Name: 骨髓祖细胞的逆转录病毒转导到生成T细胞受体Retrogenic小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学习利用逆转录病毒转导骨髓祖细胞生成T细胞受体Retrogenic小鼠的方法，通过2A肽连接TCRα和β链，可在约七周内重建T细胞区室，用于筛选多种抗原特异性TCR并消除创始者效应。

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本工作获得了以下资助：美国国立卫生研究院（NIH）（5K22A1119151-01 和 1R56DK104903-01）授予 M.L.B. 的基金、贝勒医学院糖尿病研究中心（P30-DK079638）的试点/可行性项目计划、JDRF 1-FAC-2014-243-A-N APF、美国糖尿病协会（ADA）1-15-JF-07、美国免疫学会免疫学职业奖学金授予 M.B. 的资助，以及罗伯特和简妮斯·麦克奈尔基金会的资助。

伦理声明：在照射和尾静脉注射过程中，将尽一切努力将动物的不适或应激降至最低。本实验使用小鼠作为细胞来源；因此，除安乐死外，不涉及其他操作或处理。小鼠将通过吸入 CO2 进行安乐死，随后实施颈椎脱位以确认死亡。该程序符合美国兽医医学协会安乐死专家组的建议。
1. 准备逆转录病毒载体
<ol>
	<li>将T细胞受体（TCR）α链和β链亚克隆至基于MSCV的逆转录病毒载体中，两链之间由2A连接肽分隔11 载体（例如 pMIAII 或 pMIGII）11. 
	注意：2A连接肽可实现从单一开放阅读框中对TCR α链和β链进行化学计量比一致且协调的表达。该载体包含一个IRES荧光蛋白盒（ametrine或GFP），用于追踪转导细胞及转导效率。详细实验方案请参见Holst 等11</li>
	<li>使用市售质粒DNA提取试剂盒或类似产品分离质粒DNA。工作浓度为1 - 2 μg/μl-1.</li>
</ol>
2. 逆转录病毒生产细胞系的建立
<ol>
	<li>采用两步法生成逆转录病毒生产细胞系。 
	注：详细方案请参阅 Holst et al.11。
	<ol>
		<li>通过将三种质粒（pVSVG、pEQ-Pam3(-E) 和目的载体11）瞬时转染至 293T 细胞中产生逆转录病毒，并收集 293T 细胞的病毒上清，用于转导 GP+E86 嗜性逆转录病毒生产细胞系。</li>
		<li>通过 FACS 分离荧光表达最强的前 40% GP+E86 生产细胞，并扩增这些转导后的 GP+E86 生产细胞作为病毒来源。 
		注：高滴度病毒生产细胞系的构建对于骨髓细胞的高效转导至关重要。完整方案请参阅 Holst et al.11</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 逆转录病毒介导的干细胞基因转移（第 -5 天）&#160;
<ol>
	<li>解冻并培养0.5–1.0 × 106个每种GP+E86病毒产生细胞系，使用含10%（体积比）胎牛血清的完全DMEM培养基，确保在本实验方案的第0天时可获得两个汇合的150 mm培养皿所需的足够细胞量。 
	注意：在10 cm培养皿中解冻0.5–1.0 × 106个每种GP+E86病毒产生细胞系，可在第5天达到30–50%汇合度。这允许连续培养5天，从而在第0天将GP+E86病毒产生细胞系扩增至两个汇合的150 mm培养皿。
	<ol>
		<li>在含有5%胎牛血清和环丙沙星（10 μg/ml）的完全组织培养基中培养逆转录病毒产生细胞系，以防止支原体污染。 
		注意：在制备用于骨髓转导的病毒上清液时，应停止使用环丙沙星。避免病毒产生细胞系过度生长，否则会降低骨髓转导效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 向供体小鼠注射5-氟尿嘧啶（5-FU）（第 -3 天）
<ol>
	<li>称重供体小鼠（5 - 12 周龄），以确定所需 5-FU 的剂量。使用小于 5 周龄的小鼠会导致骨髓产量较低。为确保单一 TCR 的表达，应选用 T 细胞缺陷型小鼠品系（如 SCID、RAG 或 TCR alpha 缺陷小鼠）作为骨髓供体。</li>
	<li>在组织培养超净台中，用无菌 PBS 稀释 5-FU 储存液，配制足够量的 10 mg ml-1 5-FU 工作液，以便按每克体重 0.15 mg 的剂量给予 5-FU。</li>
	<li>使用带有 37 G 针头的 1 ml 注射器，按每克体重 0.15 mg 5-FU 的剂量对每只供体小鼠进行腹腔注射。 
	注意：初始实验可每只受体小鼠使用一只供体小鼠，随后可根据细胞产量调整供体小鼠数量。另一种富集和分离骨髓前体细胞的方法是通过阴性筛选去除谱系阳性细胞，具体方法参见 Viret et al. 的描述。</li>
</ol>
5. 骨髓提取步骤（第0天）
<ol>
	<li>准备解剖剪和镊子用于分离骨骼。配制培养基（含5% FCS（体积比）的HBSS），并将骨骼收集至50 ml锥形管中。将装有培养基的50 ml锥形管置于冰上。通过吸入CO2处死小鼠，随后进行颈椎脱位以确认死亡。捏压足掌以确保无任何反射存在。</li>
	<li>使用乙醇或甲醇对手术部位和手术器械进行消毒。首先沿骨盆带上方及下方剪开，小心取出股骨、胫骨、肱骨和骨盆带。用剪刀和镊子去除骨骼周围所有组织，以获得干净的骨骼。将骨骼保存在含5%（体积比）FBS的HBSS中以保持湿润。</li>
	<li>在关节处剪断骨骼，确保每根骨骼两端均被切除。将连接有10 ml注射器（内含HBSS + 5%（体积比）FBS）的25号针头插入骨骼中，施加压力，将全部骨髓冲过置于50 ml锥形管上的70-μm细胞筛网。</li>
	<li>定期使用1 ml或3 ml注射器的推杆将骨髓细胞推过70-μm滤器。用HBSS + 5%（体积比）FBS冲洗滤器，以确保获得不含骨碎片和组织的单细胞悬液。整个操作应在无菌操作台中进行，以保持细胞无菌。</li>
	<li>将骨髓细胞在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。</li>
</ol>
6. 骨髓培养（第0天）
<ol>
	<li>倾去或吸除培养基，每50 ml离心管中加入1 ml基于氯化铵的红细胞裂解缓冲液（或等效的红细胞裂解缓冲液）重悬细胞沉淀。室温孵育1分钟后，加入10 ml含20%（体积比）胎牛血清的完全DMEM培养基以终止红细胞裂解反应。</li>
	<li>在4 °C下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>倾去或吸除上清液，用5 ml含20%（体积比）胎牛血清的完全DMEM培养基重悬骨髓细胞。使用Neubauer计数板进行细胞计数。 
	注意：每只小鼠通常可获得约5–10 × 106个细胞；但不同品系小鼠的细胞得率可能存在差异。</li>
	<li>将骨髓细胞以每150 mm培养皿4 × 107个细胞的密度接种于30 ml含20%（体积比）胎牛血清的完全DMEM培养基中，并添加IL-3（20 g ml-1）、IL-6（50 g ml-1）和SCF（50 g ml-1）。 
	注意：使用 freshly thawed-aliquoted 的细胞因子。避免使用反复冻融超过一次或在4 °C下保存超过2周的细胞因子。</li>
	<li>将骨髓细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜（约24小时）。</li>
</ol>
7. 逆转录病毒生产细胞培养（第0天）
