Name: 植物材料的快速高通量物种鉴定实时高分辨质谱法直接分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学习使用实时高分辨质谱结合多元统计分析快速鉴定植物物种的方法。该技术仅需极少样品制备即可在数分钟内获取数据，成功识别卡痛和曼陀罗等植物中的精神活性生物标志物。

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作者们衷心感谢纽约州立大学奥尔巴尼分校总统研究与奖学金计划基金对法医科学与网络安全项目（授予 RAM）的资助、美国国家科学基金会资助（资助号 #1310350）以及美国司法部国家司法研究所资助（资助号 #2015-DN-BX-K057）。我们同时感谢 Justine E. Giffen 拍摄植物材料的照片。

1. 植物材料的准备
<ol>
	<li>新鲜 kratom 叶片材料
	<ol>
		<li>使用6 mm直径的打孔器从 kratom 叶片材料中制备均匀的叶圆片 M. speciosa 植物。重复5次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>kratom 粉末提取
	<ol>
		<li>将5 ml乙醇与5 ml蒸馏水混合，制备1:1的溶剂混合液用于提取。</li>
		<li>在1.5 ml 微离心管中，将少量（约5 mg） kratom bali 粉末悬浮于1 ml 的1:1 EtOH:H₂O溶液中。2O溶剂混合物。重复5次。</li>
		<li>将 kratom bali 粉末提取物样品置于超声波水浴中，在室温下超声处理 30 分钟。</li>
		<li>在室温下以750 × g离心Kratom Bali粉末提取物样品2分钟。</li>
		<li>将溶剂从残留粉末中倾析出来，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>曼陀罗 种子制备
	<ol>
		<li>切片 D. stramonium 用剃刀刀片沿横切面将种子切成两半。重复此操作，共使用5粒不同的种子。</li>
		<li>重复上述步骤 D. inoxia 和 D. ferox 种子.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实时直接分析离子源参数
<ol>
	<li>气体加热器温度
	<ol>
		<li>将离子源的气体加热器温度设置为 350 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离子模式
	<ol>
		<li>以 250 V 的栅极电压在正离子模式下进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氦气流速
	<ol>
		<li>将氦气流速设置为 2.0 L/sec。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 飞行时间质谱仪参数
<ol>
	<li>孔电压
	<ol>
		<li>将孔1电压设为20 V，孔2电压设为5 V。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>环透镜电压与峰电压
	<ol>
		<li>调节环透镜电压至5 V，并将峰电压调整为600 V。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质谱采集
	<ol>
		<li>设置质谱采集速率为每秒1张谱图，质量范围为 m/z 60–800。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质谱仪分辨率
	<ol>
		<li>将质谱仪的分辨率设为6000 FWHM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 植物材料的分析
<ol>
	<li> kratom 叶片分析
	<ol>
		<li>在质谱仪控制软件中按下&#34;开始运行&#34;。用镊子将一小片植物材料悬挂在离子源与质谱仪进样口之间（距离进样口约 2 cm），直至获得谱图。使用不同的植物材料碎片重复此操作 5 次。</li>
		<li>使用聚乙二醇 600（PEG）校准谱图。
		<ol>
			<li>将熔点毛细管的封闭端浸入 PEG 标准品中。将涂有标准品的毛细管悬挂在离子源与质谱仪进样口之间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析完 PEG 标准品后，点击&#34;停止&#34;按钮以结束分析运行。</li>
		<li>在质谱仪控制软件中按下&#34;开始运行&#34;。用镊子将少量干燥的叶片材料悬挂在离子源与质谱仪进样口之间，直至获得谱图。每次使用新的植物材料，重复分析 5 次。</li>
		<li>使用 PEG 校准谱图。
		<ol>
			<li>将毛细管的封闭端浸入 PEG 标准品中。将涂有标准品的毛细管悬挂在离子源与质谱仪进样口之间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析完 PEG 标准品后，点击&#34;停止&#34;按钮以结束分析运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li> kratom 粉末分析
	<ol>
		<li>在质谱仪控制软件中按下&#34;开始运行&#34;。将熔点毛细管的封闭端浸入 kratom 粉末中。</li>
