Name: 从人胎盘组织源分离和间充质干扩张/基质细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学习从人足月胎盘组织中分离和扩增间充质干细胞/基质细胞的方法，包括蜕膜、绒毛和绒毛膜板的解剖定位、酶消化及贴壁培养技术。该方案为干细胞生物学研究提供可靠的技术支持。

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RP 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）博士后培训基金的支持。VS 获得了昆士兰大学国际研究生奖学金的支持。MRD 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）和澳大利亚_inner wheel_组织的支持。
感谢临床和护理人员在患者知情同意和样本采集方面的协助。感谢 Nickolas Fisk 教授、Kerry Atkinson 教授和 Rohan Lourie 博士在产科、胎儿-胎盘发育及胎盘解剖学方面提供的有益讨论。

马特健康服务部、皇家布里斯班妇女医院、昆士兰科技大学和昆士兰大学的人类研究伦理委员会批准了本研究以及研究中使用的人类胎盘样本的采集。所有实验方案均符合国家研究指南。患者已签署知情书面同意书，同意将组织用于科研目的。
妊娠晚期胎盘样本取自澳大利亚布里斯班上述医院因常规剖宫产（CS）足月分娩的健康产妇。本研究采用性别异源的足月妊娠样本，以区分胎儿细胞与母体细胞。胎儿性别已于出生前通过超声检查和/或出生时临床医护人员对新生儿的肉眼观察确定。X与Y染色体荧光 原位 采用荧光原位杂交（FISH）进一步验证保存自原始胎盘组织的性别以及组织的胎儿或母体来源。
1. 收获前准备以下事项
注意：配制酶溶液时，应遵循各生产商针对其产品提供的具体要求和浓度说明。酶通常以粗提的蛋白质混合物形式提供，因此不同公司的相似酶可能具有不同的活性或浓度。鉴于此，应参考生产商的建议，并相应调整溶液的配制方法。
<ol>
	<li>为本方案准备或购买总计1.5至2升无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。</li>
	<li>称取 I 型胶原酶，以 HBSS 溶解配制成 1 mg/ml 的胶原酶 I 储存液，轻轻涡旋以确保完全溶解。根据所需体积，用含钙和镁的 HBSS 将胶原酶溶液稀释至 100 单位（U）/µl（1,000 倍储存液），然后使用 0.2 µm 注射器滤器过滤。将溶液分装为每管 1 ml 至 1.5 ml 离心管中，于 -20 °C 保存，待用。</li>
	<li>通过将非无菌dispase溶解于不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，配制浓度为10 mg/ml的dispase储存液。再用不含钙和镁的DPBS稀释至终浓度为2.4 U/ml。使用0.2 µm注射器滤器过滤除菌。将溶液分装为每管1 ml，置于1.5 ml离心管中，于-20 °C保存，待用时取出。</li>
	<li>将DNase-I溶解于0.15 M NaCl中，配制成10 mg/ml的脱氧核糖核酸酶（DNase-I）贮存液。用0.2 µm注射器滤器过滤。分装为每管1 ml，置于1.5 ml离心管中，于-20 °C保存，备用。</li>
	<li>通过将 100 U/ml I 型胶原酶、1.5 µg/ml DNase I 和 2.4 U/ml dispase 混合于无血清 DMEM 中，配制工作用消化液。酶液原液应在使用前新鲜解冻并立即稀释。消化液体积与组织体积之比大约为 1:1（例如10 ml 组织（在 50 ml 离心管中量取）需要加入 10 ml 消化液。</li>
	<li>在 PBS 中配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，并调节 pH 至 7.4 15将25 mL分装后，长期储存于-20 °C，或于4 °C保存1周。</li>
	<li>从低糖DMEM（DMEM-LG）中配制MSC培养基，添加1×抗生素-抗真菌溶液和10%未灭活的胎牛血清。MSC级别的胎牛血清可从多家FBS供应商处购买。</li>
	<li>根据机构指南预先对解剖器械进行高压灭菌消毒，包括剪刀、镊子、手术刀和大型金属解剖托盘。收集额外的无菌组织培养塑料器皿和耗材（例如 手术刀片、50 ml 和 15 ml 离心管、25 ml、10 ml 和 5 ml 移液管，以及 75 或 175 cm² 培养瓶2 细胞培养瓶</li>
	<li>使用标准的原代细胞培养实验室设备：适用于原代细胞分离的II级生物安全柜、设定为5% CO₂的细胞培养箱2 37 °C，37 °C 培养箱中的摇床，以及可容纳 50 ml 离心管的离心机。</li>
	<li>使用适当的个人防护装备：实验服、两副手套（始终佩戴）、护目镜和防滑闭口鞋，具体要求遵循机构指南。</li>
	<li>根据机构指南预先准备好用于人血标本的适当去污溶液及液体生物废弃物容器。</li>
</ol>
2. 胎盘间充质干细胞的分离
<ol>
	<li>胎盘的制备
	<ol>
		<li>穿戴必要的个人防护装备。在生物安全柜中准备好所需材料、溶液和废液容器，以完成至酶消化步骤（第2.5.6节）的全部操作。</li>
		<li>在获得知情同意和伦理批准后获取胎盘。通过剖宫产在无菌外科条件下采集胎盘，并将其装入无菌袋或桶中运送到实验室。</li>
		<li>在运输过程中以及解剖前，将胎盘置于室温或4 °C保存。 
		注：组织可在不影响细胞培养性能的情况下保存最长6小时。
		<ol>
			<li>应尽可能缩短胎盘采集与组织处理之间的时间。此建议基于实际操作经验。在某些情况下，我们在出生后延迟最多6小时才开始细胞分离过程。这些胎盘在实验室或采集中心均保存于室温或4 °C。当胎盘在4 °C或室温下保存时，所获得的间充质干细胞（MSC）未观察到可检测的差异，仅存在个体供体间的正常变异。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将装有胎盘的容器放入生物安全柜中。打开容器，将胎盘转移至无菌托盘中。</li>
		<li>展开胎儿面的胎膜（羊膜囊或羊膜-平滑绒毛膜）8。辨识胎盘各部分结构：胎儿面有脐带插入点，通常位于胎盘中央；母体面（衬有基蜕膜）与胎儿面相对，具有明显的叶状结构（或小叶）。</li>
		<li>开始解剖时，将胎盘置于无菌托盘中，使脐带朝上。 
		注：本方案设计目标是从三种不同组织类型中每种获得足够接种一个T175培养瓶的细胞量。每次消化起始约使用10 g组织，这与从20 ml骨髓穿刺液中启动的MSC培养所用的起始培养瓶数量相似。若需要更多细胞，可采集更多组织并线性放大本方案。所建议的组织采集尺寸仅为基于胎盘组织实际操作性的参考值。胎盘绒毛中缺乏明确的解剖标志作为参照点，因此所标注的尺寸仅为估算值，脐带作为胎儿面上的定位标志。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蜕膜（D）组织的解剖
	<ol>
		<li>将胎盘翻转，使母体面（基蜕膜）朝上，确保带有脐带插入点的胎儿面朝下。</li>
		<li>从胎盘母体面切取厚度约为0.5 cm的组织块（含基蜕膜组织）。</li>
		<li>在解剖过程中，将组织块放入含有HBSS的培养皿中，以保持组织湿润。</li>