<ol>
	<li>每150 mm培养皿中接种3 × 106个逆转录病毒生产细胞，加入18 ml含20%（体积比）胎牛血清的完全DMEM培养基。</li>
	<li>将逆转录病毒生产细胞在37 °C条件下孵育过夜。每1500万个骨髓细胞需准备一个150 mm培养皿（约相当于2–3只供体小鼠）。</li>
</ol>
8. 慢病毒上清液（第1天）
<ol>
	<li>第二天（约24小时后），使用10 ml注射器直接从150 mm培养皿中吸取逆转录病毒上清液（在步骤7中设置），并通过0.45 μm注射器滤器进行过滤，收集病毒上清。</li>
	<li>小心地将移除的逆转录病毒上清液替换为18 ml新鲜的完全DMEM 20%（体积比）FBS。</li>
	<li>向过滤后的逆转录病毒上清液中添加IL-3（20 g ml-1）、IL-6（50 g ml-1）、MSCF（50 g ml-1）和Hexadimethrine bromide（Polybrene）（6 μg ml-1）。 
	注意：Hexadimethrine bromide应每2个月新鲜配制一次，以避免逆转录病毒感染效率下降。</li>
</ol>
9. 骨髓采集（第1天）
<ol>
	<li>完成步骤8.3后，收集步骤6.4中的骨髓细胞，并将含有非贴壁细胞的培养基转移至无菌的50 ml离心管中。</li>
	<li>用10 ml PBS剧烈冲洗培养板，并将冲洗液收集至步骤9.1中的50 ml离心管中。如有必要，重复洗涤步骤。</li>
	<li>在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟，弃去上清液，用少量（1–3 ml）完全DMEM（含20%（v/v）FBS）重悬细胞并计数。预计细胞回收率为第0天的50–75%。将骨髓细胞重悬于每1 ml含细胞因子和Hexadimethrine bromide的逆转录病毒上清液中，细胞密度为1 × 106 个细胞。</li>
</ol>
10. 骨髓转导（第1天）
<ol>
	<li>将逆转录病毒上清液/骨髓混合物以每孔3 ml的体积接种至六孔组织培养板中。在进行步骤10.2的离心操作前，用塑料薄膜包裹培养板，以尽量减少气体交换。</li>
	<li>将包裹好的六孔板在37 °C下以1,000 × g离心60分钟。</li>
	<li>离心结束后，移除塑料薄膜，将培养板置于37 °C、CO2培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
11. 逆转录病毒上清液与转导（第2天）
<ol>
	<li>24小时后，从病毒生产细胞系中收集新鲜的病毒上清液。使用10 ml注射器和0.45 μm注射器滤器过滤逆转录病毒上清液。向过滤后的逆转录病毒上清液中添加IL-3（20 g ml-1）、IL-6（50 g ml-1）、SCF（50 g ml-1）和Hexadimethrine bromide（6 g ml-1）。</li>
	<li>接下来，用移液器小心吸除含有骨髓细胞的六孔板中每孔顶部的2 ml培养基。 
	注意：操作时需小心，避免吸走骨髓细胞，这些细胞通常集中在孔的中央。或者，可将移除的上清液离心以回收可能丢失的骨髓细胞。</li>
	<li>向骨髓细胞六孔板的每孔中加入3 ml含有细胞因子和Hexadimethrine bromide的新鲜病毒上清液。用塑料膜包裹培养板，在37 °C下以1,000 × g离心60分钟，重复一次转导过程。取出后揭去塑料膜，将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜（约24小时）。</li>
</ol>
12. 添加新鲜补充的DMEM（第3天）
<ol>
	<li>24 小时后，按照步骤 11.2 的方法，从含有骨髓细胞的六孔板的每个孔中移除上层 2 ml 培养基。用新鲜的 DMEM 20%（体积比）FBS 替代移除的培养基，并补充终浓度为 IL-3（20 g ml-1）、IL-6（50 g ml-1）和 SCF（50 g ml-1）。</li>
	<li>将骨髓细胞培养板置于 37 °C CO2 培养箱中继续孵育 24 小时。</li>
</ol>
13. 收获转导的骨髓（第4天）
<ol>
	<li>24小时后，从六孔板中收集骨髓细胞。用PBS剧烈冲洗培养板，以去除所有非贴壁细胞。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用少量（1 ml）含 0.5%（体积比）热灭活 FBS 的 PBS 重悬骨髓细胞。将细胞置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取每种骨髓条件的10 μl样品，使用血细胞计数板进行细胞计数。假设每个受体接受1–2个供体，所获得的细胞数量足以转移至少4 × 106 每只受体小鼠的细胞数。将骨髓重悬于足量的 PBS + 0.5%（体积比）热灭活 FBS 中，使每只小鼠注射体积为 200 - 300 μl。
	<ol>
		<li>注射至少 2 x 106 转导效率为25%的细胞（可注射高达8 x106 每只小鼠静脉注射细胞。 
		注意：我们通常每两块6孔板的骨髓细胞注射五只受体小鼠。如果细胞产量显著偏低，应增加供体小鼠数量，直至获得足够的骨髓细胞数。为了实现最佳的重建效果，至少需要 5 x 105 转导成功（荧光阳性）的细胞应注入每个受体中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微量移液器，分别取每种骨髓条件的10 μl样本，通过流式细胞术检测荧光标记物的表达水平，分析转导效率（图1A)11. 
	注意：通常，荧光阳性细胞的比例在25%至70%之间，具体取决于构建体和逆转录病毒滴度。用于重建亚致死照射小鼠所需的转导骨髓细胞数量，可能因转导效率的不同而有所变化。转导效率越低，所需骨髓细胞数量越多；反之，骨髓转导效率越高，所需细胞数量则越少。转导效率低于25%时效果不理想，可能导致重建不充分和存活率降低。为确保最佳的骨髓恢复和转导效率，应使用 freshly prepared tissue culture media 和细胞因子。当利用逆转录基因系统表达新的TCR时，该TCR的选择 体内 尚不明确。根据每个个体TCR的亲和力不同，胸腺中的TCR选择以及外周T细胞的表达将有所差异17.</li>
</ol>
14. 小鼠辐照、骨髓注射及护理
<ol>
	<li>在骨髓注射前一天对小鼠进行照射（与步骤13同一天）。照射剂量如下：C57BL/6小鼠（及其他野生型品系），900 rads；Rag1-/-小鼠，500 rads；scid小鼠，300 rads。
	<ol>
		<li>在照射前，给受体小鼠提供阿莫西林（50 mg/kg/天）或其他抗生素饮水处理，并在骨髓注射后持续使用抗生素两周。 
		注意：最佳照射剂量可能需要通过实验确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射时，在注射前立即使用钝头针将步骤13.1中获得的细胞吸入1 ml注射器，然后更换为27号针头进行注射，排出所有空气以避免空气栓塞。在加热灯下对小鼠进行加热，每只小鼠静脉注射0.2 ml骨髓细胞悬液。 
	注意：细胞不得在注射器中停留任何时间，否则细胞会沉降。</li>
	<li>每周监测小鼠健康状况，确保其保持健康。</li>
	<li>5至6周后，对小鼠采血，通过检测GFP+/ametrine+与TCR共表达情况评估重建效果（图1B）11。</li>
</ol>