		<li>将涂有样品的毛细管悬挂在离子源与质谱仪进样口之间，直至获得谱图。每次使用新的毛细管，重复分析 5 次。</li>
		<li>使用 PEG 校准谱图。
		<ol>
			<li>将毛细管的封闭端浸入 PEG 标准品中。将涂有标准品的毛细管悬挂在离子源与质谱仪进样口之间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析完 PEG 标准品后，点击&#34;停止&#34;按钮以结束分析运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li> kratom 提取物分析
	<ol>
		<li>将毛细管的封闭端浸入提取物中。</li>
		<li>将毛细管插入质谱仪线性轨道上的 12 样品支架中。每次使用不同的提取物，重复操作 5 次。</li>
		<li>在质谱仪控制软件中按下&#34;开始运行&#34;。通过控制面板点击“>”按钮，以 1 mm/sec 的速度推动线性轨道穿过离子流，以采集谱图。</li>
		<li>使用 PEG 校准谱图。
		<ol>
			<li>将毛细管的封闭端浸入 PEG 标准品中。将涂有标准品的毛细管悬挂在离子源与质谱仪进样口之间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析完 PEG 标准品后，点击&#34;停止&#34;按钮以结束分析运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Datura 种子分析
	<ol>
		<li>在质谱仪控制软件中按下&#34;开始运行&#34;。用镊子将 Datura 种子的一半悬挂在离子源与质谱仪进样口之间，直至采集到谱图。确保切面朝向离子源。每次使用新的种子半片，重复操作 5 次。</li>
		<li>使用 PEG 校准谱图。
		<ol>
			<li>将毛细管的封闭端浸入 PEG 标准品中。将涂有标准品的毛细管悬挂在离子源与质谱仪进样口之间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析完 PEG 标准品后，点击&#34;停止&#34;按钮以结束分析运行。</li>
		<li>对每种 Datura 物种重复步骤 4.4.1–4.4.3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据处理
<ol>
	<li>转换数据文件
	<ol>
		<li>在数据处理软件中，选择文件，&#34;转换 DART 文件&#34;，并开启&#34;自动校准&#34;，以生成经过校准的数据文件。</li>
		<li>左键单击并围绕色谱图中的第一个峰绘制一个框，然后选择&#34;取平均值&#34;，以生成平均质谱图。</li>
		<li>右键单击并围绕未采集样品的区域绘制一个框，然后选择&#34;将整个框区域平均作为背景&#34;，以从平均质谱图中扣除背景信号。</li>
		<li>将质谱图保存为 .txt 文件。</li>
		<li>对色谱图中的每个峰重复步骤 5.1.1–5.1.4，为文件中的每个重复样本生成对应的平均质谱图。</li>
		<li>对每个采集的文件重复步骤 5.1.2–5.1.5。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>主成分分析
	<ol>
		<li>在光谱分析软件的“分类”部分（参见材料列表），在&#34;设置&#34;选项卡下，通过选择&#34;添加类别&#34;来创建用于数据处理的类别。</li>
		<li>通过选择&#34;添加文件&#34;导入数据的文本文件。</li>
		<li>通过选择文本文件并点击&#34;为所选文件设置类别&#34;，将数据文件分配至相应的植物类别。</li>
		<li>从训练集中选择用于区分的特征质荷比（feature masses），并将阈值百分比设为1%。</li>
		<li>设置质量容差（mmu）为10，并选择&#34;从数据文件构建向量&#34;。</li>
		<li>在&#34;计算&#34;部分，勾选3D PCA图选项以执行主成分分析，并选择&#34;计算&#34;。</li>
		<li>通过选择&#34;验证（耗时较长！）&#34;执行留一法交叉验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成热图
	<ol>
		<li>在光谱分析软件的“频率图”选项卡中，通过选择&#34;热图&#34;生成数据的热图。</li>
		<li>选择&#34;设置已保存数据的阈值&#34;，将丰度阈值设为1%。</li>
		<li>通过选择&#34;将热图保存到Excel&#34;将热图导出至电子表格。</li>
		<li>在电子表格程序中，将导出的热图另存为.txt文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>层次聚类分析
	<ol>
		<li>将热图以.txt文件形式导入Cluster 3.0软件。</li>
		<li>在Cluster 3.0的层次聚类选项卡中，在“基因与阵列”部分勾选&#34;聚类&#34;和&#34;计算权重&#34;。将截断值设为0.1，指数设为1。选择单连接聚类方法以执行分析。</li>
		<li>在Java Treeview中查看生成的.cdt数据文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

