离心管中混合4.5 µg包膜DNA pMD2-VSVG、7.5 µg包装DNA pMDLg/pRRE、3.75 µg DNA pRSV-rev、10 µg慢病毒表达载体DNA、86 µl 2 M氯化钙溶液，并用无菌水补足至终体积700 µl（后两种溶液由商业化转染试剂盒提供）。</li>
	<li>在涡旋振荡（于超净工作台内）的同时逐滴加入700 µl 2x HEPES缓冲盐水（HBS，由转染试剂盒提供），室温孵育30分钟（孵育期间进行步骤4）。</li>
	<li>在早期孵育阶段，取5 µl混合液滴加至载玻片上。使用10倍物镜在显微镜下缓慢上下调焦观察液滴。应可见细小沉淀物，以确认磷酸钙沉淀反应已成功进行（图1b）。</li>
	<li>30分钟后，加入10 ml HEK细胞培养基终止沉淀反应，并用移液器反复吹打混匀。</li>
	<li>取步骤2.1–2.5中的HEK细胞培养皿，弃去原有培养基（第0天），沿培养皿边缘小心缓慢加入步骤2.5所得沉淀溶液。</li>
	<li>次日（第1天），弃去含沉淀物的培养基，更换为10 ml新鲜HEK培养基。在显微镜下检查细小沉淀物：应可见沉淀物分布于细胞间隙的空旷区域（图1c和d）。</li>
	<li>第2天，用注射器收集培养上清液，经0.45 µm注射式滤器过滤后转入含3.8 ml 40%聚乙二醇（PEG）溶液的15 ml离心管中。颠倒混匀5次，4 °C保存至少24小时（使PEG充分沉淀，但不超过5天），直至完成所有病毒收集。</li>
	<li>在第3天和第4天重复步骤2.8。第4天收集后不再更换HEK培养基，而是用10%次氯酸钠溶液去污染后弃去培养皿。</li>
	<li>将所有收集管（通常于第5天集中处理）在4 °C下以1,650 × g离心20分钟，使病毒沉淀。弃去上清液，再以1,650 × g于4 °C离心5分钟，以彻底去除残留的PEG上清液。</li>
	<li>将每管沉淀物重悬于200 µl不含两性霉素B的支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）8中。合并所有样品后分装为每份200 µl。将病毒储存于-80 °C。另分装10 µl用于HIV-1 Gag（p24）抗原ELISA检测。</li>
	<li>使用商业化ELISA试剂盒，按照制造商说明书进行p24抗原检测。该检测可估算病毒p24含量，单位为pg/ml。</li>
</ol>
3. 第三阶段：培养原代人支气管上皮细胞
<ol>
	<li>将HBE细胞以1 × 106个细胞的密度接种于经I型胶原包被的10 cm组织培养皿中，加入10 ml BEGM培养基（若使用第0代细胞，则添加100 µl两性霉素B以消除可能的真菌污染）。在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>次日，弃去培养基，更换为10 ml BEGM培养基（若为第0代细胞，仍需含100 µl两性霉素B），继续培养共4天。更换后放回培养箱。</li>
	<li>培养4天后，仅使用不含两性霉素B的BEGM培养基，每隔一天换液一次。</li>
	<li>当细胞融合度达到80–90%时（图2a；接种后约7天），进行转导操作（转导前请参见步骤3.5的准备工作）。再次强调，通过肉眼观察评估融合度已足够，无需定量分析。</li>
	<li>转导前，用无菌去离子水将IV型胶原溶液稀释至1/10，均匀涂覆于可渗透支持膜小室表面。每个小室加入200 µl，置于超净台内过夜干燥。</li>
</ol>
4. 第4阶段：HBE细胞的转导
<ol>
	<li>吸去培养基，加入 3 ml 含 1 mM 乙二胺四乙酸的 0.1% 胰蛋白酶溶液（EDTA/PBS），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。在显微镜下（10X 物镜）观察细胞是否全部脱落。若未完全脱落，放回培养箱继续孵育 5 分钟。</li>
	<li>待所有细胞脱落后，加入 3 ml 大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI 1 mg/ml），混匀后转移至 15 ml 离心管中。在室温下以 460 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>吸去上清液，将沉淀重悬于 3 ml BEGM 培养基中，进行细胞计数。</li>
	<li>将原代人支气管上皮细胞（此时为第 1 代或 P1）以每 12 mm 可渗透支持膜小室接种 2 × 105 个细胞的比例，用 400 µl BEGM 培养基重悬（见表 2）。根据需转导的可渗透支持膜小室数量，按比例推算所需细胞量。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>表面</td>
			<td>表面积</td>
			<td>细胞数量</td>
			<td>培养基</td>
			<td>体积（培养基）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm 培养皿</td>
			<td>52.7 cm2</td>
			<td>1 × 106</td>
			<td>BEGM</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm 滤膜</td>
			<td>1.13 cm2</td>
			<td>2 × 105</td>
			<td>BEGM</td>
			<td>400 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm 滤膜</td>
			<td>4.52 cm2</td>
			<td>8 × 105</td>
			<td>BEGM</td>
			<td>800 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：按细胞计数推算的培养基用量。
<ol start="5">
	<li>使用感染复数（MOI）为4的比例，向细胞悬液中加入相应体积的病毒。</li>
	<li>加入六甲溴铵（hexadimethrine bromide），使其终浓度为2 µg/ml。</li>
	<li>将混合液（BEGM、HBE细胞、病毒和六甲溴铵）每孔400 µl加入可渗透支持性插入物的顶端室，基底外侧室加入1 ml单独的BEGM培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。始终以未加病毒的HBE细胞作为对照，并在适用时测试嘌呤霉素筛选效果。</li>
	<li>次日，移除顶端和基底外侧的培养基，用PBS洗涤，并将两个腔室均更换为气液界面（ALI）培养基8。</li>
	<li>当细胞达到融合状态时，移除顶端液体（即建立气液界面）。此后每隔一天更换底部腔室的培养基（ALI培养基），直至细胞完全成熟，通常需要3至4周。 
	注意：如果慢病毒载体包含嘌呤霉素等筛选基因，可根据筛选浓度曲线通过添加嘌呤霉素进行细胞筛选。对于HBE细胞，1 µg/ml的浓度已被确定为稳定筛选转导细胞的理想浓度。然而，该浓度可能因其他细胞类型或实验条件而异，应通过杀灭曲线实验确定。嘌呤霉素的添加可在更换为ALI培养基后尽早开始（最早可于一天后），也可稍晚（2–3天后），以确保筛选基因充分表达。务必向一个未转导的插入物中添加嘌呤霉素作为阴性对照。嘌呤霉素可持续添加至细胞完全分化为止。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案可确保接近100%的转导效率。然而，为实现这一目标，操作过程中有几个关键步骤至关重要。例如，在转染过程中，转导混合液（液滴）中或转导后第二天培养皿中出现沉淀物（图1b和d）是成功转染的重要指标。若无沉淀物或出现团块，可能是由于遗漏了某种转染试剂、pH值问题或质粒制备质量不佳所致。如果未形成沉淀，则次日很可能也观察不到沉淀。此外，若加入转染混合液或HEK培养基的速度过快，可能导致HEK细胞脱落，从而影响转染效率和病毒产量。另一个判断产量良好的指标是在第6天离心前：离心管底部应可见白色沉淀物。若转染失败，病毒产量极低，则不会形成该白色沉淀。在转导过程中，为获得高转导效率，必须使用已去分化的、处于类似干细胞状态的原代人支气管上皮（HBE）细胞。使用携带易于观察的荧光蛋白（如eGFP或mCherry）的载体也是一种有效的工具。
可根据不同的原代细胞对本方案进行调整。一种方法是降低培养基中的钙离子浓度。如图3a所示，使用钙离子浓度较低的BEGM培养基可显著提高原代HBE细胞的转导效率。...