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<li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本方案中，我们详细说明了若干关键步骤，以确保骨髓健康、转导效率及重建效果达到最佳。第一个关键步骤是 GP+E86 病毒产生细胞的制备与妥善维护。应使用低代次的病毒产生细胞系，并在使用前保持其融合度不超过 80%。在制备新鲜的 GP+E86 病毒产生细胞时，需确保 293T 细胞处于低代次状态，并已在培养中生长 24 至 48 小时。在转导步骤中，若接种过多 GP+E86 细胞，将导致病毒滴度降低。病毒滴度的测定方法详见 Holst 等11 确保 GP+E86 具有强效的病毒产生能力。此外，从收获的骨髓中去除红细胞可提高转导效率。维持骨髓前体细胞的健康状态对本实验方案的成功至关重要。为此，务必使用新鲜培养基（添加胎牛血清后于 4 °C 保存不超过 4 周）和新鲜细胞因子（于 4 °C 保存不超过 2 周）。六甲溴铵（Hexadimethrine bromide）也易降解，配制成溶液后应每两个月重新配制一次。其他有助于维持骨髓细胞最佳健康状态和高效转导的细节包括：在进行离心转导前预热离心机；在 37 °C 条件下进行离心转导，并用封口膜包裹培养板以尽可能减少气体交换。此外，避免将骨髓细胞在 37 °...

