Name: 观察有丝分裂和动力学在现场斑马鱼胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习使用高分辨率共聚焦显微镜观察活体斑马鱼胚胎有丝分裂的方法。该技术利用荧光标记的染色质和细胞膜蛋白，帮助研究人员监测染色体分离保真度，并研究有丝分裂缺陷对发育和肿瘤形成的影响。

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我们感谢 Kristen Kwan 提供 pCS2-H2A.F/Z-EGFP 和 pCS2-mCherry-CAAX 载体。我们感谢 Chris Rodesch 指导我们在斑马鱼中进行活体成像。我们感谢 Shawn Williams、Erik Malarkey 和 Brad Yoder 在阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）共聚焦成像以及 UAB 高分辨率成像设施方面提供的帮助。UAB 高分辨率成像设施得到了 UAB 综合癌症中心支持基金（P30CA013148）和风湿性疾病核心中心（P30 AR048311）的支持。J.M.P. 的研究由美国国立神经疾病与卒中研究所（NIH R21 NS092105）、美国癌症协会（ACS IRG-60-001-53-IRG）以及 UAB 综合癌症中心（P30CA013148）的启动基金资助。S.M.P. 的研究由细胞与分子生物学 T32 培训基金（5T32GM008111-28）资助。

1. 体外 转录
<ol>
	<li>使用 NotI 限制性内切酶消化 pCS2-H2A.F/Z-EGFP 和/或 pCS2-mCherry-CAAX 载体以进行线性化31。根据制造商说明书，利用 RNA 体外转录试剂盒，从每个模板生成 5' 加帽的 mRNA 产物。</li>
	<li>使用纯化试剂盒对加帽的 mRNA 进行纯化，遵循制造商的操作说明。用无 RNase 的 H2O 洗脱。</li>
	<li>使用分光光度计在 260 nm 处测定 RNA 的浓度（OD260 × 稀释倍数 × 40 µg/ml）。</li>
	<li>用无 RNase 的 H2O 将 H2A.F/Z-EGFP 和 mCherry-CAAX 的 RNA 分别稀释至 100 ng/µl。若 RNA 浓度过低，则荧光信号会减弱或无法检测；较强的荧光信号可降低对光毒性和光漂白的担忧。然而，过量的 RNA 可能具有细胞毒性，和/或导致脱靶效应。 
	注意：将剩余的纯化 mRNA 储存在 -80 °C 冰箱中。</li>
</ol>
2. 斑马鱼繁殖、胚胎收集和 mRNA 显微注射 36-38
<ol>
	<li>组装繁殖用鱼缸，使用隔板将鱼缸分隔为两个区域，并用斑马鱼养殖设施中使用的循环水系统水注满每个繁殖鱼缸。</li>
	<li>为防止过早繁殖，于繁殖前一晚在隔板一侧放入两条雄鱼，另一侧放入两条雌鱼。</li>
	<li>次日，将预先配制的mRNA混合物置于冰上解冻。更换繁殖鱼缸中的水为新鲜的循环水系统水，并移除隔板。在移除隔板后立即预热注射模具至28.5 °C，并设置好显微注射设备。 
	注：有关注射模具的信息，请参见Gerlach36。</li>
	<li>使用茶筛每10–15分钟收集一次卵，并用E3 Blue溶液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4、10-5% 亚甲蓝）将卵冲洗至洁净的100 × 15 mm培养皿中。E3 Blue用于抑制真菌生长，确保幼鱼正常发育。有关交配和胚胎收集的更多信息，请参见Gerlach36和Porazinkski37。</li>
	<li>将处于单细胞期的胚胎嵌入预热的注射模具中，并向目标数量的胚胎卵黄中注射RNA（图1A）。考虑到自然胚胎死亡和未受精胚胎，注射的胚胎数量应比实验所需多出15%。有关斑马鱼胚胎显微注射的更多细节，请参见Gerlach36和Porazinkski37。 
