Name: 股骨窗口商会模型在体内手机跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学习使用股骨窗口室模型在小鼠骨髓中进行长期活体成像，追踪中性粒细胞在血管结构中的动态行为。该方法结合双光子荧光显微镜技术，为免疫学和肿瘤学研究提供关键动态信息。

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作者谨此感谢多伦多大学健康网络的先进光学显微镜设施（www.aomf.ca）在显微镜技术方面的协助，以及玛格丽特公主癌症中心机械车间的杰森·埃利斯先生（Mr. Jason Ellis）在制造WC和成像平台方面的工作。我们还要感谢艾里斯·库尔巴茨基博士（Dr. Iris Kulbatski）在稿件编辑方面的帮助。

注意：所有动物实验均在大学健康网络机构动物护理与使用委员会批准的方案 #2615 下进行。
1. 小鼠手术准备
<ol>
	<li>手术前，通过高压灭菌对所有手术器械和窗式植入腔室（WC）进行灭菌。术前2天，在小鼠饮水中添加50 mg/kg体重的阿莫西林。术前4小时，向小鼠腹腔注射0.1 mg/kg体重的丁丙诺啡。</li>
	<li>通过腹腔注射含有80 mg/kg氯胺酮和13 mg/kg赛拉嗪的350–400 μl生理盐水溶液，对裸鼠（athymic nude mouse）进行麻醉（注意：此步骤）&#160;经机构动物护理委员会批准，我们未发现任何不良反应。通过检测足部反射确认麻醉是否充分。在操作过程中持续观察呼吸模式、黏膜颜色及足部反射。</li>
	<li>在生物安全柜中进行手术操作，以维持手术过程中的无菌条件。将小鼠置于覆盖有手术巾的电热垫上，以维持其术中体温。所有手术操作均在体视显微镜下进行。</li>
	<li>手术过程中涂抹眼膏以保持眼睛湿润，必要时在手术过程中重复涂抹。依次使用7.5%聚维酮碘、70%异丙醇和10%聚维酮碘擦拭小鼠手术区域进行消毒，重复该过程两次。</li>
	<li>使用15号刀片的手术刀从外侧接近股骨，做一条10 mm的纵向皮肤切口。用镊子和止血钳进行钝性分离，在屈肌与伸肌之间暴露股骨，以确保肌肉功能的完整性。</li>
	<li>将U形杆插入骨下，并安装WC（图1用两个螺母将横杆与窗格固定，并用镊子拧紧螺母。在骨组织与WC之间填充牙科水泥。</li>
	<li>将皮质骨研磨至 6 x 2 mm2 使用微型钻在骨头上开孔，以获得对骨髓腔的光学通路。 
	注意：进行此操作时，需在显微镜下仔细观察皮质骨的变薄情况，保留一层完整且近乎透明的骨膜层。</li>
	<li>将8 mm盖玻片放置于窗口上，并用卡环固定盖玻片以保持其位置。</li>
	<li>使用镊子将屈肌和伸肌的肌肉组织复位至原始位置，以维持术后功能。使用5-0缝线和持针器缝合真皮层。</li>
	<li>监测小鼠恢复情况，直至其意识清醒并能自由活动。恢复后将动物放入新笼中。</li>
	<li>恢复后，于当日或之后数日对动物进行成像采集（参见第2节）。每日监测小鼠的生理状况。 
	注意：监测动物的生理状况，例如肢体负重情况、弓背、呼吸急促或浅表呼吸、后肢肿胀、自残行为、蜂窝织炎以及严重皮炎。</li>
	<li>术后给予布托啡诺（buprenorphine）0.1 mg/kg体重，腹腔注射，连续3天；美洛昔康（meloxicam）1 mg/kg体重，连续5天，以治疗术后疼痛和炎症。继续提供含阿莫西林的饮水5天。</li>
	<li>在实验终点，通过 CO2 麻醉后继以第二种方法（例如颈椎脱位</li>
</ol>
2. 使用多光子与共聚焦显微镜联用技术进行图像采集&#160;
<ol>
	<li>成像前，通过腹腔注射含有80 mg/kg氯胺酮和13 mg/kg赛拉嗪的350–400 μl生理盐水溶液麻醉小鼠。也可在条件允许时使用吸入性麻醉剂。涂抹眼膏。</li>
	<li>注射血管内染料混合物以标记血管系统（0.65 mg 的 2 MDa 荧光素（FITC）-葡聚糖）和中性粒细胞（4 μg 的别藻蓝蛋白（APC）-抗 Ly6G 抗体）。</li>
	<li>使用 upright 组合式多光子与共聚焦显微镜，配备波长范围为 705–980 nm 的多光子激光器用于双光子激发，以及可提供从蓝色到红色激发波长的单光子激光器。</li>
	<li>将定制的成像载物台放置到显微镜上（图1B用鳄鱼夹夹住钨丝（WC）的两端，将小鼠固定在载物台上。 
	注意：该装置的关键组件包括两个用于固定WC的鳄鱼夹，以及一个加热装置，用于在成像期间维持小鼠的生理温度（37 °C）。</li>
	<li>打开双光子激光器和共聚焦系统，通过点击启动图像采集软件 &#34;启动系统&#34;将打开一个包含 4 个选项卡（定位、采集、处理和维护）的窗口。</li>
	<li>设置成像通道。点击 &#34;智能设置&#34; 在“采集”选项卡下，选择用于成像的染料：FITC（488 nm 激发，493-588 nm 发射）和 APC（633 nm 激发，638-743 nm 发射）。选择 &#34;最佳信号&#34; 并点击 &#34;应用&#34;.</li>
	<li>手动添加二次谐波生成（SHG）图像采集通道。在下方打开双光子激光器 &#34;激光&#34; 采集选项卡中的窗口。在通道窗口下，单击 &#34;+&#34; 单击以添加轨道。</li>
	<li>设置SHG通道。在“Channels”窗口中，使用上下箭头将波长调整为840 nm，并选择检测范围为415–425 nm &#34;光路&#34; 使用滑动条调整窗口。</li>
	<li>点击 &#34;目镜在线&#34; 在“定位”选项卡下，点击FITC滤光片设置中的FITC，以查看目标区域，并通过转动显微镜侧面的调焦旋钮手动调节焦距。当找到目标区域后，点击 &#34;目镜离线&#34; 在“定位”选项卡下。</li>
	<li>单击采集选项卡。在通道窗口中选择 FITC 通道，然后单击 &#34;活体&#34; 使用5倍物镜预览FITC-葡聚糖的图像。如有必要，调整焦距，然后单击 &#34;停止&#34; 在“采集”选项卡中停止预览。</li>
	<li>手动旋转物镜上方的转轮，切换至20倍水镜。使用20倍物镜再次观察FITC-葡聚糖的图像，并在“通道”窗口下调节主增益（Master Gain）和针孔（Pinhole），以获得最佳信号强度与对比度。随后在“通道”窗口中选择APC和SHG通道，重复上述步骤。</li>
	<li>选择成像参数。单击 &#34;采集模式&#34; 打开其窗口，将帧尺寸设置为 1,024 x 1,024 像素，并采用 4 倍平均以获得高质量图像。</li>
	<li>获取二维图像快照。在“通道”窗口中选择所有通道，然后单击 &#34;快照&#34; 在“采集”选项卡下，检查图像质量，必要时调整成像参数。</li>
	<li>获取二维延时图像。
	<ol>
		<li>核对并标记完成 &#34;时间序列&#34; 在“采集”选项卡中打开时间序列窗口。在间隔处输入0，总扫描次数输入40，以连续采集40张图像且无时间间隔。 