据估计，人类和小鼠的T细胞受体（TCR）库分别包含约1×108和2×106种独特的TCR1,2。这种高度多样性使得T细胞能够识别由自身肽段以及由抗原呈递细胞（APC）上的主要组织相容性复合体（MHC）呈递的病原体来源的大量抗原表位。TCR与特异性肽-MHC复合物之间相互作用的细微差异决定了T细胞将经历凋亡、无能、活化、分化、细胞因子产生或细胞毒性等不同命运。然而，由于TCR库极为庞大，要分析某一特定TCR对特定抗原的应答，必须借助单个TCR系统。
为了在体内模型中研究单一T细胞受体（TCR）的功能，已构建了多种TCR转基因小鼠3-9。然而，TCR转基因小鼠存在一些局限性，包括制备成本高、生成单个转基因小鼠所需时间长，以及外源基因随机插入生殖系DNA所导致的所谓“创始人效应”10。因此，针对任一特定抗原所构建的TCR转基因小鼠数量相对有限，且同一表位在高亲和力与低亲和力TCR之间的功能差异很少被系统研究。为满足快速筛选并单独或联合研究多个TCR的需求，研究人员已采用逆转录基因（“retro”源自逆转录病毒，“genic”源自转基因）小鼠作为TCR转基因小鼠的替代方案11-13。
多种病毒中存在的2A肽共识基序为2A-Asp-Val/Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro，其中切割发生在2A的甘氨酸与2B的脯氨酸之间 顺式-作用水解酶活性，导致翻译过程中的核糖体跳跃10,14-16有关各种2A肽（F2A、E2A、T2A和P2A）切割机制的详细图示，请参见参考文献10–12。通过这种方式，可将两个顺反子（TCRα和TCRβ）连接，实现在单一载体中的化学计量比翻译。利用该方法，我们能够表达并直接比较多种抗原特异性的TCR。 在体.