	注：首次使用mRNA时，应先进行剂量-效应曲线分析，以确定荧光强度和存活率（定义为至5天龄时无明显发育异常）的最佳剂量，再进行5D成像。通常向胚胎注射150–200 ng/µl的mRNA为最佳浓度，因此可作为最终浓度的良好起始点。</li>
	<li>使用经改造的9&#34;玻璃巴斯德移液管小心地将已注射的胚胎从模具中取出。改造方法：用本生灯加热移液管末端，使其熔化成球状。</li>
	<li>将注射后的胚胎置于盛有E3 Blue的100 × 15 mm培养皿中，并放置于28.5 °C的培养箱中培养。</li>
	<li>注射后6小时，从培养皿中移除所有死亡或未受精的胚胎，并更换为新鲜的E3 Blue。将胚胎继续在28.5 °C条件下培养。</li>
</ol>
3. 活体斑马鱼胚胎的制备与包埋用于成像（图1B）
<ol>
	<li>成像前两小时，使用荧光体视显微镜筛选注射后的胚胎中 GFP 表达情况。将发出明亮绿色荧光的 GFP 阳性胚胎转移至一个新的 100 × 15 mm 培养皿中，加入 E3 Blue 溶液。</li>
	<li>通过将 1 g 低熔点琼脂糖加入 100 ml E3 Blue 溶液中，制备 1% 的低熔点琼脂糖储备液并煮沸。使用后用铝箔覆盖烧瓶。该储备液在一个月内仍可使用。</li>
	<li>将融化的琼脂糖分装 3 ml 至 17 × 100 mm 的培养管中。使用前将培养管置于 42 °C 水浴中保温，以维持琼脂糖处于液态。同时，用去离子水配制 15 mM 三卡因（Tricaine）溶液，用于麻醉斑马鱼胚胎36。 
	注意：若需在更早的时间点进行成像，琼脂糖浓度可降低至 0.3%39。</li>
	<li>将 15 mM 三卡因溶液、筛选后的胚胎、低熔点琼脂糖、E3 Blue 溶液以及一个 35 mm 玻璃底培养皿移至体视显微镜下。使用 #5 镊子小心去除胚胎的绒毛膜。对三个胚胎重复此操作。</li>
	<li>将去绒毛膜的胚胎放入单独的容器中进行麻醉。通常可使用玻璃底培养皿的盖子作为容器。用移液管向 5 ml E3 Blue 溶液（若使用培养皿盖）中加入三滴（约 150 µl）15 mM 三卡因溶液，直至胚胎充分麻醉。此外，向 1% 融化的琼脂糖管中加入 3–4 滴（约 150–200 µl）15 mM 三卡因溶液。</li>
	<li>使用切去 1 cm 管尖的 p200 移液器，将麻醉后的胚胎转移至玻璃底培养皿中。去除多余的 E3 Blue:三卡因混合溶液。</li>
	<li>缓慢地在胚胎上方滴加 5–10 µl 低熔点琼脂糖:三卡因混合液，每滴之间保持一定距离，以防止胚胎意外漂移靠近。 
	警告：若琼脂糖温度过高，会损伤胚胎。建议将琼脂糖保持在 42 °C 左右为宜。</li>
	<li>使用 21 G 1½ 号针头轻轻调整胚胎在琼脂糖中的方向。若使用倒置显微镜进行延时成像，应将感兴趣区域（ROI）尽可能贴近盖玻片。 
	注：一般而言，尾部区域组织较薄，便于定位和观察（图 1A）。其他组织如卵黄周围上皮层和鳍褶也可用于成像28,29。这些区域透明度高，但仅有少数几层细胞。本实验方案推荐成像尾部区域，以尽可能获取更多的细胞分裂事件。</li>
	<li>静置数分钟，使琼脂糖部分凝固。用针头挑取一小块琼脂糖测试其凝固程度。当可从液滴中拉出固体状琼脂时，即可进行下一步操作。</li>
	<li>将低熔点琼脂糖完全覆盖整个盖玻片，形成覆盖胚胎的穹顶状结构。待琼脂糖完全凝固后，再移动培养皿进行共聚焦显微成像（图 1A）。</li>
	<li>在琼脂糖凝固过程中（约需 10 分钟），准备 3 ml E3 Blue 溶液，并加入五滴（约 250 µl）15 mM 三卡因溶液，用于成像时覆盖在包埋的胚胎上方。</li>
</ol>
4. 活体斑马鱼胚胎的5D共聚焦成像40,41
注意：有关使用其他共聚焦系统进行5D成像的详细信息，请参见Ariga40和O'Brien41。关于Z间隔、Z层扫描、Z深度、时间间隔和5D的定义，请参见图1C。
<ol>
	<li>打开成像软件，将显微镜设置为60倍、数值孔径（NA）1.4的物镜。在物镜上滴加浸油，并将培养皿放置于显微镜载物台的载物片夹持器中。使用轴控制器将目标胚胎移至物镜正上方，并向上移动物镜使其接触培养皿底部。</li>