		<li>转移足够量的组织至50 ml离心管中，使组织体积达到10 ml刻度线（约10 g组织）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绒毛膜板（CP）组织的解剖
	<ol>
		<li>机械性去除胎盘胎儿面上的羊膜（非羊膜囊），保留绒毛膜绒毛部（即绒毛膜板）完整。</li>
		<li>从绒毛膜板上切取约1 cm宽、0.5 cm深的组织块。优先从靠近脐带区域、远离胎盘边缘处采集绒毛膜板组织。</li>
		<li>在解剖过程中，将组织块放入含有HBSS的培养皿中，以保持其湿润。</li>
		<li>转移足够量的组织至50 ml离心管中，使组织体积达到10 ml刻度线（约10 g组织）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绒毛（CV）组织的解剖
	<ol>
		<li>在已去除绒毛膜板（CP）的胎盘组织区域，解剖获取约1 cm2 × 0.5–1 cm深的绒毛组织（CV）。同样，优先从最靠近脐带、远离胎盘边缘的区域采集CV组织。尽量保持距胎盘母体面（含基蜕膜组织）至少1 cm的距离；目标是从胎盘绒毛组织内部获取组织。</li>
		<li>在解剖过程中，将组织块放入含有HBSS的培养皿中，以保持其湿润。</li>
		<li>转移足够量的组织至50 ml离心管中，使组织体积达到10 ml刻度线（约10 g组织）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>D、CP和CV胎盘组织的剪碎与酶消化
	<ol>
		<li>将分别含有约10 g D、CP或CV组织的三个50 ml离心管中各加入约40 ml HBSS，反复倒置混匀以洗涤组织（重复约10秒）。</li>
		<li>倾去上清液，并重复洗涤2–3次，直至溶液基本无血。倾倒上清时使用10 ml移液器或长镊子，确保组织块不随液体丢失。</li>
		<li>将组织块转移回10 cm培养皿中，尽量减少液体转移。用剪刀或刀片将组织剪切成约1–5 mm3的小块。</li>
		<li>将剪碎后的组织重新转移至相应标记（D、CP或CV）的50 ml离心管中。</li>
		<li>加入新鲜配制的消化液，其体积至少与组织体积达到1:1比例（例如，10 ml组织加10 ml消化液）。盖紧管盖后反复倒置数次以充分混匀。</li>
		<li>将含组织和消化液的离心管于37 °C孵育1–2小时。此步骤无需加湿环境或5% CO2。 
		注：为有效解离细胞并最大化MSC产量，需进行快速振荡。若产量有限，则48小时后培养瓶中贴壁细胞极少，且首次传代时间超过1–2周。孵育时间和振荡方式取决于实验室所用37 °C培养箱的性能，可能需要优化。
		<ol>
			<li>若培养箱具备快速且可调控的振荡装置，可将组织与消化液置于50 ml离心管或无菌锥形瓶中，放入培养箱并设定振荡速度为250 rpm，可在1小时内完成完全消化。</li>
			<li>若培养箱仅有轻微摇动或无摇动功能，则需每30分钟手动剧烈振荡离心管10秒，持续1.5至2小时。酶孵育期间可处理废弃物、清理生物安全柜内不必要的物品、更换污染的实验服，并准备下一步操作。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单个核细胞的收集与接种至培养瓶 
	注：从前一步骤中可获得三个含正在消化组织的50 ml离心管（分别对应D、CP或CV）。当组织消化液呈现浑浊外观且组织中可见白色血管结构时，表明消化已完成。
	<ol>
		<li>向每管中加入30 ml含FBS的MSC培养基，以终止消化液中的酶活性。</li>
		<li>为分离单个核细胞与未消化的大块组织碎片，对50 ml离心管进行瞬时离心。短暂启动离心机，使其达到340 × g并运行5秒后停止。此操作可使大块碎片沉淀至管底，而单个核细胞仍保留在液体悬液中。 
		注：若仅进行短暂（瞬时）离心，单个核细胞将保留在液相中。若离心时间延长，单个核细胞也会与组织碎片一同沉淀，导致不必要的细胞损失。</li>
		<li>收集含有单个核细胞的上清液，用移液器将其转移至新的50 ml离心管中。</li>
		<li>向剩余的胎盘组织碎片中加入30 ml培养基或HBSS，并剧烈振荡。此举可使残留的已解离单个核细胞进入悬液，从而实现对潜在MSC的第二次收获。</li>
		<li>对离心管进行第二次瞬时离心，并再次将上清液转移至新的50 ml离心管中。重复此步骤第三次，以最大化从每种组织来源中收集单个核细胞的效率。</li>
		<li>将每种组织类型的上清液分别合并至两个50 ml离心管中，共得6管（D、CP和CV各两管）。每管于340 × g离心5分钟，使单个核细胞沉淀至管底。</li>
		<li>小心倾去或用移液器吸走上清液至废液容器中。无需试图完全去除每一滴上清液。 
		注：由于含有大量红细胞，细胞沉淀较为脆弱。若直接从50 ml离心管中倾倒上清液，需特别小心，避免误弃沉淀。</li>
		<li>去除大部分上清液后，用手指轻弹离心管数次，使细胞沉淀松动。将沉淀合并，使D、CP或CV组织各自对应一个离心管，然后分别用35 ml MSC培养基重悬细胞。</li>
		<li>可选：将单个核细胞组分通过安装在50 ml离心管上的100 µm孔径细胞滤网过滤，以去除细胞团块或纤维状物质。 
		注：操作需谨慎，因滤网易堵塞或过满。此外，气泡可能阻碍滤液排出。若发生此情况，可缓慢提起滤网使其下方通气，或用细胞培养基冲洗滤网，或更换新滤网。省略过滤步骤似乎不会影响后续MSC培养的产量或质量。
		<ol>
			<li>可选地，&#160;在此阶段可进行红细胞（RBC）裂解或密度梯度离心15。然而，我们的经验表明红细胞不会干扰MSC的贴壁或增殖，因此无需进行RBC裂解。若进行了RBC去除操作15，可在本步骤对单个核细胞进行计数。但需注意，此时绝大多数细胞并非MSC，而是来源于胎儿的滋养层细胞、内皮细胞和造血细胞，以及来源于母体的造血细胞和蜕膜基质细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将每种D、CP或CV组织的细胞悬液分别接种至一个T175培养瓶中，在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离后细胞扩增
	<ol>
		<li>在初次分离后48小时，从各培养瓶（D、CP和CV）中更换培养基，弃去原培养液并加入35 ml新鲜MSC培养基。弃去的培养液及未贴壁细胞可丢弃，因推测潜在MSC已贴附于组织培养瓶表面16。将培养瓶放回培养箱继续培养24小时。</li>
		<li>再培养24小时后，用DPBS（25 ml）清洗培养瓶两次，以去除碎片和红细胞。轻轻晃动液体使其覆盖瓶底，以松动红细胞。用移液器吸除液体和碎片。向培养瓶中加入35 ml MSC培养基，放回培养箱继续培养。</li>
		<li>每周更换培养基两次，持续培养至细胞单层达到80–90%融合度。初始扩增阶段通常需要4–14天，具体时间取决于组织质量、起始材料量以及消化液孵育的效率和时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. pMSCs 的传代培养
<ol>
	<li>当细胞培养物达到 80–90% 汇合时，用 20 ml 1× HBSS 或 DPBS 洗涤两次，弃去洗涤液。向每瓶中加入胰蛋白酶替代物（即 使用5 ml处理T175培养瓶。</li>