复制缺陷型假型慢病毒（LV）的开发为研究人员提供了一种安全且高效的体外递送转基因的方法in vitro 1。由于其具有长期表达的特性，这些LV还可用于体内递送治疗性因子in vivo 2,3。LV的生产需要将多种质粒共转染至人胚胎肾（HEK）细胞中：包括转移载体、包装用gag/pol质粒、包装用rev质粒以及包膜水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）质粒。第三代包装系统比第二代系统更安全，原因是rev基因被编码在独立的包装质粒上，从而降低了发生重组产生具有复制能力的慢病毒的可能性。尽管第二代包装系统产生的总转导单位高出五倍，但将原始病毒基因组拆分以构建第三代系统仅使转导效率出现轻微下降3,4。
尽管细胞系更容易且更高效地进行转导，研究人员已将研究重点转向原代细胞，因为后者更能代表 体内 组织 5,6然而，原代细胞难以被转导。尽管已有报道成功转导完全分化的气道上皮细胞，但总体效率未超过15% 7.
本文介绍了一种可产生高滴度慢病毒（LV）的实验方案。该方案通过逐步操作，可实现对原代人支气管上皮（HBE）细胞接近100%的转导效率。更具体而言，本方案描述了成功所必需的最佳培养条件3。简言之，采用携带EF-1启动子的慢病毒表达载体pCDH，对HEK 293T细胞进行转染，该载体驱动增强型绿色荧光蛋白（eGFP）或红色荧光蛋白mCherry的表达，并结合第三代包装系统。病毒释放至培养基后，于24至72小时后收集。利用聚乙二醇（PEG）对病毒颗粒进行浓缩，这是一种简便易行的病毒浓缩方法，随后使用p24抗原酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定病毒滴度。接着，在未分化的原代HBE细胞贴壁过程中（经胰酶消化后），于增殖培养基（支气管上皮生长培养基，BEGM）中以感染复数（MOI）为4的条件进行转导8，同时加入六甲基溴化铵并孵育16小时（过夜）。之后，使细胞进入分化阶段。由于病毒携带的转基因可在长期表达（使用适当启动子，参见讨论部分），其表达将在细胞分化为假复层气道上皮的过程中持续维持，或可在分化完成后通过可诱导启动子启动表达。
该方案对希望使用原代HBE细胞而非细胞系的研究人员具有广泛的应用价值，并且可能适用于其他难以转导的细胞类型。

