小鼠骨髓来源的GM-CSF诱导类肺泡巨噬细胞和树突状细胞的生成与鉴定

本实验的总体目标是通过添加GM-CSF的体外小鼠骨髓细胞培养，生成并区分肺泡样巨噬细胞与树突状细胞。该体外方法有助于回答有关树突状细胞或巨噬细胞功能的关键问题。该技术的主要优势在于能够产生足够数量的细胞，并且可以有效区分树突状细胞与肺泡样巨噬细胞。

该技术的应用前景可能延伸至肺泡蛋白沉积症的治疗，因为它有助于获取类似肺泡的巨噬细胞，这些细胞可用于治疗该疾病。通常，初次接触该方法的研究人员需要练习如何分离出洁净的骨骼并冲洗骨髓。该方法的可视化演示非常有用，因为仅靠文字说明难以充分理解所有操作步骤。

开始解剖前15分钟，打开生物安全柜以净化柜内空气并稳定气流，并用70%乙醇清洁柜内表面。当安全柜准备就绪后，将一只小鼠腹侧朝下置于一到两张纸巾上，并用70%乙醇喷洒动物体表。然后，用非惯用手提起胸部区域的皮肤，使用剪刀进行切口。

抓住切口两端，轻轻牵拉，直至切口两端在胃部位置相遇。然后将小鼠置于仰卧位，用一只手向下牵拉下半部分皮肤，直至腿部暴露。握住足部，在踝关节上方切断跟腱，并在胫骨下端切断连接肌肉与足部的韧带，以使足部与腿部骨骼分离。

保持腿部抬高，剥离股骨下端膝关节周围的肌肉和韧带，将大腿肌肉与小腿分离。用镊子轻轻将松解的肌肉从腓骨和股骨表面移开。然后将剪刀呈张开状态插入髋关节处，旋转腿部并轻轻牵拉股骨，同时剪断组织，使腿骨与髋关节分离，将腿部从身体上完全剪下。

现在用无菌镊子夹住腿部的髋端，用另一把镊子从踝关节处取下足部。然后用一把镊子夹住股骨远端，另一把镊子夹住胫骨和腓骨近端，小心地将胫骨和腓骨向膝关节相反方向弯曲，以分离小腿与股骨及髌骨。用镊子去除小腿骨上残留的韧带、肌肉和腓骨，将清理干净的胫骨置于含有1至2毫升HBSS/FCS的倒置培养皿盖中。

用一把镊子夹住股骨下端，另一把镊子夹住髌骨，将膝关节及周围组织向相反方向弯曲，以分离关节。随后去除股骨上残留的结缔组织，并将骨骼置于倒置的培养皿盖上。当所有骨骼均分离完成后，用镊子清除仍附着在骨骼上的残余组织，并将骨骼浸入培养皿底部盛有的10毫升HBSS/FCS溶液中。

保持培养皿部分被无菌盖遮挡，用剪刀将每根已清洗的骨骼剪成两半。然后使用配有26.5号针头的1毫升注射器，从培养皿中吸取1毫升HBSS/FCS，冲洗每块骨片的一端，直至所有红骨髓被冲出。将任何可见的骨髓团块反复通过注射器数次，以制成单细胞悬液，随后用10毫升移液管充分混匀。

将细胞转移至收集管中，并用五毫升 HBSS/FCS 冲洗培养皿一次，以收集残留的细胞。随后将洗涤液合并至收集管中，并将细胞置于冰上。为建立骨髓细胞培养，离心收集的细胞，并使用连接真空负压装置的无菌玻璃巴斯德吸管吸除上清液。

轻轻敲击使富含红细胞的沉淀松散。随后加入10毫升红细胞裂解缓冲液，通过涡旋重悬细胞。室温孵育5分钟后，加入10毫升HBSS/FCS终止裂解，离心收集细胞，并将沉淀重悬于骨髓细胞培养基中。

使用台盼蓝排斥法计数活细胞数量，并将所需细胞转移至含有骨髓细胞培养基的新离心管中。然后通过离心收集细胞，并用含20纳克/毫升GM-CSF的骨髓细胞培养基将细胞沉淀重悬至浓度为四百万细胞/毫升。接着，向每份培养用的无菌细菌培养皿中加入9.5毫升含20纳克/毫升GM-CSF的骨髓细胞培养基，并将500微升细胞悬液加入每个培养皿中央。

在37摄氏度、5% CO2条件下培养细胞。第3天时，向每份培养物中加入10毫升新鲜骨髓培养基，培养基中添加20纳克/毫升GM-CSF，操作时注意尽量减少对细胞的扰动。第6天时，小心转移10毫升细胞培养上清液至无菌的50毫升锥形管中。

离心细胞，并将沉淀重悬于10毫升含有20纳克/毫升GM-CSF的新鲜骨髓细胞培养基中。然后轻轻涡旋混匀细胞悬液，并将细胞返回至培养皿中。第1天时，骨髓细胞体积较小且分布稀疏；但至第3天，细胞数量和体积均有所增加，部分细胞已开始贴壁。

到第6天时，细胞数量增多，可观察到贴壁和非贴壁两种细胞组分。培养物可在第7至第10天收获，并根据细胞大小和活细胞进行分选，其中第10天培养获得的CD11c阳性细胞比例更高。在第7天，所收集的非贴壁组分中具有树突状形态的细胞显著富集。

在第7天和第10天收获的CD11c阳性、GR1阴性细胞群体可分为三个主要亚群，即根据MHCII表达和FL-HA结合能力区分的巨噬细胞、未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞。有趣的是，MerTK虽然通常被认为是巨噬细胞的标志物，但在第7天和第10天收获的巨噬细胞以及未成熟树突状细胞群体中均表现出显著表达，而在成熟树突状细胞中表达水平较低。

在进行该操作时，必须始终牢记在整个骨髓采集和细胞培养过程中使用无菌技术。完成该操作后，还可对细胞进行分选以分别研究不同的细胞群体，或使用炎性因子刺激细胞，随后通过细胞内染色和流式细胞术分析其细胞因子的产生情况。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离骨髓细胞，并在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的培养基中培养，以生成树突状细胞和肺泡样巨噬细胞。