		注意：40 次扫描以 7.5 秒/帧的扫描速度可生成约 5 分钟长的时间序列，图像尺寸为 600 μm × 600 μm。根据显微镜、图像采集设置及相机帧率调整扫描间隔和扫描次数。固定的时间间隔（&#62;0 秒）可用于比较在不同时间点获取的时间序列图像。根据实验条件下中性粒细胞（或其他目标细胞）的预期平均迁移速度，可能需要更长的时间序列成像持续时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取三维图像。
	<ol>
		<li>检查并确认 &#34;Z轴层扫&#34; 在“采集”选项卡中打开Z轴层扫窗口。启动 &#34;实时&#34; FITC-葡聚糖的预览模式。聚焦于样品顶部并点击 &#34;设置第一步&#34;，然后聚焦于样品的另一端并点击 &#34;设置最后&#34; 在Z轴堆叠窗口中。</li>
		<li>在Z轴堆叠窗口中将间隔设置为10 μm。根据上一步选择的第一和最后一个光学切片，将生成10-20个切片，总体光学厚度为90-180 μm。 
		注意：z轴步进间隔取决于针孔的大小，而针孔大小决定了光学切片的厚度。应将步进间隔设置为小于光学切片的厚度。</li>
		<li>点击 &#34;开始实验&#34; 在“采集”选项卡下开始收集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取三维延时图像。
	<ol>
		<li>核对完成 &#34;时间序列&#34; 和 &#34;Z轴扫描&#34; 在“采集”选项卡中打开时间序列和Z轴扫描窗口。</li>
		<li>按照步骤 2.14 和 2.15 中所述设置时间序列和 Z 轴层扫采集参数。点击 &#34;开始实验&#34; 在“采集”选项卡下开始采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像过程中需监测小鼠状态，确保其保持稳定且处于无意识状态。若小鼠在成像期间出现不稳定和/或意识恢复的情况，应立即将其从成像台上移出，经腹腔注射额外的100–150 μl麻醉溶液，随后继续成像。 
	注意：不稳定的迹象包括小鼠呼吸过快和身体运动，这些在采集的图像中可表现为位移伪影。</li>
	<li>图像采集完成后，将小鼠从成像台上取下并放回笼中。使用加热灯为其保温，并持续监测直至小鼠恢复意识。</li>
</ol>
3. 图像分析与定量
<ol>
	<li>使用图像分析软件分析三维和时间序列数据。打开软件后，通过将图像拖入名为 &#34;Arena&#34; 的视图界面来添加图像。双击图像文件以打开；图像将在 &#34;Surpass&#34; 视图下打开。</li>
	<li>生成二维/三维图像。
	<ol>
		<li>在右上角的 &#34;More&#34; 工具栏中，点击 &#34;Edit/ Show Display Adjustment&#34; 以打开 &#34;Display Adjustment&#34; 窗口。通过调整各通道的阈值来优化荧光显示，并拍摄快照以保存图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用延时图像生成目标轨迹。
	<ol>
		<li>在 &#34;Surpass&#34; 视图下打开待分析的图像。点击位于 &#34;Surpass&#34; 图标下方、显示为橙色圆点的图标，将打开一个新的 &#34;Spots&#34; 窗口。</li>
		<li>勾选 &#34;Track Spots (over Time)&#34;，然后点击蓝色箭头进入下一步。在 &#34;Source Channel&#34; 中选择包含待追踪目标的通道，并在 &#34;Estimated XY Diameter&#34; 中输入目标的估计直径。点击蓝色箭头进入下一步。 
		注：对于中性粒细胞追踪，应选择包含中性粒细胞 APC 荧光的通道，并根据已知的中性粒细胞大小将目标直径设为 12 μm。</li>
		<li>在窗口中，点击下拉箭头找到并选择 &#34;Quality&#34; 滤镜。观察软件定义的斑点，并手动调整阈值以包含或排除特定斑点。确定阈值后，点击蓝色箭头进入 &#34;Tracking&#34; 步骤。</li>
		<li>在算法（Algorithm）部分，点击下拉箭头找到并选择 &#34;Autoregressive Motion Algorithm&#34;。在参数（Parameters）部分，将 &#34;Max Distance&#34; 设为 10 μm，&#34;Max Gap Size&#34; 设为 3。勾选 &#34;Fill gaps with all detected objects&#34; 以开始追踪，然后点击蓝色箭头进入下一步。 
		注：&#34;Autoregressive motion algorithm&#34; 适用于具有定向运动的目标，因其基于先前运动预测位置来生成轨迹。&#34;Max Distance&#34; 和 &#34;Max Gap Size&#34; 可根据待追踪目标的预期尺寸和速度，以及延时图像的总时长进行调整。</li>
		<li>在滤镜类型（Filter Type）中，选择 &#34;Track Duration&#34; 滤镜。点击绿色箭头完成追踪，并检查生成的轨迹。如有必要，可返回上一步手动筛选轨迹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若生成的延时图像存在漂移，需校正平移漂移。
	<ol>
		<li>点击铅笔图标的按钮，该编辑选项卡将打开 &#34;Edit Tracks&#34; 窗口。检查延时图像，找出在整个图像序列中应保持静止的参考斑点。</li>
		<li>在屏幕左上角找到 &#34;Pointer&#34; 窗口，勾选 &#34;Select&#34; 以激活光标用于选择斑点。点击参考斑点。</li>
		<li>在 &#34;Edit Tracks&#34; 窗口中点击 &#34;Correct Drift&#34;。勾选 &#34;Translational Drift&#34;。软件将自动生成校正后的图像序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量延时图像中由目标轨迹定义的细胞运动。
	<ol>
		<li>在 &#34;Edit Tracks&#34; 窗口中，勾选 &#34;Tracks&#34;，并选择代表细胞运动的轨迹。所选轨迹将在时间序列图像中以黄色高亮显示。</li>
		<li>点击图表图标以打开 &#34;Statistics&#34; 窗口（统计选项卡）。</li>
		<li>在 &#34;Selection&#34; 中，点击下拉箭头选择 &#34;Track Speed Mean&#34;，以生成所选轨迹的平均轨迹速度。选择不同的轨迹并重复上述步骤，以测量所有感兴趣细胞的平均轨迹速度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