	<li>将培养瓶在 37 °C 下孵育 5 分钟，以使间充质干细胞从组织培养表面解离。每隔约 2 分钟轻敲培养瓶侧面，以促进细胞脱落。</li>
	<li>当细胞从培养表面脱离并形成单细胞悬液时，用MSC培养基冲洗培养瓶，并将细胞收集至离心管中。MSC培养基可稀释并灭活胰蛋白酶替代物（每T175培养瓶使用约15 ml MSC培养基）。</li>
	<li>将每个组织培养瓶中的内容物转移至50 ml离心管中。</li>
	<li>以 340 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml MSC培养基中。</li>
	<li>将10 µl细胞悬液与10 µl台盼蓝稀释。使用血细胞计数板计数细胞，并计算细胞总数 15.</li>
	<li>将细胞以每平方厘米1,150个细胞的密度传代至新的培养瓶中2 在新鲜的MSC培养基中重悬，并置于组织培养孵箱中孵育。以该接种密度，将200,000个MSC接种至每个新的T175培养瓶中，每瓶加入35 ml MSC培养基。每周换液两次，直至细胞融合度达到80–90%。后续传代时接种密度为1,150个细胞/cm²。2 或每瓶T175培养瓶接种200,000个MSC。</li>
	<li>当第1代（P1）或第2代（P2）细胞达到汇合状态时，将大部分细胞冻存以备后续使用，仅重新接种一个T175培养瓶用于进一步传代和鉴定。扩增后的细胞可用于第3代（P3）或第4代（P4）的中胚层分化实验及流式细胞术鉴定。 
	注意：在早期传代过程中，可能仅有少量分散的克隆集落，但每个集落内部的局部细胞密度可能非常高。这种情况并不理想，因为细胞的局部密集排列会导致接触抑制，延缓细胞生长并降低培养效果。我们建议在观察到密集集落时，应及时收获细胞并重新接种至新的培养瓶中。这一重新分布过程可为细胞提供充足的增殖空间，从而整体提升培养性能。</li>
	<li>为冻存间充质干细胞（MSC），收集约 1 x 106 细胞用1 ml含90% FCS和10%二甲基亚砜（DMSO）的冻存液重悬，按标准程序冻存。 
	注意：在代表性结果部分，描述了使用流式细胞术对三种不同扩增细胞群（D、CP 和 CV）进行的间充质干细胞表征、中胚层分化以及XY FISH分析以确定其性别。在本研究中，胎盘来源于男婴，因此所有胎儿细胞均可被识别为男性（含Y染色体），而所有母体细胞均可被识别为女性（仅含X染色体）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

胎盘是一个体积较大的母胎器官，可从中分离出胎儿或母体的间充质干细胞（MSC）22。本文详细介绍了胎盘的解剖结构，并说明了如何特异性地分离蜕膜（母体）、绒毛膜绒毛（胎儿）和绒毛膜板（胎儿）组织（步骤2.2–2.4）。随后，我们概述了一种可靠的方案，可用于从上述三种组织中分别分离间充质干细胞（步骤2.5–2.6）。胎盘来源的间充质干细胞扩增效率高，其培养形态与骨髓来源的间充质干细胞相似（图3 和 图4）。成骨分化效果稳定（图5B），而脂肪分化效率通常较低（图5C）5。
许多刚进入该领域的研究人员会认为，所获得的培养物&#160;从胎儿绒毛或绒毛膜板组织中分离的细胞将富集胎儿间充质干细胞（MSC）。然而，据我们观察，当使用标准的MSC扩增培养基（如DMEM-LG + 10% FBS）时，胎儿细胞的富集仅为暂时性 5此处我们以男婴胎盘组织为例提供代表性结果。使用男婴的胎盘组织，可轻松识别具有XY染色体的胎儿细胞，而母体细胞则可识别为具有XX染色体。 图6 显示一个代表性培养物的XY FISH结果。尽管来自胎儿绒毛膜绒毛或绒毛膜板组织的初始培养物中富含胎儿间充质干细胞（XY）（可达80%），但这些培养物会迅速被（约100%）&#160;在前两次传代中，母源（XX）间充质干细胞在由DMEM-LG加10% FBS组成的常规培养基中，少数来自母体的间充质干细胞污染了胎儿组织，并在培养中胜过胎儿来源的细胞。
本方案中一个关键步骤是理解胎盘解剖结构，并明确胎儿组织和母体组织最有效的取材部位。如代表性结果部分所述，分离胎儿组织确实能够实现胎儿来源间充质干细胞（MSC）的短暂富集。通过添加特定的外源性生长因子以优化扩增培养基配方，应可实现对胎儿来源MSC群体的选择性扩增，从而制备出富集胎儿细胞而非母体细胞的细胞产品（本课题组目前正在开发此类培养基配方）。制备胎儿MSC群体可能具有多项优势，据称胎儿MSC在血管生成能力和免疫抑制特性方面均优于相应的母体MSC群体37。
在所述的每种分离方案中，我们均使用了约 10 g 组织。一个完整的胎盘通常重 500–750 g，而在先前的研究中，我们已证明通过自动化组织消化及细胞扩增生物反应器工艺，单个胎盘可制备超过 7,000 剂临床级细胞4。这些数据凸显了胎盘来源的间充质干细胞在同种异体间充质干细胞治疗中的潜在适用性，也表明无论间充质干细胞来源于胎儿或母体，该方法均具有重要意义。从治疗角度来看，最关键的是使用者必须充分了解细胞产品，并具备稳定生产该细胞产品的能力。我们希望本视频能够帮助研究人员理解胎盘解剖结构，掌握从胎盘中分离间充质干细胞的技术，并预判其培养物中可能含有的胎儿或母体细胞组成。

间充质干细胞/基质细胞（MSC）正成为细胞治疗领域极具前景的候选细胞1。大多数应用旨在利用MSC介导的组织修复或免疫调节作用2。在许多此类应用中，同种异体MSC的效果可能与自体MSC相当3。使用同种异体MSC具有经济优势，因其可从单一来源组织大规模生产多个剂量的细胞，从而用于治疗大量患者4。
历史上，临床前和临床研究均采用骨髓来源的间充质干细胞 4骨髓通常从志愿者供体的髂嵴采集。该过程具有侵入性，且单次穿刺仅能采集少量骨髓（约20 ml）。要获得具有临床意义数量的间充质干细胞（MSC），需要进行 extensive 体外 扩增。细胞多能性随传代次数增加而降低 3，从而产生一个悖论：细胞群体扩增得越多，理论上达到临床疗效所需的细胞数量反而增加。与骨髓抽吸物相比，足月胎盘是一种物理体积较大的起始组织（通常为500–750 g） 4），可在剖宫产期间无菌采集，对供体无任何风险。来源于胎盘的间充质干细胞具有长期增殖能力 5 免疫调节能力 6，优于骨髓来源的间充质干细胞。在之前的一项研究中，我们证明单个胎盘所含的间充质干细胞足以用于制备多达7,000剂临床用量 4这些特性使胎盘成为制造同种异体间充质干细胞的理想来源组织。
胎盘是一种母胎器官，由胎儿组织和母体组织共同构成7，因此理论上可以分离出来源于胎儿或母体的间充质干细胞（MSC）。以下参考文献提供了关于人胎盘及其附属结构的发育与病理、以及显微和大体检查的详细信息8,9。胎盘本体主要由胎儿血管以及称为滋养层细胞的分泌和支持细胞组成，形成绒毛膜绒毛，其表面覆盖有丛密绒毛膜（板）8。分支状的胎盘绒毛浸泡在由子宫螺旋动脉输送来的母体血液中，从而实现胎儿与母体之间的营养物质、激素和气体交换。胎盘通过母体的蜕膜基质细胞锚定于子宫内膜，而胎儿来源的绒毛外滋养层细胞则散布于细胞外基质中8。绒毛汇聚至胎儿侧的绒毛膜板，在此处&#160;形成脐带8。
首届胎盘来源干细胞国际研讨会（2008年）的一项成果是认识到有必要对人足月胎盘来源细胞的分离与鉴定进行标准化 10由于胎盘的解剖结构复杂，组织分离、间充质干细胞（MSC）的提取以及预期的培养结果对于该领域的新手而言可能具有较大挑战。本方案详细描述了胎盘绒毛组织的采集、MSC的分离与扩增过程，并通过流式细胞术对MSC进行表征分析。 体外 分化被视为常规操作 5,11-13，因此此处仅作简要描述。
