Name: 实验协议生产生物柴油与饱和酮的分离从商业余积等鞭金藻藻类生物量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解从商业等鞭金藻生物质生产生物柴油并共分离长链烯酮的方法。该技术通过索氏提取和转酯化反应实现高产率，为可再生能源领域提供可持续的藻类生物燃料解决方案。

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本工作由美国国家科学基金会（CHE-1151492）、西北先进可再生能源联盟（资助 J. Wilson-Peltier 的奖学金）以及来自伍兹霍尔海洋研究所（WHOI）友人的私人捐赠提供支持。我们感谢 Kevin R. Steidley 和 Kim Ascherl（美国农业部 / 农业研究服务局 / 国家农作物利用研究中心）提供的出色技术支持。

1. 微藻与生物量制备
注意：本研究中使用的海洋微藻 Isochrysis sp. &#34;T-iso&#34; 可从供应商处购买（参见材料列表）。可购得数千克量级的 Isochrysis，其以冷冻湿膏形式提供（称为 Iso-膏），含水量约为 80%，生物量占 20%，呈深绿色至近黑色，具有浓烈的海洋气味。Isochrysis 也可购得干燥（95% 干燥）的黄褐色粉末（称为 Iso-粉），气味相似。
<ol>
	<li>为了干燥Isochrysis藻膏，使用剪刀在1公斤包装的塑料袋一角剪开一个1至2英寸的孔。</li>
	<li>将约300克的Isochrysis藻膏通过该孔挤入一个150 mm × 75 mm的结晶皿中，形成一层薄层（约20 mm厚）。</li>
	<li>将藻膏在室温下静置风干，直至其变干并呈片状（通常需要48至96小时）。 
	注意：实际干燥时间可能因温度而异。然而，即使延长干燥时间（长达两周），产物得率和质量也未见明显差异。为使干燥过程更均匀和/或加快，可将结晶皿置于加热板上（30 - 40 °C）。</li>
	<li>用刮刀将干燥的生物质从结晶皿中刮下，并收集至纤维素提取套管中（长度：123 mm，内径：43 mm）。记录干燥的Isochrysis生物质重量。</li>
</ol>
2. 干样品的索氏提取 等鞭藻 生物量
<ol>
	<li>将含有Isochrysis的纤维素提取套管（通常含干生物量50 - 60 g）装入索氏提取装置中。</li>
	<li>向索氏提取瓶中加入正己烷（400 ml），打开冷凝水和加热源，使索氏提取循环进行24 - 48小时（直至溶剂颜色由深绿色变为浅黄色）。</li>
	<li>关闭加热，使装置冷却至室温，然后将提取瓶从索氏提取器上拆下。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪除去正己烷，并称量正己烷可提取物的重量（&#34;正己烷藻油&#34;（h-AO））。</li>
</ol>
3. 藻类油的皂化及脂肪酸与中性脂质的分离
<ol>
	<li>将步骤2.4中得到的h-AO重新溶解于同一圆底烧瓶中，使用甲醇:二氯甲烷（2:1，体积 = 藻油质量的10倍）作为溶剂。</li>
	<li>加入搅拌子，并连接回流冷凝管（线圈长度：500 mm）。</li>
	<li>加入H2O（体积 = 藻油质量的2.67倍）和KOH（占藻油质量的50% w/w），在搅拌下加热至60 °C，持续3小时。</li>
	<li>冷却至室温后，使用旋转蒸发仪除去有机溶剂（甲醇和二氯甲烷）。</li>
	<li>将剩余的水相混合物倒入1 L分液漏斗中。加入与水相等体积的正己烷，振荡分液漏斗，静置分层。</li>
	<li>将下层水相排入锥形瓶中，上层有机相倾入另一个锥形瓶中。</li>
	<li>重复步骤3.5和3.6，直至有机相变为无色（通常再重复1–2次）。</li>
	<li>将合并的有机提取物在旋转蒸发仪上浓缩，得到呈绿色固体状的中性脂质（熔点 ≈ 60 – 70 °C）。</li>
	<li>用HCl（6 M）酸化水相，直至pH试纸显示pH值约为2。</li>
	<li>使用1 L分液漏斗，用与水相等体积的正己烷，按照步骤3.5和3.6所述方法从酸化后的水相中提取游离脂肪酸（FFAs）。</li>