对骨髓中动态细胞过程进行实时、连续成像，能够获取使用传统技术（如组织学和全血计数）难以获得的信息。本文所述的股骨窗腔模型为随时间推移研究骨髓内的细胞和结构变化提供了独特的机会。尽管此前已有股骨窗腔模型的报道，但我们的新型设计具有更大的成像视野和更小的整体窗腔尺寸，更适合在成年小鼠中使用。该股骨窗腔模型可用于多种小鼠品系，包括免疫功能健全小鼠和/或转基因报告小鼠。
手术过程中有一些关键步骤，决定了成像的整体持续时间和质量。暴露股骨时，仅需对屈肌和伸肌之间的肌肉进行钝性分离；切除这些肌肉可能导致小鼠活动能力下降，必须避免。此外，对皮质骨的研磨操作必须谨慎进行。研磨约50 μm的厚度即可满足光学成像需求，同时保持股骨血管网络的结构完整性。在骨周围使用牙科水泥对于封闭手术暴露区域、防止液体积聚以及维持超过一个月的清晰光学成像窗口至关重要，同时还能降低感染风险。牙科水泥还可固定观察窗（WC），防止其围绕股骨旋转。最后，用于固定盖玻片的卡环适用于水浸物镜，可实现水密封。相比使用粘合剂将盖玻片固定到观察窗上，推荐使用卡环，因为添加粘合剂可能增加骨与盖玻片之间的间隙，或使盖玻片相对于成像平面呈轻微...

