代和GM-CSF的鉴定源性肺泡状巨噬细胞和树突状细胞从小鼠骨髓

总体目标是该程序在补充有 GM-CSF 的体外小鼠骨髓细胞培养物中生成和区分肺泡样巨噬细胞和树突状细胞。这种体外方法可以帮助回答有关树突状细胞或巨噬细胞功能的关键问题。该技术的主要优点是它可以产生足够的细胞数量，并且可以区分树突状细胞和肺泡状巨噬细胞。

该技术的意义可能延伸到肺蛋白沉积症的治疗，因为它有助于获得肺泡样巨噬细胞，可用于治疗这种疾病。一般来说，刚接触这种方法的人需要练习分离清洁的骨骼并冲洗骨髓。这种方法的视觉演示很有用，因为并非所有技术都仅通过书面说明即可轻松理解。

开始解剖前 15 分钟，打开生物安全柜，吹扫柜内空气，稳定气流，用 70% 乙醇清洁柜面。柜子准备好后，将一只老鼠放在一到两张俯卧位的纸巾上，并用 70% 乙醇喷洒动物。然后，用非惯用手提起胸部区域周围的皮肤，用剪刀做一个切口。

抓住切口的两端，小心地拉动，直到切口的两端与腹部相遇。然后将鼠标置于仰卧位，用一只手将下半部分皮肤向下拉，直到露出腿部。握住脚，切开踝关节上方的跟腱和胫骨下端连接肌肉和足部的韧带，以松开脚与腿骨的联系。

保持腿部抬高，去除股骨下端膝关节周围的肌肉和韧带，以严重削弱小腿的大腿肌肉。使用镊子轻轻地将松弛的肌肉从腓骨和股骨表面拉开。然后将剪刀压在髋关节处的打开位置，旋转腿部并轻轻拉动股骨，将腿骨与髋关节分开，同时将腿从身体上剪开。

现在用无菌镊子将腿固定在臀部末端，使用另一个镊子将脚从脚踝端移出。然后用一把镊子握住股骨的远端，用另一把镊子握住胫骨和腓骨的近端，小心地将胫骨和腓骨向膝关节的相反方向弯曲，将小腿与股骨和髌骨分开。使用镊子从小腿骨上去除剩余的韧带、肌肉和腓骨，并将清洁后的胫骨放在含有 1 至 2 毫升 HBSS/FCS 的倒培养皿盖上。

用一组镊子握住股骨的下端，用另一组钳子握住髌骨，向相反方向弯曲膝盖和周围组织以去除关节。然后从股骨中取出任何剩余的结缔组织，并将骨头放在倒培养皿盖上。收获所有骨骼后，使用镊子清洁仍附着在骨骼上的任何残留组织，并将骨骼浸入培养皿底部的 10 毫升 HBSS/FCS 中。

用无菌盖子保持培养皿的部分屏蔽，用剪刀将每根清洁的骨头切成两半。然后使用配备 26.5 号针头的 1 毫升注射器将培养皿中的 1 毫升 HBSS/FCS 冲洗到每个骨块的末端，直到所有红骨髓都被释放出来。将任何可见的骨髓块通过注射器数次，形成单细胞悬液，然后用 10 毫升移液管充分混合。

将细胞转移到收集管中，并用 5 毫升 HBSS/FCS 冲洗培养皿一次，以收集任何残留细胞。然后将洗涤液汇集在收集管中，并将细胞置于冰上。为了建立骨髓细胞培养物，将收集的细胞离心，并用连接到真空抽吸装置的无菌玻璃巴斯德移液器吸出上清液。

轻敲松开富含红细胞的沉淀。然后加入 10 ml RBC 裂解缓冲液，并涡旋重悬细胞。室温孵育 5 分钟后，用 10 mL HBSS/FCS 阻止裂解并离心细胞，将沉淀重悬于骨髓细胞培养基中。

通过台盼蓝排除计数活细胞的数量，并将所需的细胞转移到装有骨髓细胞培养基的新试管中。然后通过离心收集细胞，并在含有 20 ng/mL GM-CSF 的骨髓细胞培养基中以每毫升 400 万个细胞的稀释度重悬沉淀。接下来，将 9.5 毫升补充有 20 ng/ml GM-CSF 的骨髓细胞培养基添加到每个培养物的一个无菌细菌培养皿中，并将 500 μL 细胞添加到每个培养皿的中心。

在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育细胞。第 3 天，向每个培养物中加入 10 毫升新鲜骨髓培养基，每毫升添加 20 ng/mL GM-CSF，注意尽量减少对细胞的任何干扰。第 6 天，小心地将 10 mL 细胞培养上清液转移到无菌的 50 mL 锥形管中。

离心细胞并将沉淀重悬于 10 毫升新鲜骨髓细胞培养基中，每毫升 GM-CSF 含有 20 纳克。然后轻轻涡旋细胞悬液，将细胞放回培养皿中。第 1 天，骨髓细胞小而稀疏，但到第 3 天，细胞的数量和大小都有所增加，有些已经开始粘附。

到第 6 天，有更多的细胞，并且观察到贴壁和非贴壁组分。可以从第 7 天到第 10 天收获培养物，并按大小和活细胞设门，从第 10 天培养中获得的 CD11c 阳性细胞百分比更高。在第 7 天，收集的非贴壁部分对于具有树突状形态的细胞非常富集。

在第 7 天和第 10 天收获的 CD11c 阳性、GR1 阴性群体可分为三个主要群体。巨噬细胞、未成熟的树突状细胞和成熟的树突状细胞通过 MHCII 表达和 FL-HA 结合。有趣的是，MerTK 虽然被认为是巨噬细胞标志物，但在第 7 天和第 10 天收获的巨噬细胞和未成熟树突状细胞群上均表现出强烈的表达，在成熟的树突状细胞中观察到低水平表达。

在尝试此程序时，重要的是要记住在整个骨髓采集和细胞培养过程中使用无菌技术。在此程序之后，还可以对细胞进行分类以单独检查细胞群，或者可以用炎症剂刺激它们，然后通过细胞内染色和流式细胞术分析其细胞因子的产生。看完这个视频，你应该对如何分离骨髓细胞并在 GM-CSF 中培养它们以产生树突状细胞和肺泡样巨噬细胞有很好的了解。