由于未列入管制的精神活性物质在市场推广、销售和使用方面急剧增加，识别植物来源的滥用药物变得愈发必要。2 传统上对植物材料进行鉴定的方法通常包括物理特征的表征，并结合色谱-质谱联用技术对化学成分进行分析。然而，这两种方法在高效分析方面均存在挑战。植物的物理特征在加工过程中常因干燥、粉碎或提取而遭到破坏，因此仅依靠物理特征往往难以区分不同类型的植物性精神活性产品。23 通过色谱-质谱联用技术进行分析可实现对植物基质中精神活性化合物的鉴定，但样品前处理和方法开发耗时且资源消耗大，而在许多法医化学实验室中，针对每一类或每一种植物来源的滥用药物建立新的分析方案并不现实。
实时直接分析-高分辨质谱法克服了其中一些挑战，因为诸如叶片、粉末、提取物和种子等复杂基质只需极少的样品前处理即可进行分析。尽管所采样品基质复杂，但由于质谱仪具有高灵敏度，精神活性成分仍可被轻松识别，即使其浓度低至纳克级别21。种子、叶片和粉末已被证实可直接通过实时直接分析-高分辨质谱法进行快速分析，其他多种类型的样品也可采用相同方式检测，包括薄层色谱板、货币、药片、花朵、固相微萃取（SPME）纤维，甚至昆虫蛹壳21-22。通过精确质量分析、元素组成确定和同位素匹配，无论目标化合物存在于叶片中、点样于薄层色谱板上，还是涂覆在毛细管表面，均可实现生物标志物及目标化合物的鉴定。
实时直接分析-高分辨质谱法可用于简化分析流程，因为实验间需要调整的参数极少。分析可在正离子模式或负离子模式下进行，在两种模式下均可检测分子量高达 3,000 amu 的分子。正离子模式下的电离通过活化水簇向分析物转移质子实现21，任何质子亲和力高于水的化合物均可被电离。本研究采用正离子模式，原因是生物碱具有较高的质子亲和力，易于通过质子化作用发生电离。负离子模式可用于成功检测烃类（作为 O2 加合物）21、爆炸物27 以及疟疾药物中的有机酸（如青蒿琥酯）28。由于该技术采用质子转移电离机制，且无法生成多电荷离子，实时直接分析-高分辨质谱法主要局限于分子量不超过 3,000 amu 的小分子分析。
除电离模式外，离子源温度也是一个重要参数，其适宜温度在很大程度上取决于待分析样品的性质。例如，在进行固相微萃取（SPME）纤维分析时，应采用较低的温度（约250 °C），以防止纤维涂层材料被破坏；而在进行氨基酸分析时，则应采用较高温度（约500 °C），以实现有效解吸及后续电离。本研究中植物材料的分析在350 °C下进行，该温度可在避免植物基质中化合物发生热解的同时，实现生物碱及其他目标化合物的电离。
实时直接分析-高分辨质谱分析不仅能够基于精确质量、元素组成测定和同位素匹配来鉴定植物材料中的精神活性成分，还能产生独特的化学指纹图谱，结合多元统计分析可用于物种鉴定，并获得高度可重复的结果，即使使用较小的数据集也能实现。多元统计分析已广泛应用于多种实时直接分析-高分辨质谱数据，包括来源于木材、蛹壳、种子、叶片材料以及生物柴油原料的数据，充分展示了该方法的通用性和可重复性。22-26 实时直接分析-高分辨质谱的高通量能力使其可在短时间内获取大量质谱数据，因此可轻松获得统计分析所需的大样本重复数据。对曼陀罗（Datura）和卡痛（Kratom）进行的实时直接分析-高分辨质谱分析所获得的数据集包含超过100个独立质谱，总耗时不足一小时。若采用气相色谱-质谱法（GC-MS），每个样品设定30分钟的程序升温进样，获取同等数量的质谱图则大约需要50小时，且尚未计入样品前处理步骤（如提取或衍生化）所需的额外时间。
主成分分析可用于根据所选特征质量的存在性和强度，突出不同植物物质集合之间的差异。统计分析处理可提供物种鉴定以及品种信息。其他统计分析方法，如层次聚类分析（HCA），也可在无需预先选择特征质量的情况下应用。全面化学指纹图谱的HCA结果表明，无监督的统计分析可成功应用于基于植物的滥用药物的物种鉴定。25
通过实时直接分析-高分辨质谱法对法医植物材料进行物种鉴别，该方法利用软电离质谱中精神活性化合物及其他生物标志物的鉴定，并结合多变量统计分析。应用两种类型的统计分析表明，不仅能够确定基于植物的滥用药物类别，还可根据实时直接分析-高分辨质谱所观察到的独特化学指纹，进一步判定其品种和物种。本文所述方法能够快速、高通量地鉴定精神活性物质，避免了传统分析方法中常见的技术难题，为法医实验室提供了一种无需耗费大量时间和资源进行方法开发即可表征和鉴定精神活性植物材料的手段。该方案可推广应用于多种其他植物来源材料的物种区分。22-26