	<li>点击目镜图标，并在显微镜上切换至GFP滤光片。对感兴趣区域（ROI）进行调焦。优先对最接近盖玻片的组织进行聚焦，以获得最佳成像效果。</li>
	<li>解除联锁装置。选择GFP和mCherry通道（软件中预设的激发波长），并将线平均选项设置为“正常”。</li>
	<li>使用&#34;View/Acquisition Controls/A1 Scan Area&#34;命令打开A1扫描区域工具。</li>
	<li>开始扫描。使用轴控制器调整胚胎位置，使扫描区域尽可能多地覆盖斑马鱼个体。此时激光功率无需达到最优值，应降低激光功率以避免不必要的光漂白。</li>
	<li>使用&#34;View/Acquisition Controls/ND acquisition&#34;命令打开ND时间序列采集控制面板。</li>
	<li>开始扫描以设定Z轴堆栈参数。将Z轴上限设为细胞失焦的位置，下限设为细胞不再可见的位置。在样品上方预留3 µm空间，以容纳可能向成像视野扩展的生长和细胞运动。本实验方案中所示图像的Z轴堆栈覆盖了胚胎尾部40 µm的深度。</li>
	<li>将Z轴步进间隔设为2 µm。通常情况下，一个细胞的直径约为10 µm，因此2 µm的步进可为每个细胞提供五个成像数据间隔用于分析。 
	注意：可获取的图像深度取决于Z轴步长。为尽可能多地成像处于有丝分裂过程中的细胞（大Z深度），需牺牲Z轴分辨率以换取更大的Z轴总深度。反之，若减小步长，则可提高Z轴分辨率，但会牺牲Z轴成像深度（小Z深度）。</li>
	<li>调节激光功率、高压（HV）和偏移量（offset）参数。在本实验方案所展示的实验中，GFP通道的激光功率、HV和偏移量分别设置为2–5、120–140和–9至–11；mCherry通道的相应参数分别设置为3–6、120–140和–3至–8。参数设定完成后，关闭扫描以防止不必要的激光照射，从而避免样品发生光毒性和光漂白。</li>
	<li>选择2倍线平均图标。&#34;无平均&#34;会导致图像噪点较多，而&#34;4倍线平均&#34;会显著延长扫描时间。采用2倍线平均可在图像质量与扫描速度之间达到最佳平衡。</li>
	<li>根据实验需求选择合适的时间间隔和总时长。对于野生型细胞分裂，建议采用每2分钟一次、持续2小时的采集方案，以准确测定有丝分裂持续时间（如图1、图2、图3A和图3B所示）。对于激活纺锤体组装检查点超过30分钟的分裂事件，则更适合采用每5分钟一次、持续4小时的采集方案，以更好地保留荧光信号，如图3C所示。</li>
	<li>勾选&#34;保存至文件&#34;选项，并命名文件以实现采集过程中自动保存。仔细核对所有参数设置无误后，点击&#34;开始运行&#34;。</li>
	<li>采集完成后，若需以三维形式查看文件，请点击体积阈值图标。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用该方法可推断核膜破裂、微管-动粒连接形成的中期板，以及姐妹染色单体的分离，从而在体内以时间依赖性方式形成两个新细胞。in vivo 观察斑马鱼的有丝分裂相较于固定样本和细胞培养系统具有优势，因为细胞处于自然生理环境中，组织透明便于使用荧光蛋白，且其发育相对较快，可进行活体延时成像。由于成年斑马鱼组织较厚（非皮肤或眼睛部位），成像的Z轴深度受限，因此本方案不适用于成年斑马鱼。尽管可使用表达 H2A.F/Z-EGFP 和 mCherry-CAAX 的转基因动物实现相同目的，但将 mRNA 注射到不同突变型斑马鱼中的方法更具灵活性和操作简便性，优于遗传杂交。当需要对受精后三天（dpf）或更晚时期的胚胎进行有丝分裂分析时，由于该快速发育生物体内 RNA 的半衰期较短，必须使用转基因动物。
其他用于观察有丝分裂的荧光蛋白也适用于本方案。例如，H2B-GFP mRNA 可作为染色质标记物，替代 H2A.F/Z-EGFP，并提供相似的标记效果。该技术还可使用其他荧光标记蛋白，包括 POM121、centrin、Eb1、Hec1 和 EMTB，分别可用于胚胎内活体成像核膜、中...

