Name: 聚电解质复合物肝素结合域成骨生长因子交货 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学习利用聚电解质复合物包裹肝素结合域成骨生长因子，实现可控释放并显著降低BMP-2用量。该方法无需有机溶剂，可维持生长因子生物活性，为脊柱融合等骨科组织工程应用提供高效递送策略。

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这些研究由新加坡国家医学研究理事会临床科学家个人研究基金（CS-IRG）NMRC/CIRG/1372/2013 和 NMRC EDG/0022/2008 资助。

1. 海藻酸钠溶液的制备
<ol>
	<li>将200 mg非辐照海藻酸钠或400 mg 8 MRad辐照海藻酸钠溶于10 ml双蒸水中，非辐照海藻酸钠溶液摇晃1小时，辐照海藻酸钠溶液摇晃15分钟。将海藻酸钠溶液在4 °C下静置过夜。在制备海藻酸微珠前，使用无菌0.2 µm注射器滤器过滤海藻酸钠溶液。</li>
</ol>
2. 藻酸盐微珠的制备
<ol>
	<li>用70%乙醇对静电微珠发生器和注射泵进行消毒，并将其置于II级生物安全柜中（图1）。</li>
	<li>在微珠发生器内放置一个带有磁力搅拌子的玻璃烧杯。</li>
	<li>将微珠发生器的臂电极设置在烧杯上方9 cm处。</li>
	<li>将微珠发生器的电极电缆连接至臂电极的滚花螺钉2，并向烧杯中倒入80 ml的SrCl2溶液。</li>
	<li>将5 ml经过0.2 µm滤膜过滤的海藻酸钠溶液装入注射器和橡胶管中。将橡胶管连接至臂电极后，以5 ml/hr的流速启动注射泵运行2分钟，以排出管路中的空气并将海藻酸钠溶液输送至喷嘴末端。随后关闭注射泵。</li>
	<li>接着，先开启包埋装置，再启动注射泵以开始微珠的生成。将海藻酸钠的流速设定为5 ml/hr，包埋装置的电压设定为5.8 kV。弃去前两分钟内（或注射器中最初泵出的0.5 ml海藻酸钠溶液）生成的微珠，因为这些微珠通常尺寸和形状不规则。</li>
	<li>将后续生成的微珠收集至0.2 M氯化锶溶液中。在泵入预定体积的海藻酸钠溶液后，依次关闭注射泵和包埋装置（顺序不可颠倒）。重复上述步骤以制备后续批次的微珠。全部完成后，先关闭注射泵，再关闭包埋装置。</li>
	<li>将微珠置于20 ml的0.2 M氯化锶溶液中，4 °C下保存过夜，以完成交联并稳定凝胶结构。</li>
</ol>
3. 藻酸盐微珠的尺寸测量
<ol>
	<li>用塑料移液管收集 0.5 ml 海藻酸盐微珠，置于玻璃载玻片上。在光学显微镜下以 10 倍物镜观察微珠。使用显微镜 CCD 相机拍摄 10 张微珠图像。以 2,048 × 1,536 分辨率将图像保存为带比例尺（500 µm）的 TIFF 格式。</li>
	<li>使用 ImageJ 中的长度测量工具，测量微珠和比例尺的尺寸（图 2）。将微珠长度从像素单位转换为微米单位。
	<ol>
		<li>点击直线工具，在海藻酸盐微珠的中点画一条线。</li>
		<li>点击菜单栏中的“Analyze”（分析），选择“Measure”（测量），弹出窗口将出现。</li>
		<li>重复步骤 3.2.1–3.2.2，测量图像中所有海藻酸盐微珠的尺寸，并测量图像中的比例尺长度。</li>
		<li>使用以下公式将海藻酸盐微珠的直径转换为实际长度：海藻酸盐微珠长度 / 比例尺长度 × 500 µm。例如，1.420（ImageJ 测得的直径）/ 2.657（ImageJ 测得的比例尺长度）× 500 µm = 267 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 100 个微珠的平均尺寸（均值 ± 标准差）作为每批微珠的代表性尺寸。</li>
</ol>
4. 灭菌
<ol>
	<li>使用 100 µm 尼龙滤网收集微珠，并用双蒸水清洗微珠。</li>
	<li>用刮勺将由 0.1 ml 海藻酸盐溶液制成的全部微珠转移至 2 ml 微离心管中，并用纱布覆盖以防止干燥。</li>
	<li>最后，采用液体模式（115 °C，15 分钟）高压灭菌或按照制造商说明书对微珠进行灭菌处理。向灭菌室中加入 1.5 L 蒸馏水以防止微珠干燥。</li>
</ol>
5. 鱼精蛋白和肝素包被
<ol>
	<li>在BSL-2生物安全柜内，将无菌微珠与1 ml浓度为2 mg/ml的鱼精蛋白溶液（使用0.2 µm注射器滤器灭菌）在室温下孵育1小时。</li>
	<li>微珠孵育1小时后（步骤5.1），取150 µl鱼精蛋白溶液用于微量双辛酮酸（microBCA）检测（第6节）。</li>
