人胎盘组织来源的间充质干细胞/基质细胞的分离与扩增

本实验的总体目标是从人胎盘组织中分离并扩增间充质干细胞。大家好，我是 Mike Doran，澳大利亚布里斯班市昆士兰科技大学转化研究所的一名课题组长。

您好，我叫Rebecca Pelekanos，是昆士兰大学临床研究中心的一名研究人员。今天，我将演示间充质干细胞（MSC）的分离步骤。胎盘通常在出生后被丢弃。

由于该组织重量为5至700克，可提供一种独特且丰富的同种异体间充质干细胞来源。通常，刚接触胎盘间充质干细胞分离的研究人员会面临困难，原因是他们不熟悉胎盘解剖结构、不了解组织处理方法，也不清楚最终的间充质干细胞培养物中将包含母体来源还是胎儿来源的细胞。为帮助研究人员，本视频将详细讲解这些关键问题。

该操作流程的第一步是熟悉胎盘的解剖结构。第二步是使用剪刀从蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板中手动分离出10克组织。前两个步骤在此处以示意图形式再次概括。

第三步，使用剪刀将蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板组织进一步剪切成细小碎片。第四步，通过使用dispase和胶原酶I消化一至两小时，从组织小块中释放细胞。第五步，通过细胞筛网洗涤，将细胞与纤维组织分离。随后收集细胞，重悬于培养基中，并接种至培养瓶中进行培养。

间充质基质细胞（MSCs）将根据其贴壁生长的特性以及在细胞培养基中存活和增殖的能力进行筛选。最后，在结果部分，扩增后的MSC可被鉴定并储存，用于后续实验。胎盘是一种临时性器官，在妊娠期间介导胎儿与母体之间的营养物质和代谢废物交换。

剖宫产手术后，在确保婴儿安全娩出的情况下，可轻松无菌采集胎盘。胎盘主要由胎儿来源的血管和膜组织构成，但也含有部分母体细胞。

胎盘通过母体来源的子宫蜕膜细胞和胎儿来源的侵入性滋养层细胞与子宫相连。通常无法通过肉眼分辨母体组织与胎儿组织之间的精确界面。然而，胎盘的胎儿面很容易识别，即脐带所在的一侧。

当婴儿娩出后，仅有一层薄薄的蜕膜组织仍与胎盘相连。通过胎盘的物理定位，可以确定今日将要采集的三种组织。首先采集的组织是母体蜕膜。

绿色标记指向胎盘从子宫壁脱落后残留在表面的蜕膜组织。将从胎盘内部获取的第二种组织是胎儿绒毛膜绒毛，示意图中的蓝色圆圈标示了该部位。

第三种需要采集的组织是胎儿绒毛膜板。该组织在图中由红色标记标示。好了，我们开始吧。

将胎盘置于生物安全柜中。展开胎膜，并辨识胎盘的各个部分：包括有脐带附着的胎儿面、绒毛膜羊膜层或羊膜囊。

胎盘的胎儿面在绒毛膜板上可见明显的粗大血管，并覆有羊膜，后者同样可轻易通过机械方法分离。母体面与胎儿面相对，具有明显的叶状或小叶状结构。确保母体面朝上。

从胎盘或蜕膜的母体侧切取厚度为 0.5 cm 的组织块。在解剖过程中，将组织块放入含有汉克斯平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution，HBSS）的培养皿中，以保持组织湿润。用 HBSS 轻轻振荡培养皿中的组织，以去除部分血液。

转移足够的组织，使其填充至50毫升离心管的10毫升刻度线处，约10克。注意，若在实验结束时需要更多细胞，此步骤可分离更多组织。确保胎盘的胎儿面朝上。

从胎盘的胎儿面机械性去除羊膜，保留绒毛膜板完整。将绒毛膜板切成条状，深度约为下方绒毛组织半厘米。然后，从已去除绒毛膜板的部位向胎盘内部解剖约一厘米深的绒毛组织。

将组织放入HBSS中，并参照之前的方法，量取大约10毫升的组织。用剪刀将组织块转移至10厘米的培养皿中（尽量减少液体转移），并剪成约1立方毫米大小的细小碎片。将剪碎的组织重新转移回50 mL离心管中。

