Name: 该二甲基亚硝胺诱发肝纤维化模型大鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解使用二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化的动物模型构建方法。该模型通过组织学检查评估纤维化程度，为研究肝病进展和测试抗纤维化药物提供了可靠工具。

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作者感谢新加坡教育部提供的经费支持，项目编号 MOE2010-IF-1-025。

所有动物实验均已获得淡马锡理工学院应用科学学院动物护理与使用委员会的批准。
1. DMN 的制备
<ol>
	<li>用移液器吸取200 µl DMN（1 g/ml 储存液），加入19.8 ml PBS，配制用于注射的10 mg/ml DMN溶液。 
	注意：DMN具有致癌性。配制DMN溶液及进行动物注射时应在通风橱中操作。</li>
</ol>
2. 腹腔注射 DMN
<ol>
	<li>使用体重为150 - 200 g的雄性Wistar大鼠。实验开始前将大鼠适应性饲养4 - 7天。</li>
	<li>将大鼠饲养在22 ± 1 °C的室温环境中，维持12小时光照与12小时黑暗的循环周期。自由摄取饲料和饮水ad libitum。</li>
	<li>每日记录食物和水的摄入量，每周测量一次体重。</li>
	<li>根据每只大鼠10 mg/kg体重的剂量计算所需DMN的用量。使用1 ml注射器配25号针头，吸取计算体积的DMN溶液。</li>
	<li>固定大鼠以进行腹腔注射21。</li>
	<li>在正确固定大鼠后，将针头插入腹部右下象限，回抽注射器活塞（不应抽吸出任何物质），以确认针头位于腹腔内，随后缓慢注入DMN溶液。</li>
	<li>完成DMN给药后，缓慢拔出针头，并将其丢弃至锐器盒中。</li>
	<li>每周连续3天进行DMN腹腔注射，共持续4周。每天在相同时间点给药，并根据每周注射开始时的体重重新计算给药剂量。</li>
	<li>每周从尾静脉采集血液，检测生化指标：丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）22。</li>
	<li>使用商用Vet Test化学分析仪测定血清ALT和AST水平。</li>
</ol>
3. 肝脏的大体检查与取材&#160;
<ol>
	<li>通过腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为100 mg/kg体重）处死大鼠，并通过检查心跳消失确认死亡。</li>
	<li>按照Parkinson所述的方法为尸体解剖做准备，并评估动物的状况 等23 将死亡的大鼠仰卧置于解剖板上，使腹部朝上。</li>
	<li>用70%乙醇对皮肤进行消毒并润湿。</li>
	<li>使用剪刀从肛门至下颌沿腹侧全长切开皮肤，并将皮肤翻开。用剪刀从肛门沿腹壁剪至剑突软骨，以暴露腹腔内脏器。</li>
	<li>检查腹部器官 原位 检查是否存在任何异常，记录器官颜色、大小、位置的变化以及腹腔内有无积液。评估器官的质地，并注意有无异味。</li>
	<li>使用剪刀和镊子将肝脏从所有韧带和附着物中完整解剖分离。
	<ol>
		<li>从肝脏与膈肌相连的肝门处开始，逐步分离肝脏各叶的附着结构。仔细切断所有韧带和血管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肝脏转移至培养皿中并称重。</li>
	<li>使用手术刀切取2 - 5 mm厚的肝叶组织块。为保持一致性，应始终从同一肝叶取样。从右外侧叶切取直径约5 mm的楔形组织块。24 距叶缘约1 cm处立即放入10%缓冲福尔马林中固定，确保组织与福尔马林的体积比为1:10或更高。</li>
	<li>如需用于其他研究，此时可收获肝叶组织并立即用液氮冷冻保存。为保持一致性，样本应取自与步骤（3.8）相同的肝叶。</li>
</ol>
4. 肝脏的处理、包埋与切片
<ol>
	<li>将肝组织样本置于10%缓冲福尔马林中固定，时间不少于24小时。</li>
	<li>固定后修剪肝脏组织，放入包埋盒中，并将包埋盒装入自动组织处理机的篮筐内。</li>
	<li>将装有包埋盒的篮筐放入第一站，该站含有10%缓冲福尔马林。确保包埋盒完全浸没在液体中。样本可在该室中停留最长12小时，直至程序开始运行。</li>
	<li>设置组织处理机依次通过以下溶液，每个步骤旋转1小时：50%、70%、90%、100%乙醇（2个站点）、二甲苯（2个站点）和液体石蜡（2个站点）。</li>
	<li>将肝组织样本转移至包埋工作站的石蜡浴中。确保包埋机至少提前一小时开启预热。</li>