	<li>在旋转蒸发仪上除去正己烷，得到呈深绿色近黑色油状残留物的游离脂肪酸（FFAs）（在温度&#62;30 °C时为液体）。</li>
</ol>
4. 游离脂肪酸的酸催化酯化及绿色生物柴油的制备
<ol>
	<li>使用甲醇:氯仿（1:1，体积为藻油的6倍）转移游离脂肪酸（FFAs），先将FFAs溶解，然后倒入装有搅拌子的厚壁高压反应瓶中。</li>
	<li>加入浓H2SO4（占藻油质量的20%），密封反应瓶，边搅拌边加热至90 °C，持续1小时。</li>
	<li>冷却至室温后，将混合物倒入分液漏斗中。</li>
	<li>加入H2O（体积为藻油的2倍），振荡分液漏斗，静置使两相分离。</li>
	<li>将下层液体排入已预先称重的圆底烧瓶中，并用旋转蒸发仪浓缩。记录所得生物柴油的质量。</li>
	<li>采用配备火焰离子化检测器的气相色谱法（GC-FID）28分析脂肪酸组成（使用配备DB-88柱[(88%氰丙基)甲基芳基聚硅氧烷]（30 m × 0.25 mm 内径 × 0.20 µm 膜厚）的气相色谱仪）。 
	注意：常见的脂肪酸甲酯通过与商业获得的标准品比较保留时间进行确认。此外，在相同的温度程序和色谱柱条件下，采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS；气相色谱仪连接质谱选择性检测器）分析如C18:4等尚无标准品的组分，并将结果用于GC定量分析。</li>
</ol>
5. 生物柴油脱色
<ol>
	<li>在装有搅拌子的圆底烧瓶中，将深绿色的生物柴油加热至 60 °C。</li>
	<li>加入蒙脱土 K10（MK10）粉末（占生物柴油质量的 10–20% w/w），搅拌 1 小时。</li>
	<li>将圆底烧瓶移离热源，使溶液冷却至室温。</li>
	<li>准备一个过滤装置，包括一个圆底烧瓶和装有纤维素滤纸（灰分含量 0.007%）的漏斗。</li>
	<li>将冷却后的脱色生物柴油倒入漏斗中过滤，并用少量正己烷冲洗圆底烧瓶，以确保完全转移。</li>
	<li>将漏斗从圆底烧瓶上取下（此时圆底烧瓶中含有脱色后生物柴油的正己烷溶液），使用旋转蒸发仪除去正己烷，得到橙红色的生物柴油。</li>
	<li>将样品储存在 4 °C 环境中，期间不溶性物质会逐渐析出（约占总质量的 10% w/w）。</li>
	<li>通过倾析或如步骤 5.4 和 5.5 所述的过滤方法去除不溶性物质，获得澄清均一的生物柴油用于后续分析。</li>
</ol>
6. 中性脂质中烯酮的分离与纯化
<ol>
	<li>将中性脂质（来自步骤 3.8）溶于最小量的二氯甲烷中（每 10 g 中性脂质约需 50 ml），然后用移液管将溶液加至色谱柱顶部。色谱柱尺寸为外径 60 mm、内径 55 mm、长度 18&#34;，内含硅胶（230–400 目，100 g）。</li>
	<li>使用压力（约 5 psi）以二氯甲烷（约 150 ml）作为洗脱剂，将溶液通过硅胶柱洗脱，并将洗脱液收集至 250 ml 圆底烧瓶中。</li>
	<li>用旋转蒸发仪除去二氯甲烷，得到橙色固体。</li>
	<li>用正己烷重结晶该固体：加入约 100 ml 沸腾的正己烷，随后分批少量加入沸腾的正己烷，直至溶液呈均一状态（总体积约 150 ml）。然后缓慢冷却溶液至室温，以促进结晶。</li>
	<li>使用过滤装置收集结晶的烯酮，方法如步骤 5.4 所述，并用少量冷的（0 °C）正己烷冲洗烧瓶。</li>
</ol>

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<li>Kulkarni, M. G., Dalai, A. K., Bakshi, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+green+seed+canola+oil+for+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Utilization of green seed canola oil for biodiesel production.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 81, 1886-1893 (2006).</li>
</ol>