数千年来，精神活性天然产物一直被用于萨满仪式，因其改变心智的特性而被滥用，并因其药用价值而被摄入。在这些植物及其相关植物性物质的原产地，其使用可能具有重要意义，并具有社会和经济价值。然而，近年来，由于通过互联网商务可轻易获得，这些&#34;天然&#34;药物的使用量急剧上升。人们普遍认为这些物质使用安全，加之对传统滥用药物和合成物质的持有与使用加强了管控，进一步推动了植物性毒品滥用的激增。仅通过外观通常难以区分这些产品与无害的植物材料，因此人们迫切希望开发可用于识别这些产品的检测方法。然而，传统的植物物种鉴定分析方法耗时较长，且实际操作中不具可行性。此外，方法开发过程本身也耗费大量时间和资源。这些因素导致相关立法在遏制此类物质滥用方面的进展远远落后于滥用率上升的速度。因此，目前极少有法律对许多此类天然精神活性物质的生产、制造、销售和消费进行规范，导致使用者可获得数百种滥用植物，其形式多达数千种。1,2
两种此类滥用的植物性药物是 Mitragyna speciosa 通常称为卡痛树，以及来自该属的植物 曼陀罗 属，即 曼陀罗（D. stramonium），D. ferox 和 D. inoxia kratom与 曼陀罗 在美国未被列入管制，但美国药品执法局已将两者列为关注药物。3,4 kratom 的特征是含有精神活性化合物 mitragynine 和 7-hydroxymitragynine，以及其他非精神活性生物碱，包括 mitraphylline、paynantheine、corynoxeine 和 rhynchophylline。4-8 精神活性特性 曼陀罗 其药效归因于阿托品和东莨菪碱，但已在这些植物中鉴定出多种其他托烷类生物碱。9-12 kratom 和 曼陀罗 已牵涉多起中毒和死亡事件，且随着此类产品的滥用日益严重，在法医学和毒理学领域中对其鉴定的需求也不断增加。13-16
总体而言，用于法医毒品物质分析的传统方法（如显色试验、显微镜检查以及拉曼光谱和红外光谱）通常仅具有初步筛查性质，用于排除或纳入可疑物质。而联用技术，如气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS），则属于确证性分析方法，其依据是将检测到的分析物谱图与缉获毒品分析科学工作组（SWGDRUG）数据库中的标准谱图进行比对17。在分析前需进行样品预处理，包括研磨、提取、衍生化和蒸发等步骤，这些操作可能延长检测时间数小时，并可能导致样品污染或改变9,11,18,19，使得植物类毒品的分析相较于可卡因或海洛因等其他传统滥用药物更为复杂。此外，每种目标物质均需开发独立的色谱分析程序，这使得为每一种或每一变种的植物源性滥用药物建立标准化操作规程在常规案件检测中极不现实。
实时直接分析-高分辨质谱是一种常温电离质谱技术，可克服传统分析方法中的一些挑战。气体、液体、固体、粉末、薄层色谱板和植物材料均可通过实时直接分析-高分辨质谱进行直接分析，且可在复杂基质中轻松检测极性和非极性化合物。20-22 此外，研究显示，通过实时直接分析-高分辨质谱可快速鉴定植物材料中的精神活性化合物，并可通过质谱数据的统计处理获取物种特异性信息。22-26
本文展示了实时直接分析-高分辨质谱法可用于快速检测多种植物材料（例如植物、粉末、提取物和种子）中的精神活性成分，并能够以快速、高通量的方式确定植物源性产品的物种和品种。本文还报道了无需样品前处理步骤或长时间色谱分析即可对法医学相关的植物材料进行分析，同时实现植物物种鉴定。