<table><tbody><tr><td>DMEM，高糖 + 谷氨酰胺</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺的伊格尔改良培养基 &amp;和丙酮酸钠</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;#181;m 注射器滤器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>经 dH₂O 无菌过滤&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>环丙沙星&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-氟尿嘧啶（5-FU）</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 溶液</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco（隶属于 Life Technologies）</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 组织培养皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的6孔平底板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;#181;m 尼龙细胞滤网</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>人IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;PHC0063</td><td></td></tr><tr><td>小鼠干细胞因子</td><td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS 缓冲液</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27 G × 1/2 英寸 BD Precision Glide 针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G × 1/2 英寸 BD Precision Glide 针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成t细胞受体逆转录转基因小鼠

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T细胞受体（TCR）信号转导在胸腺内T细胞的发育以及在外周组织中T细胞的分化过程中均起着至关重要的作用。由于TCR种类极为多样，研究针对特定抗原的免疫应答变得十分困难。因此，人们构建了TCR转基因小鼠，用于研究胸腺中的阳性选择和阴性选择过程，以及外周T细胞的活化、增殖和耐受机制。然而，目前所构建的TCR转基因小鼠中，针对任一特定抗原的品系仍相对较少。因此，针对同一抗原肽但具有不同亲和力的TCR相关研究仍十分缺乏。构建一个新的TCR转基因小鼠品系通常需要六个月甚至更长时间，此外，若需进行特定的回交育种，还需额外耗时约六个月。为了实现对多个TCR的快速构建与筛选，研究人员建立了通过逆转录病毒转导骨髓细胞的技术方案，可实现TCRα与TCRβ链的化学计量比表达，并由此生成逆转录基因小鼠（retrogenic mice）。每只逆转录基因小鼠本质上均可视为一个独立的创始个体，从而几乎消除了创始者效应，同时将构建TCR逆转录基因小鼠的时间由六个月缩短至大约六周。本文介绍了一种快速且灵活的TCR转基因小鼠替代方案，该方法可在任意选定的遗传背景下表达任意特定的TCR。

在将骨髓经尾静脉注射入体内之前，需在方案的第13.3步检测骨髓的转导效率。在代表性骨髓转导结果图（图1A）中，取约10 μl收获的骨髓加入100 μl PBS中，检测ametrine的表达情况。通常，荧光阳性细胞的比例介于25%至70%之间，具体数值取决于所用构建体及逆转录病毒滴度。骨髓移植6周后，采集小鼠外周血以评估骨髓重建情况（图1B）。取约25 μl外周血，经红细胞裂解后，使用抗TCRβ抗体进行染色。在图2B中，所有TCR阳性细胞均一致表达ametrine荧光蛋白。
<img alt="流式细胞术分析示意图，骨髓和外周血单个核细胞的点图，显示FSC、SSC、Ametrine和TCR。" src="/files/ftp_upload/54196/54196fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" dat...