本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之用，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。

等鞭藻 是少数几种被工业化养殖的藻类物种之一，常作为贝类饲料的主要成分进行收获，因此可代表生物燃料生产所需的规模。本研究中所用藻类的可获得性以及采用的标准方法，使得本方案易于被其他研究团队广泛采用，以开展进一步研究。关键步骤包括将藻类进行空气干燥（而非冷冻干燥）33）、溶剂萃取、皂化和酯化。通过这些操作，可考察从不同原料中提取的脂质及其他副产物的产率 等鞭藻 可用30预计这些差异可能是由于菌株不同和培养方法不同所致，31 并且可能受到产品性质及任何附加加工过程的影响（例如，干燥或冷冻）由供应商提供。如我们在此展示的，该方案可成功应用于不同类型的 等鞭金藻 产物从湿浆到干磨粉末不等。然而，粉末状生物质的生物柴油产率较低（干生物质的7% w/w，而干燥糊状物为12% w/w），这与提取的藻油（h-AO）含量较低相对应。这可能表明需要采用一种替代的提取方案32 除索氏提取器外，其他装置可能更适用于干燥粉末的提取 等鞭藻 产物。该 等鞭藻 本研究中使用的粉末标称脂质含量为23-25%，与我们从干燥样品中实验测得的结果相近 等鞭藻 粘贴。33,34,26
尽管起始干生物质的颜色不同，但Iso-糊状-hAO与Iso-粉末-hAO在本质上几乎无法区分，均为深绿色/近黑色固体，熔点约为50 °C。有趣的是，两种己烷提取物中游离脂肪酸（FFA）与中性脂质的比例有所不同。经皂化反应并分离中性脂质后，从Iso-糊状-hAO中获得60%（w/w）的FFA和40%（w/w）的中性脂质；而Iso-粉末-hAO平均产生46%（w/w）的FFA和54%（w/w）的中性脂质。该结果提示，起始的粉末生物质中中性脂质相对于脂肪酸衍生物的含量可能高于Isochrysis糊状物，或者索氏提取法对粉末状Isochrysis中的中性脂质具有一定的选择性。
不仅从两种商业来源获得的产物产率 等鞭藻 生物量不同，且所产生物柴油的脂肪酸组成也存在差异。这一点至关重要，因为生物柴油的燃料特性直接取决于各脂肪酸甲酯（FAME）的种类和含量。35 要实现商业化，所有生物柴油必须符合美国 ASTM D6751 或欧洲 EN 14214 文件中规定的技术标准。这些标准包括润滑性、运动黏度的允许范围，以及十六烷值和氧化稳定性的最低限值。其他重要推荐指标涉及低温流动性，以浊点（CP）或冷滤点（CFPP）的形式表示。我们此前已报道过由生物原料制备的生物柴油在全面燃料测试中的结果 异-粘贴。36 由于由……生产的生物柴油的FAME谱图 Iso本研究中的粉末与先前测试的粉末相似，因此可以预测两种生物柴油燃料的某些燃料特性也相似。例如，多不饱和脂肪酸甲酯（PuFAMEs，含两个以上双键）在两种脂肪酸甲酯混合物中均约占40%（分别为35.2%和39.9%） 表 2这将导致氧化稳定性较差，但低温流动性较好。35 然而，这两种生物柴油燃料的脂肪酸甲酯（FAME）谱图存在细微差异。由粉末状原料制得的生物柴油 等鞭藻 含有更高含量的14:0（19.4 mg/g vs. 16.4 mg/g）、18:3（13.5 mg/g vs. 8.5 mg/g）和22:6（11.0 mg/g vs. 6.9 mg/g）FAMEs，但18:4含量较低（10.4 mg/g vs. 19.8 mg/g）。这些差异对ASTM标准中各项燃料特性的影响程度仍有待研究。
从两种商用等鞭藻（Isochrysis）藻类获得的初始生物柴油均呈深绿色，这可归因于叶绿素的存在。36 据报道，叶绿素及其衍生物对植物油及其相应生物柴油的稳定性具有负面影响。36,29 参照Issariyakul和Dalai关于在生物柴油生产过程中脱除绿籽油颜色的方法，29 将我们的绿色生物柴油在60 °C下与10%（w/w）MK10搅拌1小时后，目视观察发现色素含量显著降低（参见 图2）。脱色过程的平均质量回收率为90%。
纯化烯酮的产率 同-paste-hAO 和 同-粉末-hAO 中性脂质分别为40%和46% w/w，两者相当（表1）。由于中性脂质在所含物质中占比较高 异构体-粉末-hAO（54% w/w 对比 40% w/w），烯酮产率从 异源-粉末-hAO 超过 同-paste-hAO角鲨烯产率提高约10%（25% w/w vs. 16% w/w）。然而，考虑到产率的 异-粉末-hAO本身的水平低于 同-paste-hAO（15% 与 20% w/w），两种干燥条件下烯酮的总产率 等鞭金藻 生物量更为相似（0.2 × 0.4 × 0.4 = 干重的3.2% w/w） 等鞭藻 糊剂和 0.15 x 0.54 x 0.46 = 3.7% 来自 等鞭藻 粉末）