骨髓是参与造血和免疫调节的重要器官。它由含有造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的造血组分，以及含有可分化为间充质细胞的非造血祖细胞的基质组分构成1。三分之二的造血活动用于髓系细胞的生成2。特别是，骨髓中会大量生成中性粒细胞，在健康成人中每日可产生 1–2 × 1011 个细胞2。中性粒细胞是抵御微生物感染的第一道防线，在未受应激刺激时主要储存于骨髓中，当机体受到刺激时则被动员以补充外周血中的中性粒细胞1,3。除了抗菌作用外，近期研究表明中性粒细胞在肿瘤生物学中也发挥重要作用，其促瘤或抑瘤表型取决于肿瘤微环境中转化生长因子β（TGF-β）信号通路的状态4,5。此外，研究证实积聚在原发性肿瘤中的中性粒细胞可通过抑制T细胞的细胞毒性功能而发挥促肿瘤生长和促转移作用6,7，而循环中的中性粒细胞则表现出细胞毒性及抗转移效应8。因此，研究骨髓中的造血细胞，尤其是中性粒细胞，对于阐明其在免疫调节和肿瘤调控中的作用至关重要。
组织病理学检查和完整的外周血细胞计数通常用于评估骨髓中的细胞和结构改变9然而，这些方法仅能提供不同细胞群体或组织微结构的静态信息。纵向 体内 成像技术可与标准方法结合使用，以纵向评估多种细胞、血管和间质成分的动力学特征以及细胞间的相互作用。活体显微成像（IVM）是指以显微分辨率对活体动物进行成像10对于在同一样本中随时间评估动态细胞过程特别有用，可减少实验动物的使用数量。活体显微镜成像常与慢性移植的观察窗室（WC）结合使用，以实现对目标器官持续数周至数月的成像观察。颅骨窗和背侧皮肤折叠窗室模型应用历史最长，可追溯至20世纪90年代中期。近年来，已开发出其他器官特异性的窗室模型，如乳腺脂肪垫及多种腹腔器官的窗室模型。11.
成像骨髓的常用方法 体内 主要涉及暴露小鼠颅骨，此处骨质较薄，可在最小手术干预下直接观察单个细胞12-14然而，颅骨骨髓可能与其他骨骼（如长骨）的骨髓存在差异，颅骨中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）及缺氧细胞数量较低，表明其对HSPCs的维持和发育能力较弱15因此，研究人员已探索了评估长骨中细胞成分的替代方法，这些方法包括直接暴露股骨骨髓16 背侧皮肤折叠室中股骨节段的异位移植17然而，前者是一种终端性操作，无法实现对细胞、结构及功能变化的长期追踪；而后者则可能因将股骨移植至背侧皮肤皱襞窗室（WC）内的异位部位，干扰正常的骨髓功能。另一种可实现股骨骨髓原位连续成像的方法是在股骨上构建窗室（WC）。既往有研究报道，利用小鼠股骨窗室实现了对股骨骨髓微循环的长期成像。18此外，作者展示了对股骨中肿瘤细胞的可视化，表明该技术在监测骨髓转移方面具有应用价值。然而，这种WC设计存在尺寸较大（直径1.2 cm）和成像区域相对较小（直径4 mm）的局限性，仅适用于体重较大的小鼠（26–34 g，3–6月龄），因此在常规应用中实用性有限。
因此，为了本研究的目的，设计了一种整体尺寸更小而内部成像区域更大的新型骨窗（WC）。本研究的目标是提供一种用于成像股骨骨髓中多种细胞类型的方法。股骨骨窗模型为本实验室自主开发，可用于在三维血管网络中可视化并追踪中性粒细胞。利用该模型，可对骨髓进行长达40天的系列在体显微成像（IVM）。该方法可应用于多种研究领域，以阐明造血过程、免疫调控及肿瘤发生机制。