对所有剩余的组织样本重复上述步骤。加入新配制的消化液，其体积至少与组织体积相等。轻轻颠倒离心管数次以混匀。

将组织置于管中，加入消化液，在37摄氏度的摇床培养箱中孵育一至两小时。当组织消化液变为浑浊外观，且溶液中可见明显的白色血管时，加入15毫升HBSS以稀释消化液中的酶。短暂脉冲离心样品，仅使离心机达到340 g，持续五秒，然后停止。

这将迫使大块碎片聚集在管底。将样品放回生物安全柜中。将细胞滤网放入一个新的50毫升离心管中。

将含有单个核细胞的上清液用移液管转移至滤器中，用新试管收集滤过液。将胎盘组织碎片残留在第一个试管中。向胎盘碎片中加入15毫升HBSS，剧烈振荡以回收更多细胞，然后对样品进行瞬时离心。

再次用移液器将上清液转移至装有细胞筛的收集管中。根据样本的性状，将上清液直接倒入细胞筛可能更为合适。用5毫升HBSS冲洗细胞筛。

弃去含有胎盘组织碎片的离心管。将上清液样品在340 g条件下离心5分钟，以沉淀细胞。红细胞可见为沉淀底部的一层，而单个核细胞（包括间充质干细胞）则位于红细胞层上方，呈较浅的上层。

将样品放回生物安全柜中。小心倾倒上清液并弃去。用手指轻弹离心管数次，使细胞沉淀松动，然后将细胞沉淀重悬于 35 毫升 MSC 培养基中。

将细胞悬液转移至每10毫克组织对应的一个T175培养瓶中，在37°C、5%CO2的培养箱中培养。分离后48小时更换培养基。每周换液一次，直至细胞融合。

培养约14天后，细胞应达到汇合状态。最后，扩增并冻存细胞，分析间充质干细胞（MSC）特性，并用于后续实验。培养48小时后，间充质干细胞已贴附于组织培养塑料表面，而造血细胞及其他细胞群体则未贴附。

此时，将培养基更换为35毫升新鲜培养基。不同胎盘供体的培养上清液外观可能存在显著差异。示例一和示例二展示了这种差异。

这两项分离操作是同时进行的，但来自两个不同的胎盘。清洗后，培养物中已无红细胞和组织碎片，如示例三所示，后续扩增结果通常一致。在48小时换液后，仅有少量细胞贴附于培养瓶上。

分离后7天，可见成纤维细胞样的MSC集落，尽管也存在非MSC细胞，表现为圆形或 loosely attached 的细胞。分离后13天，成纤维细胞样的MSC集落已较大，单层MSC常已达到足够汇合度，可进行传代。从传代开始，MSC单层在汇合时呈现出特征性的漩涡样形态。

通过流式细胞术分析，胎盘来源的间充质干细胞（MSC）表现出典型的MSC标志物表达谱。这些细胞对CD73、CD105和CD90呈阳性，对造血细胞标志物CD45、CD34和HLA-DR呈阴性。胎盘MSC通常可发生强烈的成骨分化，但成脂分化能力较弱。

许多出版物认为，从胎膜（绒毛膜）分离的细胞在培养后可获得胎儿间充质干细胞（MSC）。然而，正如我们先前所报道的，采用本方案从胎儿绒毛膜获得的所有培养物会迅速富集母源间充质干细胞，其表现与母源蜕膜间充质干细胞培养物一致。此处展示的数据量化了从蜕膜、绒毛组织及绒毛板组织中分离得到的胎盘间充质干细胞培养物中胎儿细胞与母源细胞的组成比例。

观看本视频后，您应该能够较好地掌握如何分离和培养源自胎盘组织的间充质干细胞。我们希望这些方法对您在涉及胎盘来源间充质干细胞的研究和临床应用中有所帮助。