正如最近一项系统性文献综述14所强调的，从胎盘绒毛膜绒毛中获得的间充质基质细胞（MSC）通常被认为是胎儿来源的。然而，仅有18%的研究检测了所获得MSC的来源，而在这些研究中，仅一半报告为胎儿MSC，另一半则报告为母体或混合来源的MSC群体。本文所述的三种组织成分（绒毛膜绒毛、绒毛膜板和底蜕膜）主要由胎儿膜/绒毛构成，同时含有少量附着于娩出后胎盘上的子宫来源母体细胞。我们提供的数据表明，如果目标是获取母体MSC，则应选择从胎盘的母体面而非胎儿面分离MSC，这与我们先前的报道一致5,11，且是更为合适的起始材料。本方案还描述了使用XY荧光原位杂交（FISH）技术来验证细胞培养物中细胞的胎儿或母体来源。尽管该方法为制造商提供的标准操作流程，但此类分析常被忽视，其重要性也常被低估14。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>长名称：Hanks平衡盐溶液</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>胰蛋白酶替代物</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>长名称：TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基-低葡萄糖</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基-高葡萄糖（4.5 g/L）</td></tr><tr><td>PBS（无Mg²⁺和Ca²⁺）</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>长名称：无镁无钙杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>抗-抗-</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>长名称：抗生素-抗真菌素溶液 ×100</td></tr><tr><td>多聚甲醛粉末或4%溶液</td><td>任何&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&amp;nbsp;</td><td>2,500 U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml&amp;nbsp; 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&amp;nbsp;</td><td>10 mg/ml（水溶液，20,000 U/ml）</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一次性用品：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Falcon 或任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿，无菌塑料（直径 25 cm 和 10 cm）</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网（100 &amp;mu;m)</td><td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 和 75 厘米&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; T175 和 T75 组织培养瓶</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml、10 ml、25 ml 无菌血清移液管</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;离心&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;组织培养箱 37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;无菌剪刀和镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>试管架&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器助吸器或同等产品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gilson 型移液器及无菌吸头 1,000 &amp;micro;升，200 &amp;micro;升，20 &amp;micro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床或振荡培养箱（37 &amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>个人防护装备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>清洁溶液（适用于血液）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>废物容器，用于组织/血液的正确处置垃圾桶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于间充质干细胞表征的试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗体（克隆编号）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;制造商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;同型对照&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CD73（AD2）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>小鼠 IgG1</td></tr><tr><td>CD105（43A4E1）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>小鼠 IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>小鼠 IgG1</td></tr><tr><td>CD45（5B1）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>小鼠 IgG2a</td></tr><tr><td>CD34（AC136）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>小鼠 IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>小鼠 IgG2a</td></tr><tr><td>CD31（PECAM-1）</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>小鼠 IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>小鼠 IgG1</td></tr><tr><td>CD44（DB105）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>小鼠 