近年来，人们对藻类生物燃料的兴趣再度高涨，尤其是将其用于生产生物柴油等液体燃料1 以及其他生物质衍生油。2 建议的好处包括避免某些与食物与燃料之争相关的争议3 据报道具有更高的生产率和CO2 比传统农作物具有更强的缓解能力。4 这延续了美国能源部始于1978年的藻类生物燃料研究计划——水生物种计划（Aquatic Species Program, ASP），该计划历时近20年，旨在探索从藻类中制取交通燃料的可行性。如希汉（Sheehan）报告中所述，5 该项目于1996年终止，主要原因是当时的预计成本无法与原油价格竞争（每桶159 L，18.46美元）。尽管自那时以来石油成本已大幅上涨（2014年为每桶87.39美元）6这与藻类生物燃料研究的复兴有关，但一些人认为藻类生物燃料仍将过于昂贵。7 作为一种降低生物燃料生产成本的策略，“高附加值副产品”的概念在批评者中逐渐兴起7,8 支持者9,10 并被列为美国能源部（DOE）《国家藻类生物燃料技术路线图》中推动藻类生物燃料发展的关键理由之一。11 
在此，我们介绍一种从商用原料中共同生产两种独立燃料流的方法 等鞭金藻 微藻。我们已聚焦于 等鞭藻 部分原因在于它已实现工业化生产，并被用于海水养殖业的采收 等鞭藻 是少数几种除传统脂质外还能产生即， 脂肪酸）生物合成一类独特的化合物，称为多不饱和长链烯酮。12 烯酮结构的特征是具有非常长的烃链（36-40个碳原子），以及两个到四个非亚甲基间隔的 转双键，以及一个甲基或乙基酮（图1). 烷酮不饱和度对藻类生长温度敏感，13,14 使得二不饱和C37甲基烯酮（即所谓的“不饱和指数”）的比例可作为古海表温度的代用指标。15−20 烷烃酮被认为存在于细胞质脂质体中，其含量可能超过甘油三酯（TAGs）。21,22 在氮或磷受限条件下，静止期细胞中最多有10−20%的碳以烯酮形式积累。23,24 从进化角度来看，烯酮可能比三酰甘油（TAGs）更具优势 转双键几何结构提供了更稳定的能量储存形式。21
<img alt="37:3 甲基烯酮分子式，酮基和反式烯烃结构，化学结构图。" src="/files/ftp_upload/54189/54189fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 多不饱和长链烯酮的结构。 从Isochrysis中分离出的常见甲基37:3烯酮，具有长碳氢链（36–40个碳原子）、trans非亚甲基间隔双键，并以甲基或乙基酮基结尾。其命名法类似于脂肪酸，其中#:#表示碳原子数:双键数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
我们认为，长链烯酮代表了一种极具前景的可再生碳资源，其来源于一种具有工业培养历史的常见藻类。25 直接从总脂质提取物中生产的生物柴油 等鞭金藻 含有大量（10–15% w/w）烯酮类物质，这些高熔点化合物的污染会导致燃料低温流动性差。然而，通过本文所述的皂化/萃取技术，可去除并回收烯酮，从而改善生物柴油品质，同时产生一个副产物流。近期，我们已证明可通过与2-丁烯进行交叉复分解反应（丁烯解）将烯酮转化为液体燃料。26 丁烯解反应采用商用钌复分解引发剂，在低温下快速进行，并可高选择性地生成可预测组成的航空燃料范围烃类混合物。该反应与脂肪酸制备生物柴油的过程平行进行，代表了迈向“生物炼制”策略的初步步骤27 具有商业可行性 等鞭藻 生物燃料生产

