剪切应力下T淋巴细胞-黏附分子相互作用研究的黏附力检测方法

本实验的总体目标是确定感兴趣处理因素在剪切应力条件下对细胞黏附的影响。该方法有助于解答免疫细胞信号传导领域中的关键问题，例如，哪些因素介导了整合素的活化。该技术的主要优势在于，可在易于重复的流动系统中研究单个黏附分子整合素配对的相互作用。

尽管该方法可为研究LFA1的活化提供见解，但也可应用于其他整合素的研究。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为技术操作必须精确执行。收获CHO-ICAM细胞时，需在室温下用0.5%胰蛋白酶EDTA轻柔振荡处理培养物1分钟。

当细胞开始脱落时，加入四毫升新鲜培养基以中和胰蛋白酶，并计数解离的细胞数量。将细胞稀释至每腔室浓度为0.75 × 10⁵个细胞，然后在离心机中离心沉淀。接着，用完全CHO-ICAM培养基将沉淀重悬，每流室加入30 µL，缓慢地将每份30 µL细胞悬液接种至流室的各个储液槽中。

将细胞置于含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中孵育5分钟。然后向每个腔室的两个储液池中分别加入200微升完全培养基，将培养板放回培养箱中过夜培养。收集T细胞后，计数并稀释细胞悬液至每腔室浓度为2×10⁶个细胞。

然后离心细胞，并将沉淀重悬于1毫升PBS中，每2×10⁶个T细胞加入1%葡萄糖。接下来，在避光条件下，用CFSE以1:1000的比例稀释标记T细胞，室温孵育8分钟。孵育结束后，离心细胞，并将沉淀按每孔240微升重悬于无血清RPMI培养基中。

然后将细胞分装至每个小室对应一个1.5毫升离心管中，并将离心管置于37摄氏度金属浴中保存，直至上样。成像前，将显微镜活细胞成像腔预热至37摄氏度，并在一个500毫升玻璃瓶中装满水。在瓶盖上标记“进”和“出”并打两个孔，将连接注射器的进液软管穿过“进”孔，将连接进样储液瓶的软管穿过“出”孔。

使用一个60毫升的注射器，先用60毫升水冲洗进液管路，随后用60毫升无血清的37摄氏度培养基冲洗，以清除系统中的任何空气。当管路完成预充后，将整个进液装置转移至显微镜的活细胞成像室中，以维持系统温度在37摄氏度。将管路和注射器从成像室内引出，并将注射器安装到注射泵中。

接下来，在一个250毫升瓶子的瓶盖上打一个孔，用作废液收集容器，并将出液管穿过孔洞插入瓶内。然后轻轻拧紧出液瓶的瓶盖，将整个出液装置放入活细胞成像室中。现在将流动腔载玻片放置在显微镜载物台上，使用20倍物镜对CHO ICAM单层细胞设定焦平面。

然后，从非刺激性对照开始，从第一个腔室的输出储液池中弃去三份70微升体积的液体，并向输入储液池中加入三份70微升标记了CFCS的T细胞。在T细胞从入口流向出口的过程中，对每个腔室中五个随机区域的CFSE阳性T细胞进行成像，以获得流体流动前的细胞计数。接下来，同时将输入和输出管路连接至流动腔室的储液池，注意避免引入气泡，并以0.3毫升/分钟的流速开始施加剪切应力，同时继续观察CFSC染色的T细胞。

一旦观察到T细胞移动，立即启动计时器，持续五分钟，并在五分钟后终止流动。随后，在每个腔室中随机选取五个视野，对CFSE阳性细胞进行成像，以获取流动后的细胞计数。对于PMA刺激，在将T细胞加载至第二个流动腔室进行成像前，立即用PMA刺激其中一管T细胞，作为阳性对照，操作方法如前所述。

进行SDF-1α刺激时，首先从第三个腔室的输出储液池中移除三份每份70微升的培养基，然后向输入储液池中加入70微升的SDF-1α。五分钟后，从输出储液池中弃去三份每份70微升的培养基，并加入剩余的T细胞管用于成像，操作方法如前所示。在这些代表性图像中，不同刺激条件下，流动前观察到的T细胞数量相似。

持续剪切应力作用5分钟后，在PMA和SDF-1α刺激条件下，黏附的T细胞数量增加，而未受刺激的T细胞仅有少量保持黏附。事实上，例如SDF-1α对T细胞的激活可使T细胞黏附率相比未刺激的对照组细胞提高近两倍。此外，当计算人原代CD3阳性T细胞在有或无SDF-1α存在情况下的黏附百分比时，发现在剪切应力下，未刺激T细胞的黏附率为15%，而在SDF-1α激活条件下，T细胞黏附率则达到50%。

一旦掌握，该技术可在一次实验中合理扩展至六个实验腔室。在进行此操作时，重要的是要始终仅使用汇合的 ICAM 单层细胞。在完成该操作后，可对所获得的图像进行其他方法分析，例如细胞形态分析，以回答更多科学问题。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何在剪切应力条件下定量测定细胞黏附。感谢观看本视频，祝您的实验顺利成功。