<table><tbody><tr><td>裸鼠 NRCNU-F 无胸腺裸鼠</td><td>Taconic</td><td>Ncr nude</td><td>8-10 周龄，雌性</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&amp;nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>手术巾</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>电热垫</td><td>Life Brand</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>眼膏（人工泪液凝胶）</td><td>Novartis&amp;nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% 聚维酮碘</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% 聚维酮碘</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄（#3）</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片（#15）</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>弯头弹簧剪</td><td>Fine science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>婴儿型 Mixter 止血钳</td><td>Fine science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>超精细 Graefe 镊</td><td>Fine science Tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-蚊式止血钳</td><td>Fine science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>微型钻机</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>微型钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>股骨观察窗室</td><td>PMCC 机械加工车间</td><td>定制设计</td><td>9.1 mm - 8.5 mm - 7.5 mm（外径至内径），2.16 mm（两孔半径），13.9 mm（两孔间距），0.7 mm（厚度）</td></tr><tr><td>U 形杆</td><td>PMCC 机械加工车间</td><td>定制设计</td><td>13.8 mm（长度），1.6 mm（宽度），3.7 mm（高度）</td></tr><tr><td>盖玻片（8 mm）</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>固定环（8 mm）</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC # 31163202</td><td></td></tr><tr><td>螺母（六角不锈钢）</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>缝合线（5-0 Monosof 黑色）</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Halsey 持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（Temgesic）</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康（Metacam）</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>阿莫西林（Clamavox）</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC-抗小鼠 Ly-6G（Gr-1）&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>双光子显微镜 LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>成像载物台</td><td>PMCC 机械加工车间</td><td>定制设计</td><td>15.9 cm（长度），11 cm（宽度），0.9 cm（高度）</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>在实验方案第 3 节中描述的图像分析软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>在实验方案第 2 节中描述的图像采集软件&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