IgG1</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;同型对照（克隆编号）&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;制造商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IgG1同型对照（IS5-21F5）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 同种型（IS5-21F5）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IgG1同型对照（IS5-21F5）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a（S43.10）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a（S43.10）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>MACS 缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;成骨分化&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;制造商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔培养基-高葡萄糖（4.5 g/L）</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>抗-抗-</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>长名称：抗生素-抗真菌素溶液 ×100</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;甘油磷酸</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>茜素红S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>用于钙基质染色</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;脂肪细胞分化&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;制造商&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基-高葡萄糖（4.5 g/L）</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>抗-抗-</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>长名称：抗生素-抗真菌素溶液 ×100</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>油红O溶液</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td><td>用于脂滴染色</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;XY FISH试剂盒用于确定细胞的胎儿或母体来源&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY染色体FISH试剂盒</td><td>Vysis（Abbott Molecular）</td><td>07J20-050</td><td>长名称：CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen 直接标记荧光DNA探针试剂盒</td></tr></tbody></table>

人胎盘组织来源的间充质干细胞/基质细胞的分离与扩增

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

间充质干细胞/基质细胞（MSC）是细胞治疗中极具前景的候选细胞。在大多数情况下，治疗反应似乎与细胞剂量相关。人足月胎盘富含MSC，且是一种体积较大的组织，通常在出生后被丢弃。胎盘是大规模生产多种同种异体MSC细胞剂量的理想起始材料。胎盘是一种母胎器官，可从中分离出胎儿或母体组织。本文描述了胎盘的解剖结构以及分离蜕膜（母体）、绒毛膜绒毛（胎儿）和绒毛膜板（胎儿）组织的操作步骤。该方案随后概述了如何从各个分离的组织区域中获取MSC，并提供了来自不同类型组织的扩增MSC的代表性分析结果。这些方法旨在用于临床前MSC的分离，但也已被改进并应用于临床级胎盘MSC的制备，以供人类治疗使用。

胎盘间充质干细胞的分离流程总结见图1。用于分离间充质干细胞的胎盘解剖结构的三个区域在图2中进行了标注，分别为母体蜕膜，以及主要来源于胎儿的绒毛膜板和绒毛组织。许多教科书、文献和在线资源详细描述了各种胎盘组织的发育过程及其功能作用（详见参考文献8）。
分离组织碎片后 48 小时的培养物形态。 
培养 48 小时后，间充质干细胞（MSCs）会贴附于组织培养塑料表面，而红细胞（RBCs）及大多数其他细胞碎片则不会贴附。此时必须更换培养基，加入 35 ml 新鲜培养基。在更换培养基之前，由于存在大量红细胞，会阻碍观察，难以进行精确评估。不同胎盘供体来源的培养上清液外观可能存在显著差异。这种差异在示例 1 和示例 2 中肉眼可见（图 3A）。这两个间充质干细胞分离样本虽来自不同的胎盘且初始外观差异明显，但经过洗涤后，两者的培养物形态趋于相似（见洗涤后示例 3，图 3A）。
在显微镜下，经过48小时的培养基更换后，仅有少量细胞会贴附于培养瓶上（图3B），且这些细胞的形态将明显不同于扩增程度更高的间充质干细胞（MSCs）。部分碎片和红细胞（RBCs）将以悬浮或聚集成团的形式存在，但不会干扰MSCs的生长。贴附于培养瓶底部的较长的成纤维细胞样细胞可能为多种细胞的混合物，包括间充质干细胞、造血细胞、滋养层细胞或内皮细胞。同样，非MSC细胞不会影响MSC培养物，因为在MSC培养条件下，这些细胞通常无法存活超过1-2代。尽管初始培养物的形态可能存在一定差异，后续的扩增结果通常具有一致性。
MSC 培养物随时间变化的形态学特征 
在此代表性示例中，分离后七天可见少量成纤维细胞样间充质干细胞（MSC）集落，但也可观察到圆形或 loosely attached 的非MSC细胞（图4A). 贴壁细胞即最初所称的“成纤维细胞集落形成单位”（CFU-F） 17 并随后称为 MSC 18. 分离后第13天，成纤维样MSC集落已显著增大（图 4B）。此时，单层细胞通常会达到 80–90% 的融合度，应进行传代。从第 2 代开始，胎盘间充质干细胞单层在融合时将形成特征性的漩涡状形态（图4C。除非以低密度传代细胞，否则将不再观察到CFU-F的形成。在低密度下，胎盘来源的间充质干细胞比成人骨髓来源的间充质干细胞形态更小、更呈方形。 1尽管胎盘来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞具有相似的增殖速率，但胎盘来源的细胞更不易发生快速衰老。 5.