我们提出了一种基于逆转录病毒的单个T细胞受体（TCR）快速且灵活的实验方案 体内 表达系统。逆转录病毒载体用于转导骨髓前体细胞，以研究单个TCR的T细胞发育与功能 体内 作为TCR转基因小鼠的替代方案。

逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

T细胞受体（TCR）信号转导在胸腺内T细胞的发育以及外周T细胞的分化过程中均至关重要。大量...

本实验的目的是通过生成逆转录病毒转基因小鼠，以确定多种T细胞受体在体内的功能。该方法利用一种逆转录病毒载体，该载体编码由2A肽共识序列连接的T细胞受体α链和β链。通过筛选针对多种抗原的多个TCR，该方法能够有效解答免疫学领域的关键问题，从而明确其在体内的功能。该技术的主要优势在于，一旦逆转录病毒载体构建完成，逆转录基因小鼠的T细胞群体将在大约七周内完成重建。此外，每只逆转录基因小鼠本质上都相当于一个创始品系，因此通过分析多只小鼠，可消除创始者效应。本步骤的操作将由Maria Bettini博士演示。通过将无菌解剖剪和镊子放置在手术区域，并将解剖液置于冰上的50毫升锥形管中预冷，以准备骨髓提取。在处死小鼠并通过颈椎脱位确认死亡后，使用解剖剪沿骨盆带向上及下方剪开以移除骨盆。然后沿股骨向胫骨方向剪开，小心取出股骨、胫骨和肱骨。将骨骼转移至组织培养罩内的解剖液培养皿中，使用剪刀和镊子去除所有周围组织，以获得干净的骨骼。通过在关节处剪切分离骨骼，确保剪去每根骨骼的两端。然后将连接有含解剖液的10毫升注射器的25号针头插入骨骼中。施加压力，将全部骨髓细胞通过置于50毫升锥形管上的70微米细胞筛过滤。定期使用1毫升注射器的推杆将骨髓细胞推过70微米滤器，并用培养基冲洗滤器。将骨髓单细胞悬液在4摄氏度下以300 × g离心10分钟。离心后，倾去或吸除上清液，并将每份细胞沉淀重悬于1毫升基于氯化铵的红细胞裂解缓冲液中。室温孵育1分钟。接着，加入10毫升铺板培养基以终止红细胞裂解反应，然后按前述方法再次离心。去除上清液后，将骨髓重悬于5 mL铺板培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。每只小鼠的细胞产量约为5 × 10⁶至10 × 10⁶个细胞，但不同品系之间可能存在差异。向150 mm组织培养皿中加入30 mL铺板培养基，并补充新解冻的IL-3、IL-6和SCF。然后，向每块培养板中加入 4 × 10⁷ 个骨髓细胞，并在 37°C、5% 二氧化碳条件下过夜培养。本步骤由 Thomas Lee 示范。接下来，在含有 18 mL 铺板培养基的 150 mm 培养皿中接种 3 × 10⁶ 个逆转录病毒生产细胞。将逆转录病毒生产细胞孵育过夜。次日，使用10毫升注射器和0.45微米滤器收集并过滤生产板中的逆转录病毒上清液。小心地将移除的逆转录病毒上清液替换为18毫升新鲜铺板培养基。在过滤后的逆转录病毒上清液中加入 IL-3、IL-6、MSCF 和六亚甲基溴化铵。接着，开始收获骨髓细胞：首先将含有非贴壁细胞的培养基转移至无菌的 50 毫升离心管中，然后用 10 毫升 PBS 剧烈冲洗培养板，并将冲洗液加入该 50 毫升离心管中。在4摄氏度下以300 × g离心细胞10分钟之后，倾去上清液，然后将细胞重悬于1至3毫升的铺板培养基中。进行细胞计数后，将骨髓细胞加入汤中。每孔加入3毫升该细胞混合液，接种于6孔组织培养板中。用塑料膜包裹含有骨髓细胞的培养板，以最大限度减少气体交换，然后在 37 摄氏度下以 1,000 ×g 离心 60 分钟。离心完成后，移除塑料膜，将培养板放入 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育 24 小时。24 小时后，从病毒生产细胞系中收集新鲜的病毒上清液。此时，细胞应分布均匀，形态明显。接下来，小心吸出含有骨髓细胞的六孔板中每个孔的上层两毫升培养基，注意避免吸出通常集中在孔中央的骨髓细胞。向含有骨髓细胞的六孔板的每个孔中加入三毫升新鲜添加补剂的病毒上清液。用塑料膜包裹板子后，重复进行离心转导，然后将未包裹的板子放入组织培养孵育箱中。24小时后，即第3天，从各孔中移除并更换两毫升培养基。第四天，用 PBS 剧烈冲洗六孔板，收集骨髓细胞，并将细胞悬液收集至 50 毫升离心管中。在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟后，弃去上清液，用 1 毫升含 0.5% 热灭活 FBS 的 PBS 重悬骨髓细胞。将含有细胞的离心管置于冰上。随后，进行细胞计数，将骨髓细胞重悬于适量的含0.5%热灭活FBS的PBS中，以确保每只小鼠注射体积为200至300 µL、细胞数不少于2×10⁶个。最后，使用微量移液器取每种骨髓细胞条件下的10 µL样品，加入100 µL PBS中，用于通过流式细胞术分析转导效率。骨髓细胞的转导效率根据荧光标记蛋白ametrine进行分析。左图显示骨髓细胞培养五天后的前向散射和侧向散射。右图设门于非荧光阳性区域，包含转导后的骨髓细胞。成功的骨髓细胞转导将获得25%至70%的荧光阳性细胞比例。此图像显示了骨髓重建六周后外周血中的T细胞受体逆转录基因T细胞。在裂解红细胞后，对剩余细胞进行T细胞受体β染色。右侧面板展示了Ametrine表达和抗T细胞受体β的代表性分析结果。观看本视频后，您应能较好地掌握如何通过逆转录病毒转导并培养骨髓细胞以再生逆转录基因小鼠。