<table><tbody><tr><td>AccuTOF 质谱仪</td><td>JEOL USA, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DART-SVP 离子源</td><td>IonSense, Inc.</td><td>DART-SVP</td><td></td></tr><tr><td>线性导轨系统</td><td>IonSense, Inc.</td><td>HW-10029</td><td></td></tr><tr><td>打孔器（6 mm）</td><td>Swingline</td><td>A7074005</td><td></td></tr><tr><td>一品脱紧凑型超声波清洗机</td><td>科尔-帕尔默</td><td>EQ-08849-00</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R 离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100676</td><td></td></tr><tr><td>#9 不锈钢刀片</td><td>Stanley</td><td>11-515</td><td></td></tr><tr><td>Dip-it Tip Holder</td><td>IonSense, Inc.</td><td>SCT-70003</td><td></td></tr><tr><td>蘸取式吸头</td><td>IonSense, Inc.</td><td>DPT-110</td><td></td></tr><tr><td>熔点毛细管</td><td>Krackeler Scientific</td><td>1-9530-3</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（600）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81180</td><td></td></tr><tr><td>Rifat Kratom 活体植株</td><td>World Seed Supply 鹿角草收藏系列</td><td>LIVEKRATOMPLANT</td><td></td></tr><tr><td>巴厘 kratom 干叶</td><td>kratom 王</td><td>OZKRAPCOM</td><td></td></tr><tr><td>巴厘 kratom 粉末</td><td>“ kratom 王”</td><td>OZKRAPCOMPOW</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;曼陀罗（Datura stramonium）&lt;/em&gt; 种子</td><td>Horizon Herbs LLC</td><td>PDATUJ</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;曼陀罗&lt;/em&gt; 种子</td><td>Horizon Herbs LLC</td><td>PDATUM</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Datura ferox&lt;/em&gt; 种子</td><td>乔治亚·维恩斯</td><td>255/737</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水</td><td>Krackeler Scientific</td><td>1328-E402-4L</td><td></td></tr><tr><td>Mass Mountaineer 质谱分析软件</td><td>mass-spec-software.com</td><td>MM-20030-PCA-DVD</td><td></td></tr><tr><td>TSSPro3 数据处理/数据简化软件</td><td>Shrader 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cluster 3.0</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm</td><td>开源软件</td><td></td></tr><tr><td>Java 树状图浏览器</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net/</td><td></td><td>开源软件</td></tr></tbody></table>

利用实时直接分析高分辨质谱法快速高通量鉴定植物材料物种

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

我们证明，实时直接分析-高分辨质谱法可用于生成植物材料的质谱图谱，且这些化学指纹可用于植物物种鉴定。该方法能够快速、高通量地获取质谱数据，无需进行样品提取、衍生化或pH调节等步骤。该技术避免了传统方法所面临的挑战，例如色谱分析耗时较长以及资源消耗较大的问题。实时直接分析-高分辨质谱法的高通量能力，结合对数据进行的多变量统计分析处理，不仅可实现植物的分类表征，还能提供物种及品种水平的信息。本文以两种精神活性植物产品为例进行演示：Mitragyna speciosa（ kratom ）和 Datura（曼陀罗），将其进行实时直接分析-高分辨质谱检测，随后对所得质谱数据进行统计分析处理。这些工具的联合应用使得植物材料能够在品种和物种水平上被快速鉴定。