	<li>用双蒸水将包被鱼精蛋白的微珠清洗两次。在室温下，使用台式离心机以200 × g离心3分钟。离心后，用注射器吸除上清液。</li>
	<li>将包被鱼精蛋白的微珠与1 ml浓度为0.5 mg/ml的肝素溶液（使用0.2 µm注射器滤器灭菌）孵育30分钟，以形成聚电解质复合物（PEC）。</li>
	<li>包被鱼精蛋白的微珠孵育30分钟后（步骤5.4），取400 µl肝素溶液用于测定肝素含量（第7节）。</li>
	<li>孵育结束后，用双蒸水清洗两次，以去除PEC上未结合的肝素。</li>
</ol>
6. 鱼精蛋白含量
<ol>
	<li>根据制造商说明书进行微BCA检测。简言之，将150 µl 鱼精蛋白溶液（与微珠孵育前、后收集的）加入96孔板中，再加入150 µl 微BCA工作液。</li>
	<li>使用浓度为0、0.5、1、2、5、10、20、40和200 µg/ml的白蛋白溶液作为校准标准品。</li>
	<li>在60 °C下孵育混合物60分钟，用分光光度计在562 nm处测定吸光度。</li>
	<li>根据制造商说明书，利用标准曲线确定各未知样品的鱼精蛋白浓度。</li>
	<li>通过从孵育前包被溶液中的总鱼精蛋白量中减去孵育后包被溶液中残留的鱼精蛋白量，计算微珠上的鱼精蛋白含量。</li>
</ol>
7. 肝素含量
<ol>
	<li>通过将4 mg甲苯胺蓝和20 mg氯化钠溶解于10 ml 0.01 N盐酸中，制备工作溶液。</li>
	<li>按2:3的比例向工作溶液中加入400 µl样品（来自步骤5.5），涡旋混匀30秒。</li>
	<li>加入600 µl正己烷（与工作试剂溶液体积相等），涡旋混合物以萃取甲苯胺蓝-肝素复合物。</li>
	<li>相分离后，用注射器吸取200 µl水相。</li>
	<li>使用分光光度计在631 nm处测定水相中未被萃取的甲苯胺蓝含量。</li>
	<li>配制浓度为0–20 µg/ml的肝素标准溶液。</li>
	<li>以各肝素标准品在631 nm处的吸光度值对肝素浓度（µg/ml）作图，绘制标准曲线，并利用该曲线确定各样品的肝素浓度。</li>
</ol>
8. 逐层结构的共聚焦图像
<ol>
	<li>根据制造商提供的技术说明书，制备鱼精蛋白、肝素和 NELL-1/BMP-2 的荧光类似物：CF-405 鱼精蛋白（蓝色）、CF 594 肝素（红色）以及 FITC 标记的 NELL-1/FITC 标记的（绿色）BMP-2 + 肝素 + 鱼精蛋白。</li>
	<li>采用 5.3–5.6 节所述的包被方法，用 300 µl 荧光类似物对 100 µg 微珠进行包被：CF-405 鱼精蛋白（蓝色）（2 mg/ml，孵育 1 小时）、CF 594 肝素（红色）（0.5 mg/ml，孵育 30 分钟）和 FITC 标记的 NELL-1/FITC 标记的（绿色）BMP-2（1.5 mg/ml，过夜孵育）。用蒸馏水洗涤微珠两次，以去除未结合的荧光鱼精蛋白、肝素和 NELL-1/BMP-2。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜在 10X 放大倍数下观察逐层结构（图 3）。7</li>
</ol>
9. BMP-2 与 NELL-1 的摄取与释放
<ol>
	<li>将 13.3 µl 的 1.5 mg/ml BMP-2 或 NELL-1 溶液加载到 100 µg 的 PEC 上。在 4 °C、30 rpm 振荡条件下孵育 PEC 10 小时。</li>
	<li>将微珠浸入 1 ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在 37 °C 下以恒定振荡（30 rpm）进行处理。</li>
	<li>在第 1、3、6、10 和 14 天时，收集 1 ml 上清液，并替换为 1 ml 新鲜 PBS。</li>
	<li>根据制造商说明书，采用 ELISA 方法评估 BMP-2 的结合与释放效率；根据制造商说明书，采用羧基苯并喹啉-2-甲醛（CBQCA）蛋白测定法评估 NELL-1 的结合与释放效率。</li>
	<li>确定时间（t）时的累积释放量： 
	时间（t）时的累积释放量 = 时间（t）时的释放量 + 之前时间（t-1）时的释放量。</li>
	<li>绘制 BMP-2 和 NELL-1 的累积释放量随时间变化的曲线图。</li>
</ol>
10. 体外 NELL-1 的生物活性
注意：通过检测从PEC释放的NELL-1增强兔骨髓间充质干细胞（rBMSC）碱性磷酸酶（ALP）表达的能力，评估其生物活性。