胎盘间充质干细胞的表征 体外 
每个扩增的细胞群体都必须进行表征，以确保其符合标准的间充质干细胞（MSC）标准 16包括：（1）塑料培养皿黏附性；（2）表达间充质表面标志物且不表达造血表面标志物；（3）具有中胚层分化潜能。
胎盘间充质干细胞具有贴壁生长特性。 
如图4所示，培养中的间充质干细胞可贴附于塑料培养表面，并呈现成纤维细胞样形态；这证实细胞符合定义间充质干细胞的第一个标准16。
胎盘来源的间充质干细胞表达间充质表面标志物。 
间充质干细胞的第二个定义性特征是表达间充质表面标志物，同时不表达造血表面标志物16。由于目前尚无单一标志物能够明确鉴定间充质干细胞，通常需联合使用一组标志物，并结合流式细胞术分析，以确认细胞具有间充质来源但无造血来源的特性。在本研究提供的代表性数据集（图5A）中，我们检测了细胞对间充质标志物CD73、CD105、CD90、CD146和CD44，造血标志物CD45和CD34，以及HLA-DR和内皮细胞标志物CD31的表达情况。本胎盘间充质干细胞表征过程中所使用的所有抗体均列于材料/设备表中。染色操作按照制造商说明书进行，分析方法详见文献19。
细胞对间充质标记物 CD73、CD105、CD44 呈阳性，对细胞表面标记物 CD45、CD34、HLA-DR 和 CD31 呈阴性，符合预期5,20。在我们的代表性数据集中，约有 37% 和 57% 的细胞分别对 CD90 和 CD146 呈阳性21。CD90 和 CD146 均为常用的间充质干细胞（MSC）标记物21。MSC 的细胞表面标记物谱可能因 MSC 的组织来源、培养基成分或传代次数的不同而有所差异22。根据我们多年的实践经验，胎盘来源的 MSC 在经过 1–2 次传代后，未观察到与非间充质细胞的长期污染5,11。
胎盘间充质干细胞具有间充质分化潜能 
根据定义，MSC 必须具备 体外 中胚层分化能力 5,13. 间充质分化潜能通常通过三系或双系分化检测来评估。双系分化检测一般评估成骨和成脂分化能力，而三系分化检测 additionally 评估成软骨分化能力。在本文展示的代表性结果中，我们显示扩增后的 MSC 群体形成了钙沉积物，提示成骨分化，以及脂质空泡，提示成脂分化（图5B).
为表征本文报道的间充质干细胞（MSC）群体，我们将细胞以每毫升诱导培养基中6 × 104个细胞的密度接种至24孔培养板中。培养基组分详见材料/设备表。尽管诱导培养基配方在文献中较为常见，但已发表的配方存在较大差异。因此，我们在此简要列出所用的诱导培养基配方及染色方法。成骨诱导培养基包含DMEM-HG、10% FBS、1×抗生素-抗真菌溶液、10 mM β-甘油磷酸钠、100 nM地塞米松和50 μM L-抗坏血酸-2-磷酸。成脂诱导培养基包含DMEM-HG、10% FBS、1×抗生素-抗真菌溶液、10 μg/ml胰岛素、100 nM地塞米松、200 μM吲哚美辛和500 μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。培养物置于37 °C、5% CO2的培养箱中，培养14天。在培养期间，每星期更换两次诱导培养基。诱导14天后，根据我们先前发表的方法5对培养物进行骨样基质（成骨）或脂滴（成脂）的鉴定。成骨钙基质沉积分析通过以下步骤完成：首先吸除培养基，用4%多聚甲醛固定20分钟，用DPBS洗涤单层细胞，然后按照制造商说明书使用茜素红S染色。成脂诱导的评估方法为：吸除培养基，用4%多聚甲醛固定20分钟，洗涤单层细胞，然后按照制造商说明书使用油红O溶液染色。染色后的钙沉积物和脂滴通过光学显微镜观察，并保存图像以供后续参考。
在先前的出版物中，我们已更全面地表征了胎盘来源的间充质干细胞（MSC）的分化潜能4,5。胎盘来源的MSC成骨分化能力与骨髓来源的MSC相似，而其成脂分化效率通常较低5。尽管我们此前已报道过胎盘来源MSC的软骨分化能力5，但出于多种原因，我们通常不常规进行软骨分化实验。首先，虽然中胚层分化能力是MSC的定义性特征之一，但其重要性可能居于次要地位23-25，尤其是在MSC的治疗作用主要来源于其旁分泌因子的情况下26。其次，尽管Dominici et al. 提出了人成体骨髓来源MSC临床制备的最低标准16，但近年来的研究表明，来自不同微环境的MSC具有不同的内在特性和分化潜能5,13,27-32。事实上，Parolini et al. 提出，胎盘来源的MSC应被定义为能够分化为“一种或多种中胚层”谱系，而非必须具备全部三种谱系的分化能力10。最后，许多MSC研究未包括软骨分化实验，因为该过程与成骨分化共享相似的细胞内信号通路（TGFβ家族通路）33-35。
采用该培养方法时，尽管起始材料在解剖学上位于胎盘，但所获得的胎盘间充质干细胞来源于母体。 
许多出版物认为，从胎膜分离的细胞经培养后可获得胎儿间充质干细胞 14然而，正如我们先前所报道的那样 5所有使用本方案从胎盘绒毛膜获得的培养物，均会迅速富集母源间充质干细胞，这与母体蜕膜间充质干细胞培养的预期结果一致。在这些代表性结果中，我们采用了来自男婴的胎盘组织，以便能够清晰区分扩增细胞群体中胎儿与母体细胞的贡献。在本研究中，我们使用了下述列表中的XY FISH试剂盒 材料/设备清单，并遵循制造商的说明。
在所提供的代表性数据中，源自母体蜕膜的细胞培养物在第0代时约含90%的母体细胞（XX）和约10%的胎儿细胞（XY）（图6）。至第2代时，源自母体组织的细胞群体几乎为100%的母体细胞（XX），胎儿细胞（XY）已无法检测。这表明，通过物理分离母体组织，可在后续培养中富集母体细胞。然而，必须关注来自胎儿绒毛膜绒毛及绒毛膜板的培养结果。在第0代时，胎儿绒毛膜绒毛和绒毛膜板来源的培养物中约85%为XY型细胞，即来源于胎儿，说明靶向分离实现了胎儿细胞的富集（图6）。在第0代时，这两种培养物中均含有约15%的母体细胞（XX）污染。令人意外的是，在第2代时，两种胎儿来源的培养物中均几乎完全由母体细胞（XX）占据，而胎儿细胞（XY）已不可检测。XY荧光原位杂交（FISH）分析显示，母体细胞（XX染色体）会迅速且一致地取代源自胎儿绒毛组织的培养物。这一关键的培养现象常被忽视5。本方案中包含此项分析的详细信息，因其揭示了一个极为重要的现象：当使用添加10% FBS的DMEM培养基而未添加支持胎儿来源细胞群体的额外因子时，母体细胞会迅速占据所有培养体系。