<table><tbody><tr><td>HEK293T/17 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>12306C</td><td>使用浓度为 10%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>使用浓度为 1x</td></tr><tr><td>胶原蛋白 I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td>用蒸馏水按 1:75 稀释</td></tr><tr><td>Calphos</td><td>Clontech</td><td>631312</td><td>转染试剂盒，包含 2 M 氯化钙溶液、2x HEPES 缓冲液 (HBS) 和无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000</td><td>VWR scientific</td><td>101108-210</td><td>40% 储存液</td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Sigma</td><td>A9528</td><td>使用浓度为 1x</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 12 mm</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白 IV</td><td>Sigma</td><td>C7521</td><td>用蒸馏水按 1:10 稀释</td></tr><tr><td>六亚甲基溴化铵</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>2 mg/mL 储存液</td></tr><tr><td>嘌呤霉素 (10,000x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11138-03</td><td>使用浓度为 1x</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 ELISA</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro</td><td>System Biosciences</td><td>CD532A-2</td><td>慢病毒表达载体</td></tr><tr><td>pMD2-VSVG</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>包装质粒 DNA</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td>包装质粒 DNA</td></tr><tr><td>pRSV-rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td>包装质粒 DNA</td></tr></tbody></table>

优化慢病毒生产与细胞培养条件以成功转导原代人支气管上皮细胞

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

体外培养原代人支气管上皮（HBE）细胞，采用气液界面条件，为研究气道上皮细胞的分化和功能过程提供了一个有用的模型。近年来，使用慢病毒载体进行外源基因递送已成为常规做法。尽管已有报道显示某些非HIV假型慢病毒可转导完全分化的气道上皮细胞，但总体转导效率通常低于15%。本文所介绍的方案提供了一种可靠且高效的慢病毒制备及转导原代人支气管上皮细胞的方法。在细胞贴壁阶段，使用未分化的支气管上皮细胞，在支气管上皮生长培养基中进行转导，并以感染复数（MOI）为4的条件，可实现接近100%的转导效率。本方案逐步描述了高滴度慢病毒载体的制备与浓缩过程以及转导操作流程，并讨论了为实现原代人支气管上皮细胞高效转导而确定最佳培养条件的相关实验。