<ol>
	<li>在24孔板中每孔接种20,000个rBMSCs，加入1 ml含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），培养一天 37 °C 和5% CO2.</li>
	<li>24 小时后，将培养基更换为 1 ml 成骨诱导培养基（DMEM 添加 10% FBS、2% 青霉素-链霉素） 50 µg/ml 抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和10-8 mol/L 地塞米松）中培养 7 天 37 °C 和5% CO2.</li>
	<li>放置 300 µg PEC-NELL-1（来自步骤8.2）和细胞培养插件（TC insert）内的PEC，以使PEC与细胞分离（此举可避免成骨诱导培养基更换过程中PEC微珠被洗脱）。将TC插件置于24孔板中培养14天。</li>
	<li>每三天一次，将针头置于TC插件外，吸出1 ml成骨诱导培养基，并加入1 ml新鲜的成骨诱导培养基。</li>
	<li>孵育7天和14天后，按照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒制造商提供的说明书，使用该试剂盒测定ALP活性。
	<ol>
		<li>使用含 0.1% TritonX-100 的检测缓冲液裂解细胞 4 °C 10分钟。使用细胞刮刀刮下贴壁细胞。将细胞悬液于 4 °C 在振荡条件下反应至少60分钟。</li>
		<li>将细胞悬液在 2,500 x g 条件下离心 4 °C 孵育10分钟。收集上清液用于碱性磷酸酶（ALP）检测。</li>
		<li>添加 50 µl 将碱性磷酸酶标准品溶液从200至0 ng/ml进行系列稀释后加入96孔板的各孔中。每孔中碱性磷酸酶标准品的最终含量分别为10、5、2.5、1.2、0.6、0.3、0.15和0 ng/孔。</li>
		<li>加入第10.5.2步的上清液（50 µl/well）并用稀释缓冲液稀释。</li>
		<li>添加 50 µl 的 p将对硝基苯磷酸酯（pNPP）底物溶液加入各孔中。轻轻振荡酶标板30秒以混匀试剂。避光孵育30分钟。使用酶标仪在405 nm处测定吸光度。</li>
		<li>使用标准曲线计算 ALP 活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 microBCA 蛋白检测试剂盒，按照制造商说明书测定蛋白含量。通过将碱性磷酸酶（ALP）活性除以蛋白含量，对 ALP 活性进行归一化处理。</li>
</ol>
11. 细胞活力
<ol>
	<li>将 200 mg PEC-NELL-1 与 1 ml DMEM +10% FBS 在 37 °C 下孵育 24 小时，用于 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测。</li>
	<li>在 96 孔板中每孔接种 2,000 个 rBMSCs（含 10% FBS 的 100 µl DMEM），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 天。</li>
	<li>将 DMEM + 10% FBS 替换为 100 µl PEC-NELL-1/PEC 提取物，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育。</li>
	<li>孵育 1 天或 3 天后，每孔加入 10 µl 浓度为 5 mg/ml 的 MTT 溶液，在 37 °C、5% CO2 条件下避光继续孵育 4 小时。</li>
	<li>向每孔加入 100 µl DMSO 溶液以溶解甲臜结晶。</li>
	<li>使用酶标仪测定 570 nm 处的吸光度。</li>
	<li>计算相对生长率： 
	<img alt="相对生长率公式，吸光度比值，细胞暴露分析，生物学实验。" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1"></li>
</ol>
12. 支架材料的包封及 BMP-2 与 NELL-1 的负载
<ol>
	<li>在 BSL-2 操作舱内，使用无菌刮刀将 PEC 填充至可生物降解的医用级聚己内酯-三钙磷酸盐（mPCL-TCP）支架的孔隙中。</li>
	<li>将 BMP-2 或 NELL-1 溶液（浓度为 1.5 mg/ml）加入已填充 PEC 的 mPCL-TCP 支架中，并于 4 °C 下孵育过夜。</li>
</ol>