代表性软电离正离子模式实时直接分析-高分辨质谱法对 kratom 产品所得数据 曼陀罗 种子如图所示 图2 和 3. 从前分离得到的各种化合物 M. speciosa，包括 kratom 碱（C23H30N2O4 + H+, m/z 399.2284）和7-羟基帽柱木碱（C23H30N2O5 + H+, m/z 415.2233）在全部四个样品中均被检出，相应的质谱数据如表所示 表1.4-8 代表性 曼陀罗属 数据以……形式展示 图3 以及标志性生物标志物，包括阿托品（C17H23一氧化氮3 + H+, m/z 290.1756) 和东莨菪碱（C17H21一氧化氮4 + H+, m/z 304.1549）在三种物种中被检测到。与之相关的质谱测量数据 图3 呈现在 表2.9-12 通过元素组成测定、同位素匹配以及与文献报道的比对，确认了化合物的结构。23-24
实时直接分析-高分辨质谱法对 kratom 及其相关物质的热图谱渲染 曼陀罗属 在……中展示 图 4. 所展示的数据采用主成分分析（PCA）对两类滥用植物性药物进行区分图5）。PCA 图基于十个特征质量数（列于 表3），蓝色圆圈代表 kratom 数据，红色方块代表 曼陀罗 数据。所选择的特征质荷比对应于存在的多种生物碱 曼陀罗属 或 Mitragyna 包括精神活性化合物阿托品、东莨菪碱、帽柱木碱和7-羟基帽柱木碱。23-24 三个主成分解释了75.26%的方差，留一法交叉验证（LOOCV）准确率为100%。主成分分析图清晰显示， kratom 数据与 曼陀罗属 数据彼此之间得到了良好的分辨。PCA分析还揭示了不同种类的 kratom 以及不同物种的 曼陀罗属 可以相互识别并区分开来（图6）。使用三个主成分进行留一交叉验证（LOOCV）的准确率达到94.29%，这三个主成分共解释了75.26%的方差。两种 kratom（蓝色圆圈代表 Bali，红色方块代表 Rifat）聚为一类，表明它们同属一个物种 M. speciosa，但彼此之间可被区分开来，表明它们代表不同的变种。此外， 曼陀罗 物种聚集成组，并与其余部分分离 M. speciosa 数据，但每一种单独的物种 曼陀罗 (D. inoxia 绿色三角形中 D. stramonium 在粉红色方框中和 D. ferox 在青绿色圆圈中的数据点明显区分开来。尽管存在一个数据点 D. stramonium 看似异常值，该种子仍被正确分类为 D. stramonium 且不 D. inoxia 使用 PCA. 最重要的是，种子颜色之间的差异 D. stramonium 和 D. inoxia 确认它们是不同物种，且有问题的数据点不可能 D. inoxia.
层次聚类（图7）在未预先选择特征质量的情况下进行。相反，对整个光谱数据集组进行了分析，其质量范围为 m/z 60-800 被导入开源基因组聚类软件，并基于该数据生成了系统发育树。层次聚类分析（HCA）的结果也仅依据实时高分辨质谱数据的直接分析，揭示了植物类滥用药物在类别、物种及品种水平上的区分，并与主成分分析（PCA）的结果一致。这两类植物源性滥用药物为卡痛（Kratom）和 曼陀罗，被分离开来，各自形成树状图中的独立分支。此外，Kratom 类别中的 Rifat 和 Bali 品种各自进一步分离为独立的亚分支。同样地， D. inoxia, D. ferox 和 D. stramonium 按物种划分为各自的进化枝 曼陀罗属 类别。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig1.jpg" /> 
图1. M. speciosa （卡痛）产品与Datura spp. 种子的图像。 a：巴厘卡痛干叶；b：巴厘卡痛粉末；c：Rifat卡痛活体植株；d：D. stramonium 种子；e：D. inoxia 种子；f：D. ferox 种子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig2.jpg" /> 
图2. 实时直接分析&#160;时间-高&#160;分辨质谱正离子谱 M. speciosa （ kratom ）产品 a： Rifat 新鲜叶片； b：巴厘干叶； c：巴厘粉； d：巴厘粉提取物。与这些谱图相关的质谱数据如下所示。 表1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig3.jpg" /> 
图3. 直接分析 真实&#160;时间-高&#160;分辨率&#160;质谱正离子谱图 曼陀罗 spp. 种子 a: D. ferox; b: D. inoxia; c: D. stramonium 这些谱图对应的质量测量数据如下所示 表 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig4.jpg" /> 
图4. Kratom 和 Datura 植物材料的实时直接分析-高分辨质谱图谱的热图呈现。 高强度峰以深红色显示，强度较低的峰则以较浅的色阶表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig5.jpg" /> 
图5. 基于实时直接分析高分辨质谱数据构建的卡痛（Kratom）和Datura（曼陀罗）产品主成分分析（PCA）图。 前三个主成分（PCs）解释了75.26%的变异，留一法交叉验证（LOOCV）准确率为100%。用于PCA分析的特征质量数列于表3中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图6" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig6.jpg" /> 
图6. 利用实时直接分析-高分辨质谱数据对 kratom 与Datura产品进行主成分分析（PCA）的散点图。 分类依据为植物材料的种类（kratom）或物种（Datura）。前三个主成分（PCs）解释了75.26%的变异，留一法交叉验证（LOOCV）准确率为94.29%。用于PCA分析的特征质量列于表3中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig7.jpg" /> 
图7. 利用实时直接分析-高分辨质谱法分析 kratom 所得数据进行层级聚类分析的结果 曼陀罗 植物材料 两种植物类别在树状图中明显分离为两个不同的分支（用蓝色和红色括号分别标示为Kratom和 曼陀罗属，分别）。 曼陀罗 不同种子种类彼此得以区分（分别以绿色、青绿色和粉色虚线框标示） D. inoxia, D. ferox 和 D. stramonium （分别用红色和蓝色虚线框标示Rifat和Bali品种）。 kratom植物材料按品种分类（Rifat和Bali品种分别显示在红色和蓝色虚线框中）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54197/54197tbl1.jpg" /> 
表1. 与图2中所示的 kratom 产品软电离质谱相关的质量测量数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197tbl1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a>
<img alt="表2" src="/files/ftp_upload/54197/54197tbl2.jpg" /> 
表2. 与图3中展示的曼陀罗（Datura）种子软电离质谱图相关的质量测定数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197tbl2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该表格的放大版本。</a>
<img alt="表 3" src="/files/ftp_upload/54197/54197tbl3.jpg" /> 
表 3. 用于绘制 kratom 与 Datura 产品主成分分析图（见图 5 和 图 6）的特征质量。