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Isochrysis&lt;/em&gt;</td><td>Reed Mariculture</td><td>Iso, 原始，未处理，20%干重</td><td>活体培养物糊状物，20% w/w 生物量</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Isochrysis&lt;/em&gt;</td><td>Necton, S.A</td><td>AADISS004</td><td>PhytoBloom Prof Isochrysis（冻干）</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher Chemical</td><td>H291-4</td><td>ACS 认证级</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-4</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Fisher Chemical</td><td>D37-4</td><td>认证级/稳定化</td></tr><tr><td>索氏提取装置</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64826</td><td></td></tr><tr><td>提取套管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64842</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chner 漏斗</td><td>Chemglass</td><td>CG-1406-25</td><td></td></tr><tr><td>高压反应釜</td><td>Chemglass</td><td>CG-1880-12</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>GE Life Sciences</td><td>1442-042</td><td>42号，灰分0.007%，圆形，42.5 mm</td></tr><tr><td>生物柴油（B100）</td><td>Bellingham Shell</td><td></td><td>&lt;strong&gt;图3&lt;/strong&gt;中的生物柴油（B100）购自当地加油站：Bellingham Shell，Bellingham，WA 98226</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Isochrysis&lt;/em&gt;</td><td>Aquacave</td><td></td><td>除Reed和Necton外，&lt;em&gt;Isochrysis&lt;/em&gt;也可从Aquacave（Gurnee, IL）购买，网址：www.aquacave.com（访问时间：2015年9月30日）。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Isochrysis&lt;/em&gt;</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>&lt;em&gt;Isochrysis&lt;/em&gt;也可从Brine Shrimp Direct（Ogden, UT）购买，网址：www.brineshrimpdirect.com（访问时间：2015年9月30日）。</td></tr></tbody></table>

从商业等鞭藻（isochrysis）藻类生物质中制备生物柴油并联产烯酮的实验方案

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

用可再生且更具环境可持续性的替代能源取代石油燃料的需求日益重要。在此背景下，生物质来源的生物燃料已受到广泛关注，然而，由玉米乙醇或大豆生物柴油等可食用作物制成的第一代生物燃料已普遍不再受青睐。因此，人们迫切希望开发出利用本土化且更优越的非食用原料生产液体燃料的方法。本文详细描述了一种从海洋微藻制备高纯度生物柴油的实验流程。 等鞭金藻此外，还平行分离出一组独特的脂质——多不饱和长链烯酮，这些物质可作为潜在的高价值副产品，用于抵消生物柴油生产的成本。数千克量级的 等鞭藻 从两家商业供应商购得，一种为湿浆（含水80%），需先干燥后再进行处理；另一种为干磨粉末（含水量95%干基）。采用索氏提取器用正己烷提取脂质，得到藻油&#34;己烷藻油&#34;) 含有传统脂肪（即， 甘油三酯（46-60% w/w）和烯酮（16-25% w/w）。对藻类油中的甘油三酯进行皂化，可将生成的游离脂肪酸（FFAs）与含烯酮的中性脂质分离。随后将FFAs转化为生物柴油即，脂肪酸甲酯（FAMEs）通过酸催化酯化反应制备，而烯酮则通过结晶法从中性脂质中分离和纯化。我们证明了来自商业的生物柴油 等鞭金藻 生物量的脂肪酸甲酯谱相似但不完全相同，其特征是多不饱和脂肪酸含量较高（约40% w/w）。以这些原料制备生物柴油时，产率始终更高。 等鞭藻 湿膏（12% w/w 对比 7% w/w），可归因于从粉末中获得的正己烷藻油量较低 等鞭金藻 产物