<ol><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NELL-1+based+demineralized+bone+graft+promotes+rat+spine+fusion+as+compared+to+commercially+available+BMP-2+product%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Sci%22%5BJournal%5D)">NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product.</a> Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).</li>
<li>Anderson, C. L., Whitaker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+associated+with+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+%28infuse%29+in+posterolateral+lumbar+spine+fusion%3A+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report.</a> Spine. 37, 502-506 (2012).</li>
<li>Glassman, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBMP-2+versus+iliac+crest+bone+graft+for+lumbar+spine+fusion%3A+a+randomized%2C+controlled+trial+in+patients+over+sixty+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age.</a> Spine. 33, 2843-2849 (2008).</li>
<li>Tannoury, C. A., An, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+with+the+use+of+bone+morphogenetic+protein+2+%28BMP-2%29+in+spine+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery.</a> Spine J. 14, 552-559 (2014).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+performance+of+a+polycaprolactone-based+scaffold+used+as+fusion+cage+device+in+a+large+animal+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery.</a> Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).</li>
<li>Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioactivity+of+rhBMP-2+delivered+with+novel+polyelectrolyte+complexation+shells+assembled+on+an+alginate+microbead+core+template%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template.</a> J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+Complex+Carrier+Enhances+Therapeutic+Efficiency+and+Safety+Profile+of+Bone+Morphogenetic+Protein-2+in+Porcine+Lumbar+Interbody+Fusion+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model.</a> Spine. 40, 964-973 (2015).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+rhBMP-2+into+self-assembled+polyelectrolyte+complexes+promotes+anatomic+localization+of+new+bone+in+a+porcine+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery.</a> Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Protamine-Based+Polyelectrolyte+Carrier+Enhances+Low-Dose+rhBMP-2+in+Posterolateral+Spinal+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion.</a> Spine. 40, 613-621 (2015).</li>
<li>Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tricalcium+phosphate+particles+as+a+controlled+release+carrier+of+osteogenic+proteins+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).</li>
<li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+entrapping+conditions+to+improve+the+release+of+BMP-2+from+PELA+carriers+by+response+surface+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology.</a> Biomed Mater. 10, 015002(2015).</li>
</ol>