	<li>使用预热至65 °C的镊子从石蜡浴中取出每个包埋盒，放置于包埋机的温热板（65 °C）上。向已预热至65 °C的不锈钢底模中加入足量液体石蜡，填充至一半高度。将包埋盒中的肝组织切片转移至模具中，确保待显微镜检查的切面平整地置于模具底部。</li>
	<li>用液体石蜡完全填满模具，在其上方放置空的包埋盒，然后将模具置于包埋机的4 °C冷却板上，冷却至少30分钟。</li>
	<li>检查石蜡是否已冷却并完全凝固，随后将石蜡块从模具中取出。石蜡块应能轻松脱模，不应粘连或开裂。若出现粘连或开裂，需将石蜡块融化后重复此步骤。石蜡块完全凝固后即可进行切片。石蜡块可在室温下长期保存多年。</li>
	<li>将石蜡块安装至切片机上，以10 µm厚度切片，直至去除足够的石蜡层，使包埋的肝组织清晰可见。</li>
	<li>将切片机设置调整为5 µm厚度。用镊子夹住切片边缘，小心地将切片放入40 °C的水浴中展平。</li>
	<li>将洁净的载玻片轻轻插入漂浮的切片下方，将其平稳托起并转移至载玻片表面。将载玻片置于37 °C的玻片烘箱中过夜。</li>
</ol>
5. 马松三色染色
<ol>
	<li>染色前，按以下步骤处理切片以去除石蜡并使组织复水：
	<ol>
		<li>将切片浸入二甲苯中 5 分钟，重复 2 次。</li>
		<li>将切片浸入 100% 乙醇中 3 分钟，重复 1 次。</li>
		<li>将切片依次浸入下列浓度的乙醇溶液中，每种各 1 分钟：90%、80% 和 70%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用自来水冲洗切片，以去除切片上残留的乙醇。</li>
	<li>将切片浸入铁苏木精染液中 10 分钟，以染细胞核。</li>
	<li>用水冲洗切片，去除多余的染液。</li>
	<li>将切片浸入比布里奇猩红-酸性品红染液中 2 分钟，以染细胞质。</li>
	<li>用水冲洗切片。</li>
	<li>将切片放入磷钨酸/磷钼酸溶液中 10 分钟，以促进苯胺蓝的吸附。磷钨酸/磷钼酸溶液使用两轮后需更换。</li>
	<li>将切片放入苯胺蓝溶液中 10 分钟，以染胶原纤维。</li>
	<li>用水冲洗去除多余染液，然后将切片放入 1% 醋酸溶液中 1 分钟，进行分化处理，使切片颜色更细腻透明。</li>
	<li>用水冲洗切片，随后进行组织切片的脱水步骤。脱水步骤如下：</li>
	<li>将切片依次浸入下列浓度的乙醇中，每次 10 秒：70%、80%、95% 和 100%。</li>
	<li>将切片浸入 100% 乙醇中 30 秒，重复 1 次。</li>
	<li>将切片依次通过 3 个二甲苯缸，每个 5 分钟，以彻底去除乙醇。</li>
	<li>用封片介质（例如，DPX 封片剂）将玻璃盖玻片封固于样本上，并静置干燥。 
	注：DPX 是一种合成树脂，干燥迅速，可保存染色结果并保护组织切片。</li>
</ol>
6. 肝脏Masson三色染色切片的纤维化评分
<ol>
	<li>由兽医病理学家根据纤维化评分标准25评估纤维化的严重程度。最好由两名或三名病理学家以盲法独立进行纤维化评分。在此情况下，应通过讨论和集体复核达成最终评分，以解决评分中的任何差异。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>评分</td>
			<td>描述</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>无纤维化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>部分门脉区出现纤维组织扩张，伴或不伴短纤维隔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>多数门脉区出现纤维组织扩张，伴或不伴短纤维隔</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>多数门脉区出现纤维组织扩张，偶见门脉至门脉（P-P）桥接&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>门脉区纤维组织明显扩张，伴有显著桥接（门脉至门脉（P-P）以及门脉至中央静脉（P-C）&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>显著桥接（P-P 和/或 P-C），偶见结节（不完全性肝硬化）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>肝硬化，可能或明确</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于评估Masson三色染色肝组织切片的纤维化评分25。

