植物材料的快速高通量物种鉴定实时高分辨质谱法直接分析

本实验的总体目标是使用环境电离质谱法鉴定植物材料的种类。与多变量统计分析相结合。这种方法可以帮助回答化学和生物学领域的关键问题，例如，根据化学指纹图谱，您拥有的植物种类。

您还可以获得有关植物组织中生物活性分子的信息。该技术的主要优点是分析所需的样品制备非常少，并且可以在几分钟内获得数据。这种方法也可以用于解决化学中的其他问题。

例如，在有机合成中跟踪反应中间体和产物，分析不同类型的复杂基质，并进行顶空分析。为了准备卡痛叶新鲜叶材料，使用直径为 6 毫米的打孔器从 M.speciosa 植物中产生均匀的卡痛叶材料。重复此过程 5 次。

要提取卡痛叶粉末，请在 1.5 毫升微量离心管中工作，并将少量 kratom Bali 粉末悬浮在一毫升一对一乙醇与水溶剂混合物中。重复此过程 5 次。在环境温度下，在超声波浴中对 kratom Bali 粉末提取物样品进行超声处理 30 分钟。

然后，在环境温度下以 750 x G 离心 kratom Bali 粉末提取物样品 2 分钟。从残留粉末中倒出溶剂，以便进行后续分析。为了准备曼陀罗种子，用剃须刀片在横向平面上将 D.stramonium 种子切成两半。

使用五个不同的种子重复此过程。按照文本协议中的说明设置质谱仪或 MS 参数后，在质谱仪控制软件中按开始运行以分析卡痛叶。用镊子将卡痛叶植物材料的乍得悬浮在离子源和质谱仪入口之间，直到获得光谱。

用单独的植物材料重复此过程五次。为了校准聚乙二醇 600 （简称 PEG）的谱图，将熔点毛细管的封闭端浸入 PEG 标准品中。将涂层毛细管悬浮在离子源和质谱仪入口之间。

选择 Stop （停止） 按钮结束分析运行。在质谱仪控制软件中按 Start Run 以分析干燥的 kratom 叶。用镊子将少量干叶材料悬浮在离子源和质谱仪入口之间，直到获得光谱。

每次重复采集 5 次，分析新的植物材料。像以前一样使用 PEG 校准谱图，然后选择 Stop 按钮结束分析运行。要分析 kratom 粉末，请在质谱仪控制软件中按 Start Run。

将熔点毛细管的封闭端浸入 kratom 粉末中。将涂层毛细管悬浮在离子源和质谱仪入口之间，直到获得谱图。每次使用新的毛细管重复分析五次，然后进行 PEG 校准。

要分析 kratom 提取物，请将毛细管的末端浸入提取物中。将毛细管悬挂在质谱仪线性导轨上的 12 样品架中。每次使用不同的提取物重复五次。

在质谱仪控制软件中按 Start Run。使用控制面板，选择向前推进按钮，以每秒 1 毫米的速率将线性轨道推进通过离子流以收集光谱。像以前一样用 PEG 校准谱图，然后按 Stop 结束分析运行。

要分析曼陀罗种子，请按质谱仪控制软件中的开始运行。用镊子将曼陀罗种子的一半悬浮在离子源和质谱仪入口之间，直到收集到光谱。确保切割面朝向离子源。

重复此过程五次，每次分析新的种子一半。使用 PEG 校准完成分析，然后按 Stop 结束分析运行。按照文本协议中的说明执行数据处理后，导航到 Setup 选项卡下光谱分析软件的 Classify 部分，然后通过选择 Add Class 创建用于数据处理的类来执行主成分分析。

通过选择 Add Files.通过选择文本文件和设置选定文件的类，将数据文件分配给适当的工厂类。从训练集中选择用于区分 MS 的特征质量数，并将阈值百分比设置为 1%接下来，将质量数容差设置为 10，然后选择 Build Vectors from Data Files。

在 Compute （计算） 部分中，通过选中 3D PCA Graph （3D PCA 图形） 复选框并选择 Calculate 来执行主成分分析。通过选择 Validate （验证） 来执行留一法交叉验证。然后，通过导航到频谱分析软件的 Frequency Plot 选项卡并选择 Heat Map 来生成数据的热图。

选择 阈值保存数据 将丰度阈值设置为 1%通过选择 将热图保存到 Excel，将热图导出到电子表格。在电子表格程序中，将导出的热图另存为文本文件。然后，要执行分层聚类分析，请将热图作为文本文件导入 Cluster 3.0 软件。

在 Cluster 3.0 的 Hierarchical （分层） 选项卡中，在 Genes and Arrays （基因和数组） 下的复选框下，Cluster （集群） 和 Calculate weight（计算权重）。将截止值设置为 0.1，将指数设置为 1。选择 single linkage clustering （单链接聚类） 以执行分析。

最后，在 Java 树视图中查看生成的 cdt 数据文件。此处显示了 kratom 产品的代表性软电离正离子模式谱图。鉴定了先前从 M.speciosa 中分离的化合物。

包括精神活性生物标志物 Mitragynin 和 7-Hydroxy-mitragynine。这里显示了曼陀罗种子的代表性软电离正离子模式光谱。鉴定出先前从曼陀罗中分离的化合物，包括精神活性生物标志物阿托品和东莨菪碱。

质谱数据的热图渲染图如下所示。显示了 kratom 和曼陀罗数据的主成分分析或 PCA 图。PCA 图清楚地表明 kratom 数据和曼陀罗数据彼此之间有很好的分辨率。

PCA 分析还显示，可以识别和区分 kratom 的各个品种和不同种类的曼陀罗。显示了 kratom 和 datura 质谱数据的分层聚类分析或 HCA 结果。HCA 的结果仅基于实时高分辨率质谱衍生数据中的直接分析揭示了类别、物种和品种的差异，并证实了 PCA 分析的结果。

一旦掌握，这项技术可以在不到一个小时的时间内完成，具体取决于您拥有的样本数量（如果作得当）。观看此视频后，您应该对如何使用直接分析和实时质谱法来分析复杂样品以及使用统计分析处理数据来获取物种信息有很好的了解。在尝试此过程时，重要的是将样品在离子流中保持适当的时间，以获得样品的完整质谱。

这项技术使包括植物组学、法医学、有机化学和分析化学在内的许多领域的研究人员能够探索对植物排放的挥发物的分析，确定引出药物的合法替代品，并实时监测反应产物。