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

骨髓祖细胞的逆转录病毒转导到生成T细胞受体Retrogenic小鼠

该技术展示了一种高效制备编码人癌基因的复制缺陷型逆转录病毒储备液的方法，并可用于在小鼠模型中诱导骨髓增殖性疾病。...

通过瞬时转染293T细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。...

通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

我们介绍了一种利用逆转录病毒转导技术制备抗原特异性小鼠T细胞的实验方案...

小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

本文描述了一种在脾脏B淋巴细胞的ex...

重组逆转录病毒的制备及B细胞感染

本文描述了利用人源化小鼠产生和表征肿瘤特异性T细胞的方法。将人胸腺组织和基因修饰的人造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，从而重建工程化的人类免疫系统，以实现在体内研究抗肿瘤免疫应答。...

利用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

本文描述了建立转导-移植小鼠模型所使用的方法学。详细阐述了进行骨髓移植时应避免的技术性错误。读者应清楚理解高病毒滴度、转染/转导以及照射的重要性。...

骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型

当前方案结合了单细胞配对的人类 T 细胞受体 α 和 β 链测序与简化流程的逆转录病毒载体构建，该载体具有兼容性 体外 和 体内 TCR...

简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建 体外 和 在体 内 人类TCR的表达

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文介绍了一种用于逆转录病毒过表达及小鼠B-1a细胞过继转移的方法，以研究B-1a细胞在体内的迁移与定位。该方案可进一步扩展用于多种下游功能检测，包括定量分析供体B-1a细胞的定位，或在过继转移后检测供体细胞衍生的分泌因子。...

在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

我们介绍一种将引导RNA通过逆转录病毒转导至Cas9转基因小鼠原代T细胞的实验方案，为研究Th17细胞分化过程中的基因编辑提供了一种高效的替代方法。...

逆转录病毒CRISPR/Cas9介导的基因靶向技术用于体外研究Th17细胞分化

学习利用逆转录病毒转导骨髓祖细胞生成T细胞受体Retrogenic小鼠的方法，通过2A肽连接TCRα和β链，可在约七周内重建T细胞区室，用于筛选多种抗原特异性TCR并消除创始者效应。

逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

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