<img alt="MSC 分离步骤示意图；组织处理、酶消化和细胞培养结果。" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：胎盘间充质干细胞（MSC）分离流程概要。（步骤 1）熟悉胎盘的解剖结构。（步骤 2）使用剪刀从蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板中手动分离约 10 g 组织。（步骤 3）用剪刀或解剖刀将分离的蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板组织切成细小碎片。 
（步骤 4）通过使用中性蛋白酶（dispase）和胶原酶 I 消化 1–2 小时，从细小组织碎片中释放细胞。 
（步骤 5）通过脉冲式离心和/或经细胞筛过滤洗涤，将细胞与纤维组织分离。收集细胞后重悬于培养基中，并接种至培养瓶中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
间充质基质细胞（MSC）将根据其贴壁生长的特性和在培养基中存活与增殖的能力进行筛选。最后，在结果部分，扩增后的MSC可被鉴定并储存，以用于后续实验。
<img alt="显示蜕膜、绒毛、绒毛膜板组织切片的胎儿和母体胎盘示意图。" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：人类足月胎盘的解剖结构及本实验中分离的组织。 首先获取的组织是母体蜕膜。蜕膜是在胎盘从子宫壁脱落之后，仍以薄层形式附着于胎盘表面的组织（蜕膜由绿色标记标示）。从胎盘内部获取的第二种组织是胎儿绒毛（蓝色标记）。第三种获取的组织是胎儿绒毛膜板（红色标记）（改编自参考文献36）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血液样本培养瓶，未洗涤与洗涤后；洗涤后细胞比较，显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：分离后48小时并去除组织碎片后的培养物形态。 (A洗涤去除碎片前，不同胎盘供体的培养上清液外观可能存在显著差异。示例培养物1和2展示了这种差异。这两个分离操作是同时进行的，但来源于两个不同的胎盘。洗涤后的培养物将清除红细胞和组织碎片，如示例3所示。后续的扩增结果通常具有一致性。B48小时换液后，仅有少量细胞贴壁于培养瓶。比例尺 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养生长、传代记录、显微镜图像、细胞增殖与形态学研究" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：MSC培养物随时间推移的形态学变化。 (A分离后第7天，可见少量成纤维细胞样的MSC克隆，但同时也会存在非MSC细胞，表现为圆形或 loosely attached 的细胞。 (B) 分离培养13天后，成纤维细胞样的MSC集落已较大，常形成融合的单层，可进行传代。C从第2代开始，MSC单层细胞在汇合时将形成特征性的漩涡状形态。比例尺 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析细胞表面标志物；CD73、CD105；直方图显示表达结果。" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过流式细胞术鉴定间充质干细胞及其中胚层分化能力。（A）胎盘绒毛来源的间充质干细胞（MSC）经流式细胞术分析显示典型的MSC标志物表达谱，尽管这些细胞表面标志物的表达在各类人源MSC中均相似。每个直方图显示信号强度（x轴）与y轴上标准化细胞数（最大值的百分比）的关系。在此代表性数据集中，细胞对CD73、CD105和CD44呈阳性，而对造血细胞标志物CD45、CD34以及HLA-DR呈阴性。（B）胎盘来源的MSC通常可高效进行成骨分化，然而（C）其成脂分化效率可能低于骨髓来源的MSC。图注B和C中的图像放大倍数为40倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="MSC分布图；胎儿/母体；绒毛膜绒毛；柱状图；百分比；群体分析。" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：尽管起始材料的解剖位置属于胎儿组织，但采用本培养方法获得的胎盘MSC来源于母体。图中展示了从蜕膜、绒毛膜绒毛和绒毛膜板组织中分离的胎盘MSC培养物在每隔两代时，胎儿（男性，XY）和母体（女性，XX）细胞组成的定量结果。来源于胎儿绒毛组织的培养物中，母体细胞（XX）能够快速且可重复地占据主导地位。胎儿 = 男性 = 单个细胞中检测到XY染色体；母体 = 女性 = 单个细胞中检测到XX染色体。本图数据来自N = 3个独立供体胎盘（均为男婴），每个数据点至少对100个细胞进行XY荧光原位杂交（FISH）染色并计数。柱状图表示平均值，误差线表示一个标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文描述了从人类足月胎盘中分离胎儿和母体组织的方法，随后从这些组织中分离并扩增间充质干细胞/基质细胞（MSC）。

间充质干细胞/基质细胞（MSC）是细胞治疗中极具前景的候选细胞。在大多数情况下，治疗反应似乎与细胞剂量相关……