股骨窗室模型 在体 内 小鼠骨髓中的细胞追踪

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

骨髓是一种复杂的器官，包含多种造血和非造血细胞。这些细胞参与多种生物学过程，包括造血、免疫调节和肿瘤调控。目前常用于研究骨髓内细胞活动的方法，如组织学检查和血细胞计数，仅能提供静态信息，难以捕捉多种细胞成分的动态行为。 体内为了补充标准方法，开发了一种基于窗式腔室（WC）的模型，以实现连续观察 体内 对小鼠骨髓中的细胞和结构进行成像。本方案描述了一种在股骨上植入骨窗（WC）的外科手术操作，以实现对股骨骨髓的长期光学观察。特别地，为展示其在实验中的应用价值，该骨窗技术被用于在股骨血管网络中成像并追踪中性粒细胞，从而提供了一种可视化和量化骨髓内免疫细胞迁移与调控的新方法。该方法可应用于研究小鼠骨髓中的多种生物学过程，如造血作用、干细胞移植以及在包括癌症在内的病理条件下免疫应答的研究。

采用窗式装置（WC）可成功获取小鼠股骨骨髓，从而实现对单个中性粒细胞及血管网络的可视化观察。图1展示了WC装置并描述了手术操作流程，包括暴露股骨、减薄皮质骨以获得骨内光学通路。该手术在小鼠中耐受性良好；术后5天内对小鼠进行了不良生理反应评估，包括后肢肿胀、患肢非负重、自残行为、蜂窝织炎和皮炎，以及WC装置损伤情况，均未发现痛苦或不适表现。值得注意的是，该窗式装置在长达40天内仍保持光学清晰，可用于干预后细胞与结构长期动态变化的活体成像分析。
骨髓内的血管系统可通过血管内染料（如FITC-Dextran）进行可视化图2）。由于对比度依赖于染料的注射，所获得的图像反映了具有足够血流的功能性血管系统。除了血管系统外，中性粒细胞也可被染色 体内 使用抗 Ly6G 抗体。 图3A 和 3B 代表在不同时间点观察...

该方案描述了一种新型的小鼠股骨观察窗模型，可用于追踪股骨骨髓中细胞的运动 体内活体多光子荧光显微镜用于随时间成像股骨骨髓的三个组分（血管、胶原基质和中性粒细胞）。