<ol><li>Magee, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+liver+injury%3B+the+metabolism+of+dimethylnitrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine.</a> Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).</li>
<li>Pritchard, D. J., Butler, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-the+mechanism+of+cell+death+in+dimethylnitrosamine-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity.</a> J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).</li>
<li>Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethylnitrosamine-induced+hepatic+cirrhosis%3A+a+new+canine+model+of+an+ancient+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease.</a> Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).</li>
<li>Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimethylnitrosamine-induced+model+of+cirrhosis+and+portal+hypertension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat.</a> J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).</li>
<li>Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphological+study+of+the+early+stages+of+hepatic+fibrosis+induced+by+low+doses+of+dimethylnitrosamine+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat.</a> J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).</li>
<li>George, J., Chandrakasan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+dimethylnitrosamine+induced+fibrotic+liver+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%2C+Protein+Struct+Mol+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen.</a> Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).</li>
<li>Winwood, P. J., Arthur, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells%3A+their+activation+and+role+in+animal+models+of+liver+injury+and+human+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease.</a> Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).</li>
<li>Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+transforming+growth+factor%CE%B2+prevents+progression+of+liver+fibrosis+and+enhances+hepatocyte+regeneration+in+dimethylnitrosamine-treated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats.</a> Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).</li>
<li>Shek, F. W., Benyon, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+transforming+growth+factor+beta+be+targeted+usefully+to+combat+liver+fibrosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis?</a> Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).</li>
<li>Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifibrotic+effects+of+CGX%2C+a+traditional+herbal+formula%2C+and+its+mechanisms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats.</a> J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).</li>
<li>Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+of+dimethylnitrosamine-induced+liver+fibrosis%3A+from+pathological+and+biochemical+data+to+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis.</a> Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).</li>
<li>Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide-induced+cirrhosis-like+liver+lesions+in+rats+usefulness+and+reliability+of+this+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model.</a> Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).</li>
<li>Martinez-Hernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+extracellular+matrix.+II.+Electron+immunohistochemical+studies+in+rats+with+CCl4-induced+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis.</a> Lab Invest. 53 (2), 
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<li>Pritchard, M. T., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+to+Study+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Models to Study Liver Regeneration.</a> Liver Regeneration. , 15-40 (2015).</li>
<li>Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+bile+duct+obstruction%3A+a+new+experimental+model+for+cirrhosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat.</a> Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).</li>
<li>Marques, T. G., Chaib, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+experimental+models+for+inducing+hepatic+cirrhosis+by+bile+duct+ligation+and+carbon+tetrachloride+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir+Bras%22%5BJournal%5D)">Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection.</a> Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).</li>
<li>Wasser, S., Tan, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+hepatic+fibrosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Acad+Med+Singapore%22%5BJournal%5D)">Experimental models of hepatic fibrosis in the rat.</a> Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).</li>
<li>George, J., Chandrakasan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+abnormalities+during+the+progression+of+hepatic+fibrosis+induced+by+dimethylnitrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine.</a> Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).</li>
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<li>Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+antifibrotic+effects+of+sorafenib+on+hepatic+stellate+cells+and+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis.</a> J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).</li>
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<li>Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Necropsy+and+Selected+Tissue+and+Sample+Collection+in+Rats+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).</li>
<li>Ishak, K., Baptista, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+grading+and+staging+of+chronic+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Histological grading and staging of chronic hepatitis.</a> J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们已描述了一种建立肝纤维化动物模型并评估其严重程度的方法。准确给予二甲基亚硝胺（DMN）的剂量，并严格遵守每周腹腔注射的时间表至关重要。随着实验的进行，必须每周称量大鼠体重，并在每次DMN注射开始前重新计算给药剂量。需要注意的是，DMN具有毒性，必须在通风橱中操作。我们的腹腔注射操作也在通风橱内进行。由于需要多次注射，正确的固定方法和注射技术对于避免污染和内脏损伤尤为重要。腹腔注射导致的动物死亡情况极为罕见。
在整个实验期间，应每天对大鼠进行两次监测。在DMN注射的最后一周，应更加频繁且密切地观察动物是否出现濒死症状。此阶段肝损伤最为严重，受影响的大鼠会出现食欲减退、体重下降和身体状况恶化。此期间有25%至40%的大鼠可能病情严重，若无兽医干预可能发生死亡。因此，密切监测可使研究人员及时评估动物状况，并适时终止实验，以便从安乐死的大鼠体内新鲜采集器官，避免因意外死亡导致组织腐败而无法获取样本。
我们发现，每周检测ALT和AST水平可作为肝损伤进展的有用指标。我们还观察到，AST的特异性低于ALT，这归因于AST除了从受损的肝...