处理之前， Isochrysis 粘贴同-糊状物首先被干燥。大规模操作时，可通过向其中加入 Iso-转移至大型结晶皿中，在室温下静置风干。干燥过程中会形成部分积水（通常呈红褐色），可通过倾倒或移液去除，以加速干燥进程。约48–96小时后，材料已完全干燥 等鞭藻 可从结晶皿中刮取，得到黑色/绿色片状物质，具有类似海藻的气味（图2）。干重生物量的得率通常为糊状物重量的20%（w/w），与产品说明一致。相比之下，粉末状 等鞭金藻 产物（异-粉末为黄棕色、细磨的干燥粉末（含水量95%），可直接使用，无需进一步处理（图2).
<img alt="土壤改良过程；灰分与生物炭比较；实验结果；土壤改良研究。" src="/files/ftp_upload/54189/54189fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 商业 Isochrysis 的比较。将 Isochrysis 膏状物（含水量 80%）均匀铺在结晶皿底部，在室温下风干 48–96 小时后进行处理。所得干燥 Isochrysis 呈深色片状物质（右侧），其外观不同于市售的干燥粉末状 Isochrysis（左侧）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
使用索氏提取法以正己烷分别提取干燥的Iso-膏状物或Iso-粉末，除去正己烷后得到藻油（h-AO），其外观相似，均为深绿色至近黑色的固体（熔点约 50–60 °C）。以膏状物为起始原料所得藻油（“Iso-膏状物-hAO”）的产率通常为干燥Isochrysis生物量的 20%（w/w），与我们先前的结果一致26；而以市售粉末状Isochrysis进行索氏提取所得藻油（“Iso-粉末-hAO”）的产率为 15%（w/w）（表 1）。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>产物 (g)</td>
			<td>Iso-糊状物</td>
			<td>Iso-粉末-1</td>
			<td>Iso-粉末-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>干生物量</td>
			<td>30</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>己烷藻油</td>
			<td>5.86</td>
			<td>2.87</td>
			<td>3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>游离脂肪酸（FFAs）</td>
			<td>3.52</td>
			<td>1.34</td>
			<td>1.38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中性脂质</td>
			<td>2.34</td>
			<td>1.38</td>
			<td>1.61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>长链烯酮（Alkenones）</td>
			<td>0.94</td>
			<td>0.63</td>
			<td>0.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">注：Iso-粉末-1 和 Iso-粉末-2 代表两份等量 Isochrysis 粉末样品平行处理所得的结果。有关从 Iso-糊状物获得这些产物的其他报告，请参见文献 26、32 和 33。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 商业产品的产量 等鞭藻 生物量
人肝细胞样类器官（h-AO）中的酰基甘油转化为相应的水溶性羧酸盐即， 在甲醇/CH中加入水性KOH后生成的肥皂）2Cl2中性脂质（包括烯酮）随后通过正己烷的选择性分配从该水相混合物中提取。在去除中性脂质后，将皂化产物重新酸化，得到相应的游离脂肪酸（FFAs），这些游离脂肪酸同样可用正己烷从水相中提取。总体质量回收率针对合并的FFAs和中性脂质，无论来自 同-paste-hAO 或 Iso-powder-hAO 的产物比例始终接近定量。然而，产物的比例（即， 中性脂质 + 游离脂肪酸）存在差异。从 同-我们获得的产物中，游离脂肪酸（FFAs）占60%（w/w），中性脂质占40%（w/w）。表1。相反， 同-粉末-hAO 中性脂质含量丰富（平均为 54% 中性脂质 + 46% 游离脂肪酸），详见于 表1.
游离脂肪酸与H的酯化反应2SO4 然后用甲醇生成脂肪酸甲酯（FAMEs， 即，生物柴油）为深绿色近黑色的油状液体，产率超过90%（图3). 通过蒙脱石K10加热脱色29 （MK10）黏土随后得到黄色/橙色产物，外观与其他市售生物柴油燃料相似（参见材料列表）图3）。脱色后FAME分析结果 等鞭金藻 生物柴油燃料如图所示 表2.
