利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体

连续块面扫描电镜技术的总体目标是分析小鼠脑部特定区域内线粒体的形态、结构、分布、体积和数量。该方法有助于解答神经生物学领域的诸多关键问题，例如脑内线粒体结构、数量和分布的变化是否显著参与神经退行性疾病和神经发育障碍的发生发展。该技术的主要优势在于，通过在低真空扫描电镜腔室内集成定制的超薄切片机，实现了对连续切片成像过程的自动化。

实验开始时，将先前制备的戊二醛固定的组织在0.1摩尔的卡可基酸盐缓冲液中洗涤三次，每次五分钟。在室温下，用1毫升经卡可基酸盐缓冲液配制的0.1%单宁酸溶液对组织进行后固定，持续30分钟。后固定完成后，用卡可基酸盐缓冲液洗涤组织。

将0.3克亚铁氰化钾和0.86克二甲胂酸钠溶于10毫升蒸馏水中。使用前，加入10毫升4%四氧化锇溶液，配制成2%亚铁氰化锇染色液，将组织置于冰上染色90分钟。染色后，用蒸馏水洗涤组织。

将样品用新配制的1%硫代碳酰肼（TCH）溶液在室温下处理20分钟，然后洗涤样品。接着，用2%的水溶液四氧化锇对组织染色1小时。

染色后，用蒸馏水洗涤组织。将样品在4摄氏度下，于含1%醋酸铀酰的蒸馏水中孵育过夜。次日，用蒸馏水冲洗组织，然后在烘箱中用Welton's铅天冬氨酸染色液孵育。

获得最佳的组织染色对成像至关重要，因为染色效果不佳会导致样品上出现充电现象，使成像变得困难甚至无法进行。用蒸馏水清洗组织。通过梯度酒精溶液进行脱水，依次使用预冷的乙醇溶液各浸泡5分钟，随后用100%乙醇脱水三次，每次10分钟。

用丙烯酸甲酯清洗样品，每次15分钟，共清洗两次。将组织置于包埋树脂与丙烯酸甲酯按1:1比例配制的混合液中，盖上瓶盖，于室温孵育过夜。两小时后打开瓶盖，使丙烯酸甲酯在接下来的九小时内逐渐挥发。

将组织转移至洁净小瓶中的100%新鲜包埋介质中，孵育两小时。将样品包埋于含有打印纸质标签的平底模具中的新鲜包埋介质内，并在烘箱中固化。一小时后，检查组织的位置和排列方向，必要时进行调整。

将样品修剪至目标区域，并使用凝胶型氰基丙烯酸酯超级胶水将其固定在铝制样品钉上。然后在样品块侧面涂覆胶态银导电浆料，以提供通往铝制样品钉的导电通路。使用配备腔内超薄切片台和低千伏背散射电子探测器的扫描电子显微镜系统观察组织样本。

使用这些设置对样本进行成像。开始分析时，选择图像、类型，然后选择8位，将图像从原始的专有16位格式转换为8位TIFF格式。如果在此步骤中自动的对比度和/或亮度转换对图像效果不理想，请重新打开16位图像，然后按图像、调整、亮度/对比度。

选择一个适用于所有图像的范围，然后点击应用。接着执行转换。如果切片间存在不可接受的图像移动，请通过选择插件、配准以及使用SIFT进行线性堆栈配准，并将配准模式设置为仅平移模式而非刚体模式，以对图像堆栈进行对齐。

在配准之前，通过选择“图像”、“调整”、“画布大小”来扩大画布尺寸。或者，通过选择目标区域并进行裁剪，将图像缩小至感兴趣的区域。如有需要，可使用 ImageJ 将图像缩放为更小、更易处理的尺寸，然后选择“图像”和“缩放”。

对低密度神经元培养物进行的共聚焦显微镜观察显示，位于神经元胞体内的线粒体形成网状结构，而位于远端神经突中的线粒体则呈现离散的长条形形态。利用连续块面扫描电子显微镜（SBFSEM）技术，可在小鼠脑组织中清晰观察到线粒体、树突和轴突膨体。对小鼠脑组织神经突中线粒体进行为期三天的三维重建，显示出树突和轴突中线粒体在大小上的差异。

从代表性二维SBFSEM图像中提取的数据显示，位于神经元突触前部的线粒体体积或大小显著小于位于突触外区域的线粒体。通过SBFSEM分析获得的图像能够以更高分辨率观察单个线粒体的超微结构特征。通过确定线粒体与易于识别的结构（如非突触区胞体线粒体和突触前线粒体）的相对位置关系，可对线粒体所处的细胞区室进行分类。

该技术可在约七天内完成，包括三天染色、两天树脂固化、一天成像以获得适合本分析的图像序列，以及约两到四小时的图像后期处理以准备分析。该方法还可与其他线粒体成像技术联合使用，例如利用基因标记线粒体进行活体成像，以研究线粒体的运输及其裂变与融合动态等科学问题。