DMN 是一种强效的肝脏特异性毒素。Magee1 报道了该物质在大鼠体内的代谢、组织分布及其对肝脏造成损伤的能力，Pritchard 和 Butler2 描述了其导致肝细胞损伤及通过凋亡途径引发细胞死亡的机制。已有报道称，间歇性给予该化合物可在狗和大鼠中诱导肝纤维化3,4。
该模型已被广泛用于研究肝纤维化的机制及形态学变化。早期在大鼠中进行的研究显示，经3周DMN处理后，出现中央静脉周围出血性坏死，随后发展为无脂肪变性的小结节性肝硬化5。研究表明，在早期纤维化阶段，形成的胶原蛋白交联程度较高，其中III型胶原较I型更为显著6。与其他病因类似，DMN诱导的纤维化改变伴随着库普弗细胞（Kupffer cells）数量的增加；这些细胞是定位于肝窦内的肝巨噬细胞。这些细胞可转化为肌成纤维细胞，并产生过量的细胞外基质，后者是纤维化的主要问题所在7。
在细胞信号传导方面，Nakamura et al. 证明了转化生长因子-β（TGF-β）在肝纤维化进展中起关键作用8。他们使用表达截短型II型TGF-β受体的腺病毒，特异性抑制TGF-β信号通路。与对照组相比，在给予二甲基亚硝胺（DMN）处理期间，这些大鼠的肝纤维化进程显著被阻断。其他研究也证实，抑制TGF-β可减轻肝纤维化的发生发展9,10。该模型还被用于全基因表达谱分析研究，以鉴定其他可用于抗纤维化治疗药物靶点的纤维化标志物和蛋白11。
用于诱导肝纤维化的其他化学试剂包括硫代乙酰胺（TAA）和四氯化碳（CCl4）。TAA 最初在大鼠中使用，随后应用于小鼠12。该模型的优点包括：可通过饮水方式简便地给予化学试剂，模型可重复性强，并能产生典型的微小结节性肝硬化及相应的生化改变。其缺点包括：需长达 3 个月的时间才能形成肝纤维化，且对诱导肝纤维化的分子机制尚不明确。至于 CCl4，其使用已逐渐减少，原因如下：该模型不能模拟人类肝病，对臭氧层具有破坏作用，对实验动物造成疼痛与痛苦，对人类具有高度毒性，且在操作和处置过程中需要额外的安全防护措施13,14。
通过手术干预造成胆管长期阻塞作为肝硬化的实验模型，最早由 Kountouras 等15 报道。该方法对人和动物均无毒性。然而，肝纤维化形成所需时间存在差异。Marques 等16 对30篇报道进行综述发现，术后肝纤维化形成时间从7天至4周不等。所描述的病理改变与人类慢性胆源性纤维化相似，因此该模型更适合对该领域感兴趣的研究人员使用。
总之，在大鼠中持续4周间歇性给予恒定剂量的DMN可诱导出模拟人类疾病的肝纤维化。给药大鼠表现出进行性肝损伤和实质纤维化4,17。疾病进展程度和严重性可通过在特定时间点采集血液样本或处死动物进行监测，且该效应具有高度可重复性18。因此，该模型已被广泛用于研究肝纤维化和肝硬化的机制，以及筛选潜在的抗纤维化药物10,19,20。

<table><tbody><tr><td>二甲基亚硝胺</td><td>Wako</td><td>147-03781</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林</td><td>国药化学试剂</td><td>F63257009</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>马松三色染色试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯胺蓝</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>#42755</td><td></td></tr><tr><td>酸性品红</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>RT42685</td><td></td></tr><tr><td>猩红红</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>#26905</td><td></td></tr><tr><td>水合磷钨酸</td><td>ALFA AESAR</td><td>ALFA40116.4</td><td></td></tr><tr><td>水合磷钼酸</td><td>Sigma SG</td><td>221856-25G</td><td></td></tr><tr><td>威格特铁苏木精</td><td>默克</td><td>1.15973.0002</td><td></td></tr><tr><td>DPX 封片介质</td><td>默克</td><td>HX066873</td><td></td></tr><tr><td>组织处理机</td><td>Leica</td><td>Leica TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>包埋机</td><td>Sakura</td><td>&amp;nbsp;Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>Leica RM 2235</td><td></td></tr><tr><td>兽用检测分析仪</td><td>Idexx</td><td>Vet Test 8008</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