本实验的总体目标是从人胎盘组织中分离并扩增间充质干细胞。大家好，我是 Mike Doran，澳大利亚布里斯班市昆士兰科技大学转化研究所的一名课题组长。您好，我叫Rebecca Pelekanos，是昆士兰大学临床研究中心的一名研究人员。今天，我将演示间充质干细胞（MSC）的分离步骤。胎盘通常在出生后被丢弃。由于该组织重量为5至700克，可提供一种独特且丰富的同种异体间充质干细胞来源。通常，刚接触胎盘间充质干细胞分离的研究人员会面临困难，原因是他们不熟悉胎盘解剖结构、不了解组织处理方法，也不清楚最终的间充质干细胞培养物中将包含母体来源还是胎儿来源的细胞。为帮助研究人员，本视频将详细讲解这些关键问题。该操作流程的第一步是熟悉胎盘的解剖结构。第二步是使用剪刀从蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板中手动分离出10克组织。前两个步骤在此处以示意图形式再次概括。第三步，使用剪刀将蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板组织进一步剪切成细小碎片。第四步，通过使用dispase和胶原酶I消化一至两小时，从组织小块中释放细胞。第五步，通过细胞筛网洗涤，将细胞与纤维组织分离。随后收集细胞，重悬于培养基中，并接种至培养瓶中进行培养。间充质基质细胞（MSCs）将根据其贴壁生长的特性以及在细胞培养基中存活和增殖的能力进行筛选。最后，在结果部分，扩增后的MSC可被鉴定并储存，用于后续实验。胎盘是一种临时性器官，在妊娠期间介导胎儿与母体之间的营养物质和代谢废物交换。剖宫产手术后，在确保婴儿安全娩出的情况下，可轻松无菌采集胎盘。胎盘主要由胎儿来源的血管和膜组织构成，但也含有部分母体细胞。胎盘通过母体来源的子宫蜕膜细胞和胎儿来源的侵入性滋养层细胞与子宫相连。通常无法通过肉眼分辨母体组织与胎儿组织之间的精确界面。然而，胎盘的胎儿面很容易识别，即脐带所在的一侧。当婴儿娩出后，仅有一层薄薄的蜕膜组织仍与胎盘相连。通过胎盘的物理定位，可以确定今日将要采集的三种组织。首先采集的组织是母体蜕膜。绿色标记指向胎盘从子宫壁脱落后残留在表面的蜕膜组织。将从胎盘内部获取的第二种组织是胎儿绒毛膜绒毛，示意图中的蓝色圆圈标示了该部位。第三种需要采集的组织是胎儿绒毛膜板。该组织在图中由红色标记标示。好了，我们开始吧。将胎盘置于生物安全柜中。展开胎膜，并辨识胎盘的各个部分：包括有脐带附着的胎儿面、绒毛膜羊膜层或羊膜囊。胎盘的胎儿面在绒毛膜板上可见明显的粗大血管，并覆有羊膜，后者同样可轻易通过机械方法分离。母体面与胎儿面相对，具有明显的叶状或小叶状结构。确保母体面朝上。从胎盘或蜕膜的母体侧切取厚度为 0.5 cm 的组织块。在解剖过程中，将组织块放入含有汉克斯平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution，HBSS）的培养皿中，以保持组织湿润。用 HBSS 轻轻振荡培养皿中的组织，以去除部分血液。转移足够的组织，使其填充至50毫升离心管的10毫升刻度线处，约10克。注意，若在实验结束时需要更多细胞，此步骤可分离更多组织。确保胎盘的胎儿面朝上。从胎盘的胎儿面机械性去除羊膜，保留绒毛膜板完整。将绒毛膜板切成条状，深度约为下方绒毛组织半厘米。然后，从已去除绒毛膜板的部位向胎盘内部解剖约一厘米深的绒毛组织。将组织放入HBSS中，并参照之前的方法，量取大约10毫升的组织。用剪刀将组织块转移至10厘米的培养皿中（尽量减少液体转移），并剪成约1立方毫米大小的细小碎片。将剪碎的组织重新转移回50 mL离心管中。对所有剩余的组织样本重复上述步骤。加入新配制的消化液，其体积至少与组织体积相等。轻轻颠倒离心管数次以混匀。将组织置于管中，加入消化液，在37摄氏度的摇床培养箱中孵育一至两小时。当组织消化液变为浑浊外观，且溶液中可见明显的白色血管时，加入15毫升HBSS以稀释消化液中的酶。短暂脉冲离心样品，仅使离心机达到340 g，持续五秒，然后停止。这将迫使大块碎片聚集在管底。将样品放回生物安全柜中。将细胞滤网放入一个新的50毫升离心管中。将含有单个核细胞的上清液用移液管转移至滤器中，用新试管收集滤过液。将胎盘组织碎片残留在第一个试管中。向胎盘碎片中加入15毫升HBSS，剧烈振荡以回收更多细胞，然后对样品进行瞬时离心。再次用移液器将上清液转移至装有细胞筛的收集管中。根据样本的性状，将上清液直接倒入细胞筛可能更为合适。用5毫升HBSS冲洗细胞筛。弃去含有胎盘组织碎片的离心管。将上清液样品在340 g条件下离心5分钟，以沉淀细胞。红细胞可见为沉淀底部的一层，而单个核细胞（包括间充质干细胞）则位于红细胞层上方，呈较浅的上层。将样品放回生物安全柜中。小心倾倒上清液并弃去。用手指轻弹离心管数次，使细胞沉淀松动，然后将细胞沉淀重悬于 35 毫升 MSC 培养基中。将细胞悬液转移至每10毫克组织对应的一个T175培养瓶中，在37°C、5%CO2的培养箱中培养。分离后48小时更换培养基。每周换液一次，直至细胞融合。培养约14天后，细胞应达到汇合状态。最后，扩增并冻存细胞，分析间充质干细胞（MSC）特性，并用于后续实验。培养48小时后，间充质干细胞已贴附于组织培养塑料表面，而造血细胞及其他细胞群体则未贴附。此时，将培养基更换为35毫升新鲜培养基。不同胎盘供体的培养上清液外观可能存在显著差异。示例一和示例二展示了这种差异。这两项分离操作是同时进行的，但来自两个不同的胎盘。清洗后，培养物中已无红细胞和组织碎片，如示例三所示，后续扩增结果通常一致。在48小时换液后，仅有少量细胞贴附于培养瓶上。分离后7天，可见成纤维细胞样的MSC集落，尽管也存在非MSC细胞，表现为圆形或 loosely attached 的细胞。分离后13天，成纤维细胞样的MSC集落已较大，单层MSC常已达到足够汇合度，可进行传代。从传代开始，MSC单层在汇合时呈现出特征性的漩涡样形态。通过流式细胞术分析，胎盘来源的间充质干细胞（MSC）表现出典型的MSC标志物表达谱。这些细胞对CD73、CD105和CD90呈阳性，对造血细胞标志物CD45、CD34和HLA-DR呈阴性。胎盘MSC通常可发生强烈的成骨分化，但成脂分化能力较弱。许多出版物认为，从胎膜（绒毛膜）分离的细胞在培养后可获得胎儿间充质干细胞（MSC）。然而，正如我们先前所报道的，采用本方案从胎儿绒毛膜获得的所有培养物会迅速富集母源间充质干细胞，其表现与母源蜕膜间充质干细胞培养物一致。此处展示的数据量化了从蜕膜、绒毛组织及绒毛板组织中分离得到的胎盘间充质干细胞培养物中胎儿细胞与母源细胞的组成比例。观看本视频后，您应该能够较好地掌握如何分离和培养源自胎盘组织的间充质干细胞。我们希望这些方法对您在涉及胎盘来源间充质干细胞的研究和临床应用中有所帮助。

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