我们不存在利益冲突。

本方案介绍了一种通过逐层自组装法制备聚电解质复合物（PECs）的方法。利用鱼精蛋白、肝素、BMP-2 和 NELL-1 的荧光类似物，并结合共聚焦显微镜，对逐层结构进行可视化观察。摄取与释放实验表明，PEC 上的肝素可介导成骨生长因子的摄取与释放。该 PEC 方法的摄取效率为：NELL-1：86.7 ± 2.7%，BMP-2：70.5 ± 3.1%。与纯表面吸附载体（如磷酸钙磷灰石颗粒，释放率为 40–80%）相比，PEC 载体对 NELL-1 的释放具有更优的调控能力（释放率为 20%）11。
除了调节释放外，肝素还可中和多聚阳离子（如鱼精蛋白）过量的正电荷，以避免与细胞毒性相关的不良问题12。通过MTT法和Alamar Blue法检测，PEC未表现出任何细胞毒性迹象7。碱性磷酸酶（ALP）检测显示，PEC载体能够维持NELL-1和BMP-2两者的生物活性。尽管PEC最初是为脊柱融合手术中成骨生长因子BMP-2的治疗而开发，但它也可负载其他具有肝素结合结构域的生长因子，如NELL-1和PDGF-BB。与其他递送方法...