骨髓是一种复杂的器官，包含多种造血和非造血细胞。这些细胞参与多种生物学过程，……

本实验的总体目标是通过在股骨上植入的慢性观察窗，对小鼠骨髓血管结构中的中性粒细胞进行长期显微成像与追踪。该方法有助于解答免疫学和肿瘤学领域的关键问题，例如单核细胞在感染调控、肿瘤发生及肿瘤转移过程中的作用。该技术的主要优势在于能够长期显微观察作为造血中心部位的股骨骨髓，并提供传统方法难以获得的动态信息。尽管该方法专用于血管网络内中性粒细胞的成像，也可用于可视化其他感兴趣的免疫细胞群体。手术当天，通过无胸腺裸鼠足趾夹捏无反应来确认适当的镇静水平。然后，将小鼠置于体视显微镜下，放在电热垫上，并用手术单覆盖。接下来，将药膏涂抹于动物的眼睛，并使用7.5%聚维酮碘、70%异丙醇和10%聚维酮碘依次擦拭两次，对术区进行消毒。动物准备就绪后，使用装有15号刀片的手术刀从外侧靠近股骨处做一条10毫米的纵向皮肤切口。随后，用镊子和止血钳进行钝性分离，暴露位于屈肌与伸肌之间的股骨。当观察到股骨时，将U形杆插入骨下，并安装观察窗室。使用两个螺母将U形杆固定在观察窗上，然后用镊子拧紧螺母。使用镊子将屈肌和伸肌的肌肉组织复位至其原始位置。用牙科水泥填充骨组织与观察窗室之间的空隙，以固定观察窗室。随后，使用微型钻头在皮质骨上研磨出一个6毫米×2毫米的区域，以获得对骨髓腔的光学通路。当获得一层几乎透明的骨膜后，将一个8毫米的盖玻片置于窗口上，并使用卡环固定盖玻片。接着，用5-0缝线和持针器缝合真皮层。然后，将小鼠放入铺有清洁垫料的新笼子中，并持续监测直至其完全恢复。为了通过观察窗获取多光子与共聚焦显微镜的联合图像，首先通过尾静脉向小鼠注射适当的荧光血管中性粒细胞标记溶液。使用鳄鱼夹夹住观察窗两端，将小鼠固定在定制的载物台上。然后，将成像载物台放置到多光子与共聚焦显微镜的组合系统上。固定好小鼠后，开启双光子激光器和共聚焦系统，点击“启动系统”以运行图像采集软件。在“采集”选项卡下，点击“智能设置”以配置成像通道，并选择用于成像的激光器。选择“最佳信号”，然后点击“应用”。在“激光器”窗口中打开双光子激光器，并为二次谐波生成设置适当的采集波长，以手动添加二次谐波生成图像采集通道。在“定位”选项卡下，单击“目镜在线”，通过显微镜目视观察定位感兴趣区域。单击“目镜离线”，然后打开“采集”选项卡。在通道窗口中，选择 FITC 轨道，点击“实时”以使用 5 倍物镜预览 FITC-葡聚糖图像。根据需要调整焦距。然后，在采集选项卡下点击“停止”以结束预览。现在，手动选择20倍水镜，再次查看FITC-葡聚糖图像，并在通道窗口中调整主增益（Gain）和针孔（Pinhole），以获得最佳信号与对比度。当三个通道均获得最佳图像后，在通道窗口中选择所有通道，然后在采集选项卡下点击“Snap”以获取一张2D快照。接下来，为获取2D时间序列图像，选择“Time Series”以打开时间序列窗口，将时间间隔设为0，总扫描次数设为40，以连续获取40张无时间间隔的图像。为了分析图像，打开相应的图像分析软件，并打开一个图像文件。要利用延时图像生成目标轨迹，请在 Surpass 视图中打开待分析的图像，然后单击带有橙色点状图标的按钮，以打开新的 Spots 窗口。设置追踪参数后，勾选“用所有检测到的目标填充间隙”复选框以开始追踪。然后点击蓝色箭头进入下一步。在“滤波器类型”下选择“轨迹持续时间”滤波器，然后点击绿色箭头以完成追踪。接着检查生成的轨迹，必要时返回上一步进行调整。为了测量细胞运动，即在延时图像中由“对象轨迹”定义的运动，在“编辑轨迹”窗口中，选择“轨迹”框，并选择与目标细胞运动相对应的一条轨迹。所选轨迹将在时间序列图像中以黄色高亮显示。最后，在“统计”选项卡下，单击带有图表图标的按钮，以打开统计窗口。然后，在“选择”下，单击下拉箭头以生成轨道速度均值。骨髓内的血管系统可通过血管内染料（如 FITC-Dextran）进行可视化。由于对比度依赖于染料的注射，所获得的图像代表具有足够血流的功能性血管系统。这些在不同时间点拍摄的骨髓同一区域图像显示，在数天时间内，中性粒细胞存在于血管内和血管外空间。通过对主要由胶原纤维组成的皮质骨进行二次谐波成像，进一步展示了中性粒细胞对血管组织的浸润。这些中性粒细胞在骨髓血管微环境中被连续追踪，每次扫描之间无额外时间间隔，从而实现了对其运动的精确追踪。随后可测量图像分析软件生成的轨迹速度，以分析每个细胞的移动速率。通过该操作流程，还可结合其他方法，例如使用离体标记细胞或转基因报告小鼠，在原位评估其他生物学过程，如免疫细胞对肿瘤进展和转移的影响。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在小鼠股骨上安装观察窗室，以追踪中性粒细胞在骨髓血管微环境及胶原结构中的动态行为。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