<img alt="用于色谱分析的化学分析装置，带有样品瓶；有机化合物分离过程。" src="/files/ftp_upload/54189/54189fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. Isochrysis 生物柴油与大豆生物柴油的比较。 绿色的Isochrysis生物柴油（中间）是通过提取并纯化的游离脂肪酸酯化反应制得。脱色处理后得到的产品（右侧）具有与商用生物柴油（左侧）相似的性质。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>脂肪酸甲酯A</td>
			<td>Iso粘贴</td>
			<td>Iso-粉末</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14:00</td>
			<td>16.4</td>
			<td>19.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14:01</td>
			<td>-</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15:00</td>
			<td>痕量</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:00</td>
			<td>10.1</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:1 Δ9</td>
			<td>7.6</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:02</td>
			<td>ND</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16:03</td>
			<td>未检测到</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:00</td>
			<td>痕量</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1B</td>
			<td>12.1</td>
			<td>14.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:02</td>
			<td>8.1</td>
			<td>7.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:3C</td>
			<td>8.5</td>
			<td>13.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:04</td>
			<td>19.8</td>
			<td>10.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:05</td>
			<td>ND</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20:05</td>
			<td>未检测到</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22:05</td>
			<td>未检测到</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22:06</td>
			<td>6.9</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ΣD</td>
			<td>89.8</td>
			<td>96.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">注意事项： A脂肪酸命名法为#碳原子数:#双键数cis-双键。 B18:1 Δ9 与 18:1 Δ11 的混合物 CΔ6,9,12 和 Δ9,12,15 异构体的混合物。 D剩余物质中，其他脂肪酸甲酯（FAME）与非FAME组分的比例约为50:50（FAME总量约占95%）。ND = 未检出。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 由商业 Iso-past 和 Iso-powder 亚心形扁藻（Isochrysis）生物质制备的生物柴油的脂肪酸甲酯（FAME）组成。
中性脂质以绿色固体混合物的形式获得，其质量分数为40%（w/w），来自Iso-糊状-hAO，而来自Iso-粉末-hAO的中性脂质为54%（平均值）（表1）。将溶解的中性脂质用二氯甲烷（DCM）通过硅胶过滤，除去溶剂后得到红褐色/橙色固体，该固体可用正己烷重结晶，得到分析纯的烯酮类化合物，呈白色固体。该方法从Iso-糊状-hAO中获得16%（w/w）的分离产率，从Iso-粉末-hAO中获得25%的产率（表1）。

