Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

该程序的总体目标是制造聚电解质络合壳。一种载体，可以通过肝素结合结构域捕获和调节多种生长因子的释放。该方法可以回答骨科组织工程领域的关键问题，以实现高效包埋和递送专用生长因子。

这种技术的主要优点是它不需要经常使用有机物。已知会影响生长因子的生物活性。将 200 毫克未辐照的海藻酸钠或 400 毫克 8 兆拉德辐照的海藻酸钠溶于 10 毫升双蒸水中。

摇晃 1 小时。将藻酸盐溶液在 4 摄氏度下储存过夜。在制备藻酸盐微珠之前，用无菌 0.2 微米注射器过滤器过滤藻酸盐溶液。

用 70% 乙醇对静电 BE 发生器和注射泵进行消毒，并将它们放入 2 级生物安全柜中。然后将一个带有磁力搅拌棒的玻璃盆放入 BE 发生器内。将 BE 发生器的臂电极设置在水池上方 9 厘米处。

将 BE 发生器的电极电缆连接到手臂电极的神经螺钉 2。并将 80 毫升氯化锶溶液倒入盆中。接下来，将 5 毫升 0.2 微米过滤的海藻酸盐溶液装入橡胶管中的注射器中。

将橡胶管连接到手臂电极后，以每小时 5 毫升的速度打开注射泵。两分钟。排出管内的空气并将藻酸盐溶液输送到喷嘴尖端。

然后，关闭注射泵。要开始生成微珠，请将封装器设置为 5.8 KB。然后是注射泵，海藻酸盐流速为每小时 5 毫升。

丢弃前两分钟内产生的微珠，因为这些微珠的大小和形状往往不规则。在 0.2 摩尔氯化锶溶液中收集后续微珠。关闭注射泵，然后关闭封装器。

泵送预定体积的海藻酸盐溶液后。对后续批次的微珠制造重复此作。将微珠在 20 毫升 0.2 摩尔氯化锶溶液中于 4 摄氏度下储存过夜，以完成交联并稳定凝胶。

用塑料移液管收集 0.5 毫升海藻酸盐微珠。并将其放在载玻片上。在光学显微镜下以 10 倍放大倍率观察微珠。

用显微镜 CCD 相机拍摄 10 张微珠图像。使用 500 微米比例尺以 TIFF 格式保存图像，分辨率为 2048 x 1536。使用图 J 中的长度工具，测量微珠的大小。

还有比例尺。然后将微珠长度从像素转换为微米。单击线条工具，在藻酸盐珠的中间画一条线。

单击菜单栏上的 analyze，然后选择 measure。将出现一个弹出窗口。重复这些步骤以测量图像中的所有藻酸盐珠子。

测量图像上的比例尺。使用 100 微米尼龙过滤器收集微珠。并用双蒸水清洗珠子。

使用抹刀将 0.1 毫升海藻酸盐溶液制成的所有微珠转移到 2 毫升微量离心管中，并用纱布覆盖以防止干燥。最后，使用液体模式或根据制造商的规格通过自动裂解对微珠进行灭菌。向腔室中加入 1.5 升蒸馏水，以防止珠子干燥。

在 BSL2 通风橱内，将无菌微珠与 1 毫升 2 毫克/毫升的无菌鱼精蛋白溶液在室温下孵育 1 小时。用双蒸水洗涤鱼精蛋白包被的微珠两次。然后离心，使用 200 倍 G 的台式离心机在室温下离心 3 分钟。

离心后，使用注射器吸出水。将鱼精蛋白包被的微珠与 1 毫升 0.5 毫克/毫升的无菌肝素溶液一起孵育 30 分钟。这会产生一个聚电解质络合壳，对肝素结合生长因子具有强烈的亲和力。

孵育后，使用注射器吸出肝素。然后用双蒸水洗涤两次，从聚电解质复合物中洗去未结合的肝素。将 13.3 微升 1.5 毫克/毫升骨形态发生蛋白 2 或 NELL 样分子 1 溶液加载到 100 微克聚电解质复合物上。

将聚电解质复合物在 4 摄氏度下以 30 RPM 的转速孵育，摇动 10 小时。接下来，将微珠浸入 37 摄氏度的一毫升磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，同时不断摇晃。收集 1 毫升上清液，并在 1、3、6、10 和 14 天后更换 1 毫升 PBS。

根据制造商的方案，使用 CBQCA 蛋白质测定方法评估 NELL 样分子 1 的摄取和释放效率。或者，执行 ELISA。通过测量其增加兔骨髓干细胞中碱性磷酸酶表达的能力来评估从聚电解质复合物释放的 NELL 样分子 1 的生物活性。

在 24 孔板中每孔接种 20， 000 个兔骨髓干细胞。并在 37 摄氏度和 5% CO2 下加入 1 毫升 dulbecco 改良鹰培养基和 10% 胎牛血清，让它们生长一天。24 小时后，用 1 毫升成骨培养基更换培养基，在 37 摄氏度下放置 7 天。

和 5%二氧化碳 2 。将 300 微克聚电解质复合物和聚电解质复合物 NELL 样分子 1 放入细胞培养插入物内，以保持复合物与细胞分离。将插入物放入 24 孔板中，以避免在成骨培养基更换过程中洗掉聚电解质复合物微珠。

每三天一次，将针头放在插入物外，吸出 1 毫升成骨培养基。并更换为一毫升新鲜的成骨培养基。孵育 7 天和 14 天后，用碱性磷酸酶检测试剂盒测定碱性磷酸酶活性。

根据试剂盒制造商的方案。将聚电解质复合物封装到生物可吸收医用级聚己内酯磷酸钙支架的孔中。在 BSL2 腔室内使用消毒刮刀。

将 1.5 毫克或毫升的骨形态发生蛋白 2 或 NELL 样分子 1 溶液添加到填充有聚电解质复合物的支架上。并在 4 摄氏度下孵育过夜。在显微镜下检查藻酸盐微珠以监测其大小和形态。

未辐照的藻酸盐微珠是球形的，而辐照的微珠是泪滴形的。大小分布是生长因子摄取的重要因素。尺寸的减小增加了表面积比。

当使用 image J 软件测量藻酸盐微珠时，平均 100 个微珠可以很好地估计每组微珠中的粒径分布。由于生长因子的摄取取决于适当的涂层技术，因此通过共聚焦显微扫描观察每个涂层的层厚。在这里，显示了与鱼精蛋白、肝素、NELL 样分子 1 和骨形态发生蛋白 2 的荧光类似物一起孵育的藻酸盐微珠的共聚焦激光扫描微珠图像。

碱性磷酸酶活性用于测量释放的生长因子的生物活性。在第 14 天与聚电解质复合物 NELL 样分子 1 孵育后，观察到碱性磷酸酶活性增加 2.2 倍。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五个小时内完成。

在执行此程序时，重要的是要记住海藻酸盐浓度会影响微珠的稳定性。对于辐照藻酸盐，我们需要 4 个百分比。对于未辐照的对应物，我们需要 2 向百分比。

按照此程序，我们可以通过多层涂层进一步增加生长因子负载。该技术使组织工程领域的研究人员能够探索其他疾病模型中的生长因子递送。观看此视频后，您能够制备具有窄尺寸分布的聚电解质复合物。