活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

本实验的总体目标是利用荧光标记的染色质和细胞膜蛋白，结合高分辨率共聚焦显微镜，对活体斑马鱼胚胎有丝分裂过程中染色体分离的保真度进行实时监测。该方法有助于回答有丝分裂领域中的关键科学问题，例如：有丝分裂缺陷如何在活体脊椎动物中导致发育异常或肿瘤形成？该技术的主要优势在于，我们能够在活体脊椎动物中直接观察有丝分裂过程，从而获取具有生理相关性的实验数据。

在繁殖成年斑马鱼并将 H2A.F/Z-EGFP 和/或 pCS2 mCherry-CAAX RNA 注射到卵子后，成像前约两小时，使用荧光解剖显微镜鉴定表达 GFP 的胚胎。将亮绿色的 GFP 阳性胚胎转移至新的 100 × 15 毫米含 E3 蓝色培养基的培养皿中。

将1%低熔点琼脂糖的E3蓝溶液煮沸。取3毫升融化的琼脂糖加入一支17 × 100毫米的培养管中。将培养管置于42°C水浴中保温，待用。

准备15毫摩尔的三卡因、筛选后的胚胎、低熔点琼脂糖、E3蓝液、35毫米玻璃盖玻片底培养皿以及解剖显微镜。接下来，使用5号镊子小心去除3个胚胎的绒毛膜，并将胚胎放入单独的容器中进行麻醉。然后，用移液器向含有胚胎和5毫升培养基的培养皿中加入3滴15毫摩尔的三卡因。

向含有1%熔化的琼脂糖的离心管中加入三到四滴15毫摩尔的三卡因溶液。当胚胎充分麻醉后，使用P200移液枪（剪去枪头前端约1厘米）将麻醉后的胚胎转移至载玻片底培养皿中。去除多余的E3蓝色三卡因溶液。

缓慢加入5至10微升低熔点琼脂糖-三卡因溶液至胚胎上方，保持每滴溶液相互分离，以确保胚胎之间不会相互靠近。然后，使用21号1.5英寸针头轻轻将胚胎在琼脂糖中调整至所需方向；若使用倒置显微镜，应将感兴趣区域尽可能贴近盖玻片。由于可能发生位移，可能需要逐一检查每个胚胎，以确保其保持在所需位置。

这一步可能需要重复多次，直至达到理想位置，因为琼脂在凝固过程中会固定位置。数分钟后，用一根细针挑取一小块琼脂糖，测试其是否已凝固；若该小块可从液滴中分离，则使用额外的低熔点琼脂糖在嵌入的胚胎上方形成一个穹顶状结构，完全覆盖整个盖玻片。

在琼脂糖凝固的同时，准备 3 毫升含 5 滴 15 毫摩尔三卡因的 E3 蓝色培养基，用于覆盖成像过程中的包埋胚胎。为进行活体斑马鱼胚胎的 5D 共聚焦成像，打开成像软件，并将显微镜设置为 60 倍、数值孔径 1.4 的物镜。在物镜上滴加浸油，然后将培养皿放入显微镜载物台的样品夹中。

使用轴控制器将目标胚胎置于物镜上方居中位置，并升起物镜使其接触培养皿。将E3蓝液和三卡因溶液倒入含有琼脂包埋胚胎的培养皿中。然后，单击目镜图标，通过目镜观察胚胎。

禁用眼孔选择，选择“视图”、“采集控制”、“A1扫描区域”，以打开A1扫描区域工具。选择GFP通道，重新开始扫描，并聚焦于靠近盖玻片的感兴趣区域。停止扫描，选择GFP和mCherry通道，并将线平均选项设置为正常。

现在，选择“查看”→“采集控制”→“ND采集”，打开A1 ND采集工具。开始扫描，然后使用轴控制器调整胚胎位置，使扫描区域尽可能多地包含斑马鱼。

将Z轴堆栈的上限设置在细胞失焦的位置，确保样本上方留有额外三微米的空间，以容纳细胞生长和移动。然后，将下限设置在细胞不再可见的位置，并将Z轴步进间隔设为两微米。对于本实验中展示的实验，分别根据下表调整成像激光功率、HV（或增益）以及偏移水平。

参数设置完成后，应关闭扫描以避免不必要的激光照射，从而防止样品发生光毒性和荧光淬灭。接下来，选择2倍线平均图标，以获得最佳的图像质量和最快的扫描速度。根据实验需求，选择适当的时间间隔和时间持续长度。

对于野生型细胞分裂，以每2分钟为时间间隔、持续2小时的成像已足以确定有丝分裂的持续时间。对于激活纺锤体组装检查点超过30分钟的细胞分裂，则更适合采用每4至5分钟为时间间隔、持续4小时的成像，以保留荧光信号，如此处所示。为在采集过程中自动保存文件，请勾选“保存到文件”选项，并为文件命名。

最后，仔细检查所有参数是否已正确设置，然后点击“Run Now”开始运行。采集完成后，若要以三维形式查看文件，请点击“Volume Threshold”图标。该图展示了利用AB野生型斑马鱼尾部的宽视野观察到的多次细胞分裂能力。

细胞分裂以星号标示。相应的视频如下所示。平均观察到 AB 中有 50 个分裂细胞，aurora B 突变体中有 30 个分裂细胞。

为了校正极光激酶B突变体胚胎中所成像的有丝分裂细胞数量减少的情况，计算了有丝分裂细胞数与成像细胞总数的比值，结果表明极光激酶B突变体胚胎中并非进行有丝分裂的细胞比例降低，而是成像的总细胞数量较少。为了定量有丝分裂持续时间，将完成一次细胞分裂所经历的时间间隔数乘以每个Z轴层扫图像之间的时间间隔。如本图所示，AB野生型细胞的平均分裂时间为25分钟，而极光激酶B突变体为58分钟。

如在野生型胚胎中所见，每次有丝分裂的各个阶段均可区分。然而，在aurora B突变体胚胎中可观察到有丝分裂缺陷，包括有丝分裂停滞和失败的胞质分裂，导致形成双核细胞，以及随后微核的产生，这些现象支持了在该突变体中测得的分裂时间延长。一旦掌握，该技术从胚胎筛选到共聚焦显微镜参数设置可在一小时内完成。

在进行该实验操作时，需始终牢记实验的具体背景，包括目标区域、持续时间、时间间隔以及Z轴深度。这有助于提高实验效率，同时避免光漂白和光毒性。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如染色体铺展技术，以探究所观察到的有丝分裂缺陷的成因，或通过药物处理来评估其对有丝分裂进程、持续时间或细胞命运的影响。

该技术发展之后，为发育生物学和癌症生物学领域的研究人员利用斑马鱼探索有丝分裂奠定了基础。观看本视频后，您应充分了解如何包埋斑马鱼胚胎、进行有丝分裂的活体成像，以及分析有丝分裂的频率、持续时间与细胞命运。请注意，使用高功率激光器和荧光光源可能对眼睛造成伤害，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如避免激光直接照射眼睛。