图1展示了转染过程中评估细胞和溶液的不同关键步骤。图1a显示了用于病毒生产的HEK293T细胞在转染前的最佳汇合度。重要的是，细胞应在培养皿中均匀分布。图1b通过明场光学显微镜和10倍物镜显示了转染混合液滴中的沉淀物。沉淀物越接近沙粒状而非团聚状，转染效率越高。在此图中，沉淀物略显粗糙。沉淀物是判断转染是否能产生高滴度病毒的可靠指标。如果任一组分缺失或质量不佳（例如载体DNA），将会形成团聚物，这是不良的征兆。若出现这种情况，更明智的做法是中止并重新开始实验，确保所有组分均已加入，并/或检查载体DNA和包装DNA的质量。图1c显示了与图A相同培养皿在过夜孵育后的状态。沉淀物（且应当）可见于细胞之间。我们注意到，转染后24小时内细胞增殖不明显。
图2展示了HBE细胞在转导前及转导后3天的...

原代人支气管上皮细胞难以转导。本方案描述了慢病毒的制备与浓缩方法，以及在这些细胞向假复层上皮分化过程中实现高效转导所需的最适培养条件。

原代人支气管上皮（HBE）细胞在气液界面条件下体外培养为研究……过程提供了有用的模型

本方法的总体目标是利用慢病毒实现原代人支气管上皮细胞的高效转导。该方法适用于希望使用原代人支气管上皮细胞而非细胞系的研究人员，并且可能适用于其他难以转导的细胞类型。该技术的主要优势在于，在分化为假复层上皮的整个过程中，转导效率始终保持在较高水平。该方案应在符合美国机构和政府规定的增强型BSL-2条件下进行。根据文本方案，在胶原蛋白I包被的培养皿中制备HEK培养基后，取10毫升培养基将一百万个HEK细胞接种至包被的培养皿中。将培养皿置于37°C、5% CO₂条件下孵育，直至细胞融合度达到50%至60%。此日记为第0天。在第0天，于超净工作台内，使用商品化的转染试剂盒，将试剂恢复至室温。每10厘米培养皿的HEK293细胞，在15毫升离心管中加入以下成分：4.5微克pMD2-VSVG包膜DNA、7.5微克pMDLg/pRRE包装DNA、3.75微克pRSV-rev DNA、10微克慢病毒表达载体，以及86微升2摩尔的氯化钙溶液。然后加入无菌水至终体积为 700 微升。仍在超净工作台中，边涡旋边逐滴加入 700 微升 2 倍浓度 HEPES 缓冲盐水，于室温孵育 30 分钟。在孵育初期，取 5 微升混合液滴加到一个小培养皿上。在显微镜下使用10倍物镜，通过缓慢上下调焦观察液滴。应可见细小的沉淀物，以确认磷酸钙沉淀过程。最关键的步骤是沉淀物的形成。如果未观察到沉淀，可能表明质粒制备失败或质粒及转染试剂的计算错误。若继续使用未形成沉淀的样品进行后续步骤，可能导致病毒制备量偏低和/或前转导效率低下。在沉淀反应30分钟后，加入10毫升HEK培养基，并通过上下吹打混匀以终止沉淀过程。然后，从HEK细胞培养皿中移除培养基，并沿培养皿边缘小心且缓慢地加入沉淀溶液。次日，移除并弃去含有沉淀的培养基，更换为10毫升HEK培养基。在显微镜下检查是否存在细小沉淀。应在培养皿中细胞间的空隙处可见。次日，用注射器收集培养基，并通过0.45微米滤器过滤至含有3.8毫升40% PEG溶液的15毫升离心管中。倒置混匀5次，于4摄氏度保存至少24小时，直至完成所有病毒收集。在第3天和第4天，重复进行培养基的收集和过滤操作。随后，在丢弃前使用10%次氯酸钠对培养皿进行去污染处理。将所有收集管在4°C条件下以1,650 × g离心20分钟，使病毒沉淀。弃去上清液，并再次离心五分钟，以收集并去除残留的聚乙二醇（PEG）上清液。使用 200 微升不含两性霉素 B 的支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）重悬每个沉淀。然后将其合并，并分装成 200 微升的等份样品。将分装样品储存在 -80 摄氏度。在 I 型胶原包被的培养皿中，接种一百万个 HBE 细胞至 10 毫升 BEGM 培养基中。于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养，每天更换培养基，共培养四天。根据文本方案，用 IV 型胶原蛋白包被可渗透支持性小