股骨窗口商会模型<em&gt;在体内</em在小鼠骨髓&gt;手机跟踪

本方案描述了一种无需处死小鼠即可进行股骨骨髓（BM）连续取样的操作流程。该方法可支持对小鼠骨髓组成进行长期的纵向研究，并能够连续获取骨髓内的细胞，用于离体（ex...

活体小鼠股骨骨髓穿刺

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

造血干细胞与祖细胞（HSPCs）与骨髓微环境之间相互作用的性质尚不明确。通过定制的硬件改装和多步骤采集方案，可结合双光子显微镜与共聚焦显微镜进行成像 离体...

体内 成年小鼠颅骨骨髓中造血干细胞与祖细胞的四维追踪

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。...

追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

本文介绍了一种对骨髓组织学数据进行定量分析的策略。通过对组织切片中荧光标记细胞进行共聚焦显微镜成像，获得二维图像，并对其进行自动分析。通过将不同细胞类型的共定位分析结果与模拟图像数据进行比较，可获得有关细胞间相互作用的定量信息。...

未脱钙骨组织切片中造血细胞与基质细胞相互作用的自动化定量分析

通过颅骨的活体荧光显微镜（IVFM）结合遗传性动物模型，用于研究造血细胞归巢并植入骨髓（BM）微环境的过程。...

结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

本文介绍了一种在小鼠体内构建并进行活体成像不同类型人源化骨髓微环境的方法。该方法基于人源间充质细胞所构建的支持性微环境，通过添加人源内皮细胞可诱导形成人源血管，而添加重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）则可诱导形成人-鼠嵌合的成熟骨组织。...

人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

此处，我们介绍一种用于分析巨核细胞超微结构的实验方案 原位 采用透射电子显微镜（TEM）观察。收集小鼠骨髓，经固定、环氧树脂包埋后切成超薄切片。经对比染色后，在120 kV电压下用TEM显微镜观察骨髓结构。...

原位 探索小鼠巨核细胞生成过程——基于透射电子显微镜技术

本文描述了利用双光子显微镜对活体小鼠颅骨骨髓中的巨核细胞及其血小板前体（proplatelets）进行成像的方法。...

体内 小鼠颅骨骨髓中巨核细胞与前血小板的双光子成像

活体显微镜技术可实现对组织再生和肿瘤发生等动态生物学过程的研究。颅骨骨髓是一种高度动态的组织，为研究造血作用和血管功能提供了重要线索。通过使用生物相容性3D打印头部固定植入物，可实现重复的纵向成像，从而加深我们对组织动态变化及肿瘤微环境的理解。...

颅骨骨髓血管动态的活体纵向成像

小鼠骨髓损伤模型是研究出生后通过膜内成骨进行骨形成的有效工具。该简化的手术方案描述了骨髓消融操作，可用于后续评估损伤后新骨形成及细胞反应。...

通过小鼠骨髓损伤模型研究出生后膜内成骨的改进方法

学习使用股骨窗口室模型在小鼠骨髓中进行长期活体成像，追踪中性粒细胞在血管结构中的动态行为。该方法结合双光子荧光显微镜技术，为免疫学和肿瘤学研究提供关键动态信息。

股骨窗室模型在体内小鼠骨髓中的细胞追踪

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股骨窗室模型 在体 内 小鼠骨髓中的细胞追踪

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