本文详细介绍了利用商业性等鞭金藻（Isochrysis）生产生物柴油并同时共分离高价值副产物烯酮的方法。

从商业等鞭藻（Isochrysis）藻类生物质中制备生物柴油并联产烯酮的实验方案

用可再生且更具环境可持续性的替代能源取代石油燃料的需求日益重要。

本实验的总体目标是利用市售的等鞭金藻（Isochyrsis Algal）生产生物柴油，同时实现长链烯酮作为高价值副产物的共分离。该方法有助于回答可再生能源领域中的关键问题，例如，藻类生物燃料是否可作为石油基燃料的可行替代品。该技术的主要优势在于，我们所使用的藻类已实现工业化培养，并可从多家商业供应商处购得数千克量级的产品。此外，这类特定藻类能够生物合成一类独特的长链烯酮类脂质，可作为副产物进行分离提取。本实验操作将由我实验室的研究生 John Williams 进行示范。为了制备市售的湿等鞭藻糊，可在1千克包装上剪开一个小孔，将约300克藻糊挤入一个150 × 75毫米的结晶皿中。该藻糊含水量约为80%，呈深绿色，近乎黑色，并具有刺激性气味。将藻糊在空气中干燥，形成厚度约为20毫米的藻层。将干燥的生物量刮入已知质量的纤维素提取套管中。然后记录等鞭金藻生物量的重量。将约50至60克干燥的等鞭金藻转移至索氏提取装置中。然后，向索氏提取器烧瓶中加入 400 毫升正己烷。打开冷凝水和加热源，使索氏提取器循环提取一至两天。当溶剂颜色由深绿色变为浅黄色时，表明提取完成。将其冷却至室温，使用旋转蒸发仪除去己烷。最后，称量己烷藻油。首先，在其烧瓶中用10倍体积的甲醇-二氯甲烷（2:1）溶解己烷藻油。接下来，加入一个搅拌子，以及相当于油体积两又三分之二倍的水，并加入质量为油重一半的氢氧化钾。然后，将烧瓶连接至一根500毫米长的回流冷凝管。在通风橱中，于60°C下加热搅拌反应混合物，持续3小时。反应冷却后，用旋转蒸发仪除去有机溶剂。然后将剩余的水相混合物倒入一个1升的分液漏斗中，并加入等体积的正己烷。用正己烷冲洗烧瓶，以确保所有物质都转移至漏斗中。振荡分液漏斗并静置，使各层分离。随后，将下层水相排入一个烧瓶中，并将上层有机相倾入第二个烧瓶中。保留两个层。重复己烷萃取，直至有机层变为浅黄绿色。然后合并收集的有机提取物，并在旋转蒸发仪上浓缩，以分离中性脂质。这些脂质呈绿色固体状，熔点介于60至70摄氏度之间。接下来，使用6摩尔盐酸将水相酸化至pH为2。然后，如前所述，使用己烷和分液漏斗从酸化的水相中萃取游离脂肪酸。最后，使用旋转蒸发仪除去合并的有机萃取液中的己烷，以获得纯化的游离脂肪酸。一种深绿色近黑色的油状残留物，熔点略高于30摄氏度。用六倍体积的甲醇-氯仿溶解脂肪酸，然后将溶液倒入带有搅拌子的厚壁高压反应瓶中，用溶剂冲洗以确保所有脂肪酸完全转移至反应瓶内。随后，在通风橱中加入浓硫酸。密封烧瓶，边搅拌边将混合物加热至 90 摄氏度，持续一小时。待反应液冷却至室温后，将其倒入分液漏斗中，并加入两倍体积的水。随后振荡分液漏斗，静置分层，待两相分离后，将下层液体排入已称重的圆底烧瓶中。然后，使用旋转蒸发仪浓缩溶液，并称量所得生物柴油的质量，该物质现在可使用气相色谱仪进行分析。可将中性脂质从圆底烧瓶中刮下，称重后转移至烧瓶中进行纯化。首先用少量二氯甲烷溶解中性脂质。然后，将溶液上样至含有100克硅胶的层析柱中。接着，使用轻微压力，用约150毫升二氯甲烷将溶液通过硅胶柱进行洗脱。在柱子顶部加入一层薄沙，以防止在加入溶剂时硅胶层受到扰动。在250毫升圆底烧瓶中收集叶绿素提取物，然后使用旋转蒸发仪除去二氯甲烷。结果应得到橙色固体。在沸腾的正己烷中重新结晶固体。首先加入100毫升初始量的正己烷，然后继续添加沸腾的正己烷，直至溶液变为均一。随后，将溶液缓慢冷却至室温以促进结晶，并使用过滤装置收集析出的烯酮晶体。使用少量冰冷的己烷冲洗烧瓶。在处理前，等鞭金藻糊首先被干燥，得到一种呈海藻样气味的黑色、绿色、片状物质。相比之下，粉末状等鞭金藻为黄褐色细磨干粉，无需进一步处理即可使用。使用索氏提取法从两种材料中用正己烷提取藻油，其产率均显著高于粉末，尤其是藻泥。藻油中的酰基甘油被转化为水溶性羧酸盐，从而几乎定量地从两种起始材料中提取出中性脂质和游离脂肪酸。然而，产物的比例有所不同。酯化反应生成了脂肪酸甲酯。这种物质也被称为生物柴油，呈深绿色至近黑色的油状液体。产率超过90%。根据文本方案所述，对产物进行了脱色处理。对提纯后的生物柴油燃料进行FAME分析，结果显示两种起始原料得到的产物谱图相似但并不完全相同。将溶解的中性脂质通过二氯甲烷（DCM）在硅胶上过滤，得到红橙色固体，再用正己烷重结晶，获得分析纯的烯酮类化合物。观看本视频后，您应能够充分理解如何将市售的等鞭金藻（Isochrysis）加工为生物柴油，并同时分离得到高纯度的烯酮作为副产物。一旦掌握，该技术可稳定地制备出大量藻类生物柴油和烯酮类化合物，用于后续研究。随着该技术的发展，我们能够获得足量的样品以开展各项燃料性能测试，从而为深入评估藻类生物柴油的燃料特性开辟了途径，而不再依赖于预测或模拟结果。请注意，使用强酸或强碱并在密闭容器中加热内容物可能存在极高危险性。进行这些步骤时，务必穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱内操作。

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