据报道，在退行性脊柱融合术和翻修脊柱手术中，假关节形成的发生率可高达10%至45%1。为了降低脊柱融合术及其他重建性骨科手术中假关节的发生率，已引入成骨生长因子（如BMP-2、Nell-11和血小板源性生长因子（PDGF））以促进新骨形成。其中，BMP-2是脊柱融合术中常用的选择2。尽管BMP-2在诱导和促进新骨形成方面的有效性已得到充分证实3，但由于临床使用剂量常超过生理水平，仍存在异位骨化、血清肿和血肿形成、炎症反应、神经根炎、椎体骨溶解以及逆行射精等具有临床意义的并发症，这些问题仍令人关注4,5。
因此，降低BMP-2的剂量仍是减少其副作用的相关策略。此外，需要高效的载体系统以抑制目前胶原海绵载体系统中观察到的BMP-2初始突释现象，并进一步增强这种强效细胞因子的持久性和局部递送效果。逐层自组装交替的阳离子和阴离子聚电解质可作为一种可调控的方法，在支架基质或可植入材料表面构建聚电解质复合物6。在这方面，肝素（因其具有所有生物分子中最高的负电荷密度）已被证实可通过静电作用及肝素结合结构域与多种生长因子高亲和力结合。事实上，已有研究显示肝素可延长多种生长因子的半衰期，从而增强其生物活性。
基于此，本课题组采用逐层自组装方法构建了一种基于肝素的聚电解质复合物（PEC），可在固定过程中负载并保持成骨生长因子的生物活性7,8。海藻酸盐微球核心通过海藻酸中的α-L-古洛糖醛酸（G）残基与二价钙离子或锶离子交联而制备。该海藻酸盐核心是一种可生物降解的支架基质；植入后，该基质在融合区域被吸收，从而为骨组织长入腾出空间。聚-L-赖氨酸（PLL）或鱼精蛋白作为阳离子层，可同时与支架基质（本例中为海藻酸盐微球载体核心）及带负电荷的肝素相互交联；而阴离子型肝素层则起到稳定和定位负载生长因子的作用。在猪模型中已证实，这种三层结构的PEC可提高生长因子的负载能力9。近期研究显示，在大鼠10和猪的脊柱融合模型8中，PEC载体可成功将BMP-2的有效剂量至少降低20倍。
本文报道了利用BMP-2作为成骨生长因子模型，制备用于脊柱融合及其他重建性骨科手术中增强生长因子递送的PECs的方法。