本文介绍了一种通过实时直接分析-高分辨质谱法结合多变量统计分析对植物材料进行物种鉴定的方法。

我们证明，实时直接分析-高分辨质谱法可用于获取植物材料的质谱图谱，……

本实验的总体目标是利用常压电离质谱法鉴定植物材料的物种。结合多变量统计分析，该方法有助于解答化学与生物学领域的关键问题，例如，根据植物的化学指纹确定其所归属的植物种类。此外，您还可以获得有关植物组织中生物活性分子的信息。该技术的主要优势在于，分析所需的样品前处理步骤极少，且数据可在几分钟内获取。该方法也可用于解决化学领域的其他问题。例如，在有机合成中追踪反应中间体和产物、分析不同类型的复杂基质以及进行顶空分析。为制备 kratom 新鲜叶片材料，使用直径为六毫米的打孔器，从 M. speciosa 植物叶片上制备均一的 kratom 叶片圆片。重复此过程五次。在1.5毫升微量离心管中进行 kratom 粉末的提取，加入少量 kratom Bali 粉末，并用1毫升乙醇与水按1:1配制的溶剂混合液悬浮。重复此步骤五次。将 kratom Bali 粉末提取样品置于超声水浴中，在室温下超声处理30分钟。然后，在室温下以750 × g离心 kratom Bali 粉末提取物样品2分钟。倾去残余粉末中的溶剂，用于后续分析。制备曼陀罗种子时，使用剃刀刀片沿横切面将 D.stramonium 种子切成两半。使用五种不同的种子重复此过程。按照文本方案中所述设置质谱仪或质谱参数后，在质谱仪控制软件中点击“开始运行”，以分析 kratom 叶片。用镊子将 kratom 植物材料的叶渣悬置于离子源与质谱仪进样口之间，直至获得质谱图。使用不同的植物材料重复此步骤五次。为使用聚乙二醇 600（简称 PEG）校准光谱，将熔点毛细管的封闭端浸入 PEG 标准品中。将涂覆后的毛细管悬置于离子源与质谱仪进样口之间。单击停止按钮以结束分析运行。在质谱仪控制软件中按“开始运行”以分析干燥的 kratom 叶片。用镊子将少量干燥的叶片材料悬置于离子源与质谱仪进样口之间，直至获得谱图。重复采集五次，每次分析新的植物材料。使用PEG对谱图进行校准，然后选择停止按钮以结束分析运行。要分析 kratom 粉末，请在质谱仪控制软件中点击开始运行。将熔点毛细管的封闭端浸入 kratom 粉末中。将涂有样品的毛细管置于离子源与质谱仪进样口之间，直至获得质谱图。每次使用新的毛细管重复分析五次，随后进行聚乙二醇（PEG）校准。为了分析 kratom 提取物，将毛细管的一端浸入提取物中。将毛细管悬置于质谱仪线性轨道上的12个样品支架中。每次使用不同的提取物，重复该步骤五次。在质谱仪控制软件中点击“开始运行”。使用控制面板，选择前进按钮，以每秒一毫米的速度推动线性轨道穿过离子流，以采集谱图。使用聚乙二醇（PEG）对谱图进行校准，并点击“停止”以结束分析运行。为分析曼陀罗种子，请在质谱仪控制软件中点击“开始运行”。用镊子将曼陀罗种子的一半悬置于离子源与质谱仪进样口之间，直至采集到谱图。确保切面朝向离子源。重复此步骤五次，每次分析一个新的种子半粒。使用 PEG 校准完成分析，然后按停止以结束分析运行。按照文本方案中所述进行数据处理后，转到光谱分析软件的“设置”选项卡下的“分类”部分，通过选择“添加类别”创建数据处理类别，进而执行主成分分析。通过选择“添加文件”来导入数据的文本文件。选择文本文件并为所选文件设置类别，以将数据文件分配给相应的植物类别。