采用4至6周龄的雄性Wistar大鼠建立肝纤维化动物模型。该过程需要每周连续3天腹腔注射10 mg/kg的二甲基亚硝胺（DMN），持续给药4周。由于DMN是一种已知的肝毒素和致癌物，腹腔注射操作需在通风橱中进行。该模型具有多个优点：首先，可对肝脏病变进行连续观察或在特定感兴趣阶段进行研究；其次，可通过检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平来监测肝病进展程度；第三，可在预定时间点处死动物，通过Masson三色染色肝组织的组织学检查，确认不同阶段肝损伤的严重程度。经过4周DMN给药后，典型的Ishak纤维化评分为5至6分。该模型可稳定重复，已被广泛用于评估潜在抗纤维化药物的疗效。

经DMN处理的大鼠出现体重下降、活力减退及毛发竖立凌乱。DMN处理组大鼠的平均体重显著降低，该差异在DMN处理2周后首次显现，并持续至处理后的第3周和第4周（图1a）。随着大鼠连续数周接受DMN处理，肝脏受损并逐渐缩小。肝脏指数（即最终肝重占体重的百分比）在DMN处理组大鼠中显著降低（图1b）。
<img alt="体重和百分比变化柱状图；对照组与DMN组；四周内的体重增长。" src="/files/ftp_upload/54208/54208fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：a）经DMN处理的大鼠体重。数据以均值±标准差表示（n = 6 - 8）。*P &lt; 0.05，与正常对照组比较。 b）肝脏指数；DMN处理4周后，DMN处理组大鼠肝脏重量占最终体重的百分比。数据以均值±...

我们介绍一种在大鼠中建立肝纤维化动物模型的方法，并通过肝脏组织学检查评估纤维化程度。该模型可用于研究肝脏疾病的发展过程，以及检测潜在抗纤维化药物的疗效。

使用4至6周龄的雄性Wistar大鼠建立肝纤维化动物模型。该过程需要连续4周给予10 mg/kg的……

本实验的总体目标是建立一种可用于评估潜在抗纤维化药物疗效的肝纤维化动物模型。该动物模型有助于解答关于肝纤维化特征、发展过程以及抗纤维化药物如何减轻纤维化进程的关键问题。此外，该模型能够模拟从早期到晚期纤维化阶段人类肝病复杂的生理过程，并可在疾病发展的任意感兴趣时间点进行研究。初次使用该方法的研究人员需要规划好实验流程，因为 den-glis-nov 动物模型至少需要五周时间。肝脏组织收获后，还需要一到两周的处理时间，才能制备出可供病理学家观察的特殊染色切片。DMN 必须用 PBS 稀释至每毫升含 10 毫克的工作浓度。进行此稀释操作时，务必在通风橱中操作，因为该物质具有致癌性。实验应选用体重在150至200克之间的雄性Wistar大鼠。将大鼠在正常气候条件下饲养至少四天以适应环境。自由提供食物和水，并测量其每日摄入量。每周定期测量大鼠的体重并采集血液样本。进行DMN处理时，在通风橱中配制并注射剂量为10毫克/千克的药物。使用25号针头，向腹部右下象限进行腹腔注射。连续三天对大鼠进行注射，并在四周内每周重复此过程。每次均选择相同的连续三天，且重要的是，在四周期间每周调整一次DMN剂量。在最后一次注射后四到五天处死DMN处理的动物。在解剖板上，用70%乙醇消毒并润湿腹部皮肤。然后，使用剪刀从肛门到下巴切开皮肤，并将其向两侧翻开。接下来，从肛门至剑突软骨切开腹壁，以暴露腹腔内脏器。检查各器官是否存在异常，例如颜色、大小、位置是否异常，或腹膜腔内有无积液。同时探查器官的质地，并注意有无异常气味。接下来，分离肝脏。从肝门（即肝脏与膈肌的附着点）开始，围绕肝脏进行操作，将其从周围的韧带和血管中游离出来。然后，将肝脏转移至培养皿中，并记录其重量。现在，使用手术刀从一个肝叶中切取一个5毫米见方的组织块，该组织块应深入肝叶1至2厘米，用于切片。然后，最好从同一肝叶再切取一到两个组织块作为备用。剩余的肝脏可冷冻保存。用至少十倍于组织体积的10%福尔马林固定组织块。固定24小时或更长时间后，修整肝组织样本并将其放入包埋盒中。然后将篮子装入自动组织处理仪中。将篮子完全浸入装有10%缓冲福尔马林的第一处理站中。随后，依次在乙醇系列中各浸泡一小时，再经二甲苯处理，最后进入石蜡。接下来，预热包埋仪至少一小时。待组织变暖后，将肝组织样本转移至石蜡浴中。两到三分钟后，用预热的镊子将包埋盒转移至65摄氏度的加热板上。然后用温热的液态石蜡填充包埋模具至一半高度。接下来，将组织从包埋盒中取出，放入石蜡中，使切面平整地贴合于模具底部。然后，用温热的石蜡完全填充模具。将空的包埋盒置于石蜡上方，作为标签和支撑物。然后将模具置于4 °C的冷台上冷却30分钟。冷却后，取出石蜡块。如果石蜡块出现裂纹，应将其融化后重新包埋。现在，使用切片机对组织块进行切片。先切10微米厚的切片，直至观察到组织，然后切5微米厚的