<table><tbody><tr><td>生命科学 Acrodisc 25&amp;nbsp;毫米，0.2 微米注射器滤器&amp;nbsp;&amp;micro;m Supor 膜</td><td>PALL&amp;nbsp;</td><td>PN4612</td><td>无菌鱼精蛋白，通过超滤的肝素溶液</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>细胞星&amp;nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96孔板 Nunc Delta表面</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)，MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>测量 PEC-NELL-1 的细胞毒性</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>沉淀 CF-405&lt;br/&gt; 标记的鱼精蛋白</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen，Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>测定 PEC-BMP-2 的细胞毒性</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶检测（ALP）试剂盒</td><td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>默克</td><td>艺术 1145</td><td>FITC标记中的终止试剂</td></tr><tr><td>无水二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>荧光素异硫氰酸酯的溶剂 I</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>溶解&amp;nbsp; 甲臜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Hirayama</td><td>HU-110</td><td>通过蒸汽对海藻酸盐微珠进行灭菌</td></tr><tr><td>β-甘油磷酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2（Infuse 骨移植大剂量 II 套件）&amp;nbsp;</td><td>Medtronic Sofamor Danek，美国田纳西州孟菲斯</td><td>7510800</td><td>成骨生长因子，需要透析以去除会干扰FITC偶联的稳定剂成分</td></tr><tr><td>羧基苯甲酰基喹啉-2-甲醛（CBQCA）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>定量 NELL-1 蛋白</td></tr><tr><td>细胞筛（100&amp;nbsp;&amp;micro;m)</td><td>BD Science</td><td>352360</td><td>用于碱性磷酸酶检测的Pec样品</td></tr><tr><td>细胞刮刀 290&amp;nbsp;毫米 宽刀片 20&amp;nbsp;毫米</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>从24孔板中分离细胞</td></tr><tr><td>CF 405S，琥珀酰亚胺酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>用于鱼精蛋白标记的蓝色荧光染料</td></tr><tr><td>CF 594，酰肼</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>用于肝素标记的深红色荧光染料</td></tr><tr><td>离心</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>成骨生长培养基组分</td></tr><tr><td>葡聚糖脱盐柱</td><td>Pierce（Thermo Scientific）&amp;nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Quantikine ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>DBP200</td><td>测定 BMP-2 释放</td></tr><tr><td>胎牛血清 FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素，异构体 I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>用于 NELL-1 和 BMP-2 标记的绿色荧光染料</td></tr><tr><td>ThinCert 细胞培养小室&lt;br/&gt; 24孔板，无菌</td><td>Greiner&amp;nbsp;</td><td>662630</td><td>防止更换成骨培养基时PEC被冲走</td></tr><tr><td>哈佛仪器注射泵（11 plus）</td><td>Havard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>正己烷（n-Hexane）&gt;99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>与成骨相关的结合&lt;br/&gt; 具有肝素结合结构域的生长因子</td></tr><tr><td>盐酸（37%）</td><td>默克</td><td>100317</td><td>强腐蚀性</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>结合剂</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCA 蛋白定量检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>用于 ALP 和 microBCA 检测</td></tr><tr><td>Nisco 细胞封装仪</td><td>Nisco Engineering Inc</td><td>封装单元 VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP支架（孔径为1.3&amp;nbsp;毫米</td><td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>保留 PEC &lt;em&gt;体内&lt;/em&gt; 研究</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 10,000 单位/毫升, 100&amp;nbsp;毫升</td><td>Hyclone 细胞培养</td><td>SV30010</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10倍浓度溶液，超纯级</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸 MW 15,000-30,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>多阳离子</td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白盐，源自鲑鱼</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>聚阳离子</td></tr><tr><td>沙克器</td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Snakeskin透析管，3,500分子量截留值，22&amp;nbsp;毫米 × 35 英尺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>68035</td><td>通过透析去除未反应的FITC</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>默克</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>US Biological</td><td>S4000</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>六水合氯化锶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255521</td><td>海藻酸盐交联剂</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 注射器</td><td>Terumo</td><td>140425R</td><td>注射器直径影响流速</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞培养锥形瓶</td><td>康宁</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52040</td><td>肝素检测</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1x</td><td>Hyclone 细胞培养</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>Novamatrix（FMC Biopolymer，美国新泽西州普林斯顿）</td><td>Pronova UPMVG</td><td>微珠的核心材料</td></tr></tbody></table>

用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

在重建性骨科手术中，通常凭经验将超生理剂量的生长因子加载到支架材料上，以促进骨融合成功。由于生长因子易受快速酶解而失活，且载体难以在植入部位局部维持足够浓度，因此需要使用大量高活性生物制剂。因此，若能采用可延长生长因子（如BMP-2/NELL-1）稳定性的策略，并实现其可控释放，则有望降低其有效剂量，从而减少未来骨再生手术中对高剂量生长因子的需求。这将相应减少副作用并降低生长因子的使用成本。已开发出自组装聚电解质复合物（PECs），通过肝素结合实现对BMP-2/NELL-1递送的更优控制，并通过增强生长因子的生物活性进一步提高其效能 体内 稳定性。在此，我们展示了PEC制备的简便性，这有助于在重建性骨科手术中递送多种生长因子。