optimal-lentivirus-production-cell-culture-conditions-necessary-to

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

优化慢病毒生产和细胞培养必要条件，成功转导初级人支气管上皮细胞

制备慢病毒时，将DNA载体转染至人293细胞中。收集并浓缩上清液后，通过流式细胞仪检测荧光表达来测定病毒滴度。...

慢病毒生产

本文介绍了一种从人支气管气道组织外植体中培养原代人支气管上皮细胞的详细方法，包括在气液界面条件下进行分化生长。该方法可提供充足的原代细胞来源，用于研究气道上皮在人类肺部健康与疾病中的作用。...

从组织外植体培养的人原代支气管上皮细胞

慢病毒是研究基因功能的重要研究工具；然而，研究人员可能希望避免产生编码已知或疑似癌基因的泛嗜性慢病毒。作为替代方案，我们提出了一种更安全的策略，即在经过改造以表达嗜鼠性病毒受体 mSlc7a1...

利用聚合物复合的嗜生态慢病毒转导人细胞以增强生物安全性

慢病毒表达载体是稳定表达各种效应分子或报告基因构建体的最有效工具，适用于分裂和非分裂的哺乳动物细胞以及完整生物体。本文提供了一种将慢病毒表达构建体包装成假病毒颗粒，并利用这些假病毒颗粒转导靶细胞的实验方案。...

包装基于HIV或FIV的慢病毒载体表达构建体及VSV-G假型病毒颗粒的转导

本实验利用逆转录病毒转导和串联转染技术，构建一种可在无四环素条件下表达慢病毒载体（LV）各组分的细胞系。该慢病毒载体编码绿色荧光蛋白（GFP），并假型化携带一种糖蛋白SVGmu，后者特异性识别树突状细胞表面的受体。...

一种受四环素调控的细胞系可产生高滴度慢病毒载体，特异性靶向树突状细胞

本文介绍了一套灵活且具有策略性的实验方案，可通过病毒载体操控少突胶质前体细胞，使其过表达目标蛋白，从而特异性地探究这些蛋白在少突胶质细胞中的功能 体外...

慢病毒的制备与应用：选择性转导原代少突胶质前体细胞 体外 髓鞘化检测

本文介绍了一种通过在十天内过表达 Tfap2c、Gata3、Eomes 和...

小鼠胚胎成纤维细胞直接转化为滋养层干细胞的实验方案

本方案描述了一种通过转录调控实现目的基因在人类基因组中稳定整合的方法 睡美人 系统。缺陷型慢病毒载体整合的制备 体外...

一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

本文介绍了培养小鼠髓系前体细胞32D/G-CSF-R细胞系、进行病毒感染以及开展增殖和分化检测的详细实验方案。该细胞系适用于研究髓系细胞发育，以及目的基因在髓系细胞生长和中性粒细胞分化中的作用。...

小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化

靶向DNA表观基因组编辑是一种强大的治疗策略。本方案描述了用于人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源神经元表观基因组编辑的、携带CRISPR-dCas9-DNMT3A转基因的一体化慢病毒载体的制备、纯化与浓缩过程。...

用于高效递送表观基因组编辑工具至人诱导性多能干细胞衍生疾病模型的慢病毒载体平台

本方案详细描述了病毒感染的鼻上皮细胞与天然免疫细胞活化之间早期相互作用的研究方法。可根据免疫细胞亚群在病毒感染后的活化状态对其进行区分，并进一步研究其对早期抗病毒反应的影响。...

无接触共培养模型用于研究呼吸道病毒感染期间的固有免疫细胞活化

学习使用慢病毒高效转导原代人支气管上皮细胞的方法，优化培养条件并在分化过程中维持高转导效率。该技术适用于呼吸道研究中的基因功能分析。

优化慢病毒生产与细胞培养条件以成功转导原代人支气管上皮细胞

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