从训练集中选择用于区分的质谱特征峰，并将阈值百分比设为1%。接下来，设置质量容差为10，并选择从数据文件构建向量。在“计算”部分，勾选“3D PCA 图”复选框以进行主成分分析，并点击“计算”。通过选择“验证”执行留一法交叉验证。然后，转至光谱分析软件的“频谱图”选项卡并选择“热图”，以生成数据的热图。选择“阈值保存数据”以将丰度阈值设置为1%。通过选择“将热图保存到Excel”将热图导出至电子表格。在电子表格程序中，将导出的热图另存为文本文件。然后，将该热图作为文本文件导入Cluster 3.0软件，以进行层次聚类分析。在 Cluster 3.0 的“Hierarchical”选项卡中，于“Genes and Arrays”复选框下勾选“Cluster”和“Calculate weights”。将截断值设为 0.1，指数设为 1。选择单连接聚类以进行分析。最后，在 Java 树状视图中查看生成的 cdt 数据文件。此处展示了 kratom 产品的代表性软电离正离子模式质谱图。已鉴定出先前从 M. speciosa 中分离的化合物。包括精神活性生物标志物：帽柱木碱（Mitragynin）和7-羟基帽柱木碱（7-Hydroxy-mitragynine）。此处展示了曼陀罗种子的代表性软电离正离子模式质谱图。鉴定出先前从曼陀罗中分离出的化合物，包括精神活性生物标志物阿托品（Atropine）和东莨菪碱（Scopolamine）。此处展示了质谱数据的热图渲染结果。图中显示了 kratom 与 datura 数据的主成分分析（PCA）图。PCA 图清晰表明，kratom 数据与 datura 数据彼此之间具有良好的分离度。PCA分析还表明，可以识别并区分不同种类的 kratom 以及不同物种的曼陀罗。图中显示了 kratom 和曼陀罗质谱数据的层次聚类分析（HCA）结果。HCA分析结果表明，仅基于实时直接分析高分辨质谱法获得的数据，即可实现分类、物种及品种的区分，并证实了PCA分析的结果。一旦掌握，只要操作得当，根据样本数量的多少，该技术可在不到一小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用直接分析与实时质谱技术来分析复杂样品，并通过数据的统计分析处理获得物种信息。在实施该操作过程中，重要的是将样品在离子流中保持适当的时间，以获取样品完整的质谱图谱。该技术已使植物组学、法医学、有机化学和分析化学等多个领域的研究人员能够探索植物释放的挥发性物质，鉴定可引发药物反应的合法替代物，并实时监测反应产物。

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我们提出了一种基于质谱（MS）/质谱（MS）的快速标注与分类莨菪烷类生物碱的方法，该方法既可用于含莨菪烷样品的初步去重，也可用于发现需分离的新生物碱。...

液相色谱-串联质谱在天然产物研究中的应用：以托烷生物碱为例

学习使用实时高分辨质谱结合多元统计分析快速鉴定植物物种的方法。该技术仅需极少样品制备即可在数分钟内获取数据，成功识别卡痛和曼陀罗等植物中的精神活性生物标志物。

利用实时直接分析高分辨质谱法快速高通量鉴定植物材料物种

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