在我们的载体中，选用鱼精蛋白替代聚-L-赖氨酸，因其具有相似的化学性质，且已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为肝素的解毒剂。光学显微镜结果显示，未辐照的微珠呈球形，直径为 267 ± 14 µm（使用 0.35 mm 喷嘴，流速 5 ml/hr，电压 5.8 kV）。大多数经辐照的微珠呈泪滴状。在辐照微珠的圆形部分测得的直径为 212 ± 30 µm（使用 0.35 mm 喷嘴，流速 4 ml/hr，电压 6 kV）。（图4）。
PEC微球的共聚焦图像显示了逐层包覆的CF-405标记鱼精蛋白（蓝色）、CF594标记肝素（红色）以及FITC-BMP-2/FITC-NELL-1（绿色）。结果表明，PEC可通过肝素结合域与带正电荷的BMP-2和带负电荷的NELL-1结合（图5）。这说明PEC与成骨生长因子之间的相互作用不依赖于电荷。
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由肝素和鱼精蛋白制备的自组装聚电解质复合物（PEC）被沉积在海藻酸盐微珠上，用于包埋并调控成骨生长因子的释放。该递送策略可在脊柱融合应用中使BMP-2的剂量减少20倍。本文阐述了PECs的制备方法及其优势。

在重建性骨科手术中，通常会凭经验将超生理剂量的生长因子加载到支架上，以促进成功的骨再生……

本实验的总体目标是制备一种聚电解质复合壳层，该载体能够包埋并调控具有肝素结合结构域的多种生长因子的释放。该方法可为骨科组织工程领域中高效包埋和递送特定生长因子的关键问题提供解答。该技术的主要优点在于通常无需使用有机溶剂，而有机溶剂已知会影响生长因子的生物活性。将200毫克未辐照的海藻酸钠或400毫克八兆拉德辐照的海藻酸钠溶于10毫升双蒸水中。然后振荡一小时。将海藻酸钠溶液在4°C下保存过夜。在制备海藻酸微珠前，使用无菌的0.2微米注射器滤器过滤海藻酸钠溶液。用70%乙醇对静电BE发生器和注射泵进行消毒，并将其置于二级生物安全柜中。然后在BE发生器内放置一个带有磁力搅拌子的玻璃容器。将BE发生器的电极臂设置在容器上方9厘米处。将BE发生器的电极电缆连接到手臂电极的神经螺钉二。然后向盆中倒入80毫升氯化锶溶液。接下来，将5毫升经0.2微米滤膜过滤的海藻酸钠溶液装入橡胶管的注射器中。将橡胶管与手臂电极连接后，以每小时5毫升的速度启动注射泵，持续2分钟，以排出管路内的空气，并将海藻酸钠溶液输送至喷嘴尖端。然后关闭注射泵。开始微珠生成时，将封装仪设置为5.8千伏，随后启动注射泵，使海藻酸钠的流速为每小时5毫升。弃去前两分钟内生成的微珠，因为这些微珠通常大小和形状不规则。将后续生成的微珠收集至0.2摩尔的氯化锶溶液中。随后关闭注射泵，再关闭包埋装置。注入预定体积的海藻酸钠溶液后，对后续批次的微珠制备重复此操作。将微珠置于20毫升0.2摩尔的氯化锶溶液中，在4摄氏度下保存过夜，以完成交联并稳定凝胶。用塑料移液管收集0.5毫升藻酸盐微珠，将其置于玻璃载玻片上，在光学显微镜下以10倍放大倍数观察微珠。使用显微镜CCD相机拍摄微珠的10张图像。以TIFF格式保存图像，分辨率设置为2048 × 1536，并添加500微米的比例尺。利用ImageJ中的长度测量工具，测量微珠的尺寸。以及比例尺。然后将微珠的长度从像素转换为微米。单击线条工具，在海藻酸盐微珠的中部画一条线。单击菜单栏上的“分析”并选择“测量”。此时将弹出一个窗口。重复这些步骤以测量图像内所有的海藻酸盐微珠。测量图像上的比例尺。使用100微米尼龙滤网收集微珠，并用双蒸水洗涤微珠。使用刮刀将由 0.1 毫升海藻酸钠溶液制备的全部微珠转移至一个 2 毫升微量离心管中，并用纱布覆盖以防止干燥。最后，通过高压灭菌器的液体模式或按照制造商的说明对微珠进行灭菌。向腔室中加入 1.5 升蒸馏水，以防止微珠干燥。在生物安全二级（BSL2）生物安全柜内，将无菌微珠与一毫升经灭菌的、浓度为每毫升含两毫克的鱼精蛋白溶液在室温下孵育一小时。用双蒸水将包被鱼精蛋白的微珠洗涤两次。然后使用台式离心机在室温下以200 × g离心三分钟，沉淀微珠。离心后，使用注射器吸除上清液。将鱼精蛋白包被的微珠与1毫升灭菌的0.5毫克/毫升肝素溶液在30分钟内孵育。这将形成一种聚电解质复合物壳层，对肝素结合性生长因子具有强亲和力。孵育后，用注射器吸除肝素。用双蒸水洗涤两次，去除聚电解质复合物上未结合的肝素。将13.3 µL浓度为1.5 mg/mL的骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2）或NELL样分子1溶液加入100 µg聚电解质复合物中。将聚电解质复合物在4°C、30 RPM条件下振荡孵育10小时。随后，将微珠浸入1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，在37°C下持续振荡。在第1、3、6、10和14天时，收集1毫升上清液，并替换为1毫升PBS。根据制造商提供的方案，使用CBQCA蛋白检测方法评估NELL样分子一的摄取和释放效率。也可选择进行ELISA检测。通过测定从聚电解质复合物中释放的NELL样分子一对兔骨髓干细胞碱性磷酸酶表达水平的促进能力，评估其生物活性。每孔接种20,000个兔骨髓干细胞于24孔板中，加入1毫升含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养1天。24小时后，弃去原培养基，每孔更换为1毫升成骨诱导培养基，继续在37摄氏度条件下培养7天。5% CO₂条件下，将300微克聚电解质复合物及聚电解质复合物NELL样分子1置于细胞培养插入式小室中，以使复合物与细胞分离。将插入式小室放入24孔板中，以防止成骨诱导培养基更换过程中聚电解质复合微珠被冲走。每三天一次，将针头置于小室外部，吸出一毫升成骨诱导培养基，并加入一毫升新鲜的成骨诱导培养基。培养7天和14天后，使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性。根据试剂盒制造商的说明书，将聚电解质复合物装入可生物降解的医用级聚己内酯-三钙磷酸盐支架的孔隙中。在生物安全二级（BSL2）实验室内使用无菌刮铲进行操作。将1.5毫克或毫升的骨形态发生蛋白2或NELL样分子1溶液加入含有聚电解质复合物的支架中，并在4摄氏度下孵育过夜。在显微镜下观察海藻酸盐微珠，以监测其大小和形态。非辐照海藻酸盐微珠呈球形，而辐照后的微珠呈泪滴状。微珠尺寸分布是影响生长因子摄取的重要因素，尺寸减小可增加表面积与体积之比。使用 ImageJ 软件测量海藻酸盐微球时，每批次微球随机选取约 100 个微球进行测量，可较好地估算其粒径分布。由于生长因子的吸附效率依赖于正确的包被技术，因此通过共聚焦显微镜观察每一层包被的厚度。此处展示了海藻酸盐微球与鱼精蛋白、肝素、NELL 样分子 1 以及骨形态发生蛋白 2 的荧光类似物共同孵育后获得的共聚焦激光扫描显微镜图像。碱性磷酸酶活性用于测定释放的生长因子的生物活性。在第14天与聚电解质复合物NELL样分子一孵育后，观察到碱性磷酸酶活性增加了2.2倍。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。进行此操作时，需注意海藻酸盐浓度会影响微珠的稳定性。对于经辐照的海藻酸盐，我们需要使用4%的浓度；对于未经辐照的海藻酸盐，则需要使用2%的浓度。通过该方法，我们可以通过多层包被进一步提高生长因子的负载量。该技术可使组织工程领域的研究人员探索生长因子在其他疾病模型中的递送应用。观看本视频后，您将能够制备粒径分布均一的聚电解质复合物。

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聚电解质复合物肝素结合域成骨生长因子交货

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通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

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用于氧气输送的分级多孔UiO-66纳米颗粒的合成、血红蛋白封装及生物正交PEG化

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用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物

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