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医学

该二甲基亚硝胺诱发肝纤维化模型大鼠

胆汁流的中断会导致严重的炎症性胆汁淤积性肝损伤，并伴随特征性的时间依赖性形态学改变序列。本文介绍了一种在小鼠中进行总胆管结扎的手术方案，可在21至28天后诱导出显著的纤维化反应。...

小鼠胆管结扎术：通过阻塞性胆汁淤积诱导炎症性肝损伤及纤维化

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。...

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

本文介绍了一种通过喂食胆碱缺乏且添加乙硫氨酸（CDE）的饮食来诱导小鼠慢性肝损伤的常用方法。我们展示了健康监测、肝脏灌注、分离与保存的操作过程。为期六周的时间进程可用于评估肝损伤、病理组织学、纤维化、炎症反应以及肝前体细胞的应答情况。...

小鼠胆碱缺乏、乙硫氨酸补充（CDE）饮食慢性肝损伤模型

我们介绍一种基于显微CT和荧光分子断层成像的非侵入性多模态成像方法，用于对通过两次气管内滴注博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向评估。...

一种基于显微CT与荧光分子断层成像的多模态成像方法用于小鼠博来霉素诱导肺纤维化的纵向评估

本研究中，我们描述了一种由TNBS介导的肠纤维化详细实验步骤，该模型表现出与克罗恩病纤维化相似的病理生理特征。我们还探讨了雷帕霉素在抑制肠纤维化方面的作用及其相关机制。...

TNBS介导的肠道纤维化发生机制研究及雷帕霉素抑制作用的评估

本研究建立的急性肝衰竭动物模型为潜在疗法的研究提供了一种可行的替代方案。该模型结合了物理性和药物诱导性肝损伤的双重效应，为研究新型疗法的潜力提供了合适的时间窗口。...

结合70%部分肝切除与对乙酰氨基酚建立大鼠急性肝衰竭模型

本方案提供了一种简单且可靠的方法，用于制备来自小鼠的具有活性的精准切割肝组织片。这些离体组织样本可在实验室组织培养条件下维持数天，为研究肝脏病理生物学提供了一个灵活的模型。...

小鼠精准切割肝片作为肝脏生物学的离体研究模型

我们建立了一种小鼠慢性肝纤维化模型，该模型为胆道闭锁（BA）相关的病毒诱导肝纤维化机制研究提供了合适的动物模型，同时也为未来BA的治疗提供了一个研究平台。...

用于胆道闭锁研究的慢性肝纤维化小鼠模型

本文介绍了通过向气道注射博来霉素建立与肺纤维化相关的肺动脉高压（PF-PH）大鼠模型的方法。同时提供了对该动物模型进行验证的逐步操作流程。...

建立并验证与肺纤维化相关的肺动脉高压大鼠模型

一种模拟代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的小鼠模型，具有代谢功能障碍、肝脏基因表达改变以及肝组织病理学变化，且包含进展至晚期纤维化3期的纤维化特征，与人类MASLD相似。该模型可用于MASLD发病机制的研究以及新疗法的临床前研究。...

伴纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝病小鼠模型

了解使用二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化的动物模型构建方法。该模型通过组织学检查评估纤维化程度，为研究肝病进展和测试抗纤维化药物提供了可靠工具。

大鼠二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型

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