有丝分裂是生物体生长、分化和再生过程中至关重要的细胞过程。在间期完成DNA的精确准备和复制后，细胞即进入分裂状态。有丝分裂的第一阶段为前期，由细胞周期蛋白B/Cdk1的激活启动。前期的特征是染色质材料凝缩形成染色体。核膜破裂发生在前期与前中期之间的过渡阶段。在前中期，作为纺锤体形成成核中心的中心体开始向细胞两极迁移，同时延伸微管以寻找动粒附着位点。一旦附着成功，微管转变为末端附着模式，并通过张力作用使染色体排列在赤道板上1。当所有染色体均正确附着后，纺锤体组装检查点被满足，连接姐妹染色单体的黏连蛋白环被切割，微管缩短，将姐妹染色单体在后期拉向细胞两极2,3。最后一个阶段为末期，细胞伸长，两个新细胞核周围重新形成核膜。胞质分裂则通过分割两个子细胞的细胞质，完成整个分裂过程4-6。关键有丝分裂通路（例如，纺锤体组装检查点、中心体复制、姐妹染色单体黏连等）的异常可导致中期停滞、染色体错误分离以及基因组不稳定7-10。最终，调控有丝分裂的通路缺陷可能引发发育障碍和癌症，因此有必要在活体、脊椎动物、多细胞生物中可视化观察有丝分裂及其缺陷10-16。
斑马鱼胚胎因其组织透明、易于显微注射以及发育迅速，是活体成像研究的理想模式生物。本论文的总体目标是利用斑马鱼描述一种活体5D（空间维度X、Y、Z，时间及波长）有丝分裂成像方法17（图1C）。通过使用在不同有丝分裂通路中存在缺陷的斑马鱼突变体，可展示此类缺陷所导致的后果。在本实验方案中，选择Aurora B和Esco2突变体以说明这些缺陷。Aurora B是一种激酶，属于染色体乘客复合物（CPC），参与纺锤体形成和微管附着，同时也为胞质分裂过程中分裂沟的形成所必需18,19。在斑马鱼中，Aurora B的缺失会导致分裂沟诱导、胞质分裂以及染色体分离过程出现缺陷20。另一方面，Esco2是一种乙酰转移酶，对姐妹染色单体黏连至关重要21,22。它可对黏连蛋白环状结构中的SMC3部分进行乙酰化，从而稳定黏连蛋白，确保在中期-后期转换时染色体正确分离23。斑马鱼中Esco2的缺失会导致染色体错误分离、姐妹染色单体过早分离、基因组不稳定以及p53依赖性和非依赖性凋亡24,25。鉴于其可获得性，本研究将使用auroraBhi1045 和esco2hi2865突变型斑马鱼（下文分别简称为aurBm/m和esco2m/m）来演示该技术25-27。
将共聚焦显微镜与荧光标记的细胞结构相结合，使研究人员能够观察有丝分裂过程中染色质和细胞膜的动态变化25,28,29。历史上，荧光标记的组蛋白常用于染色质的可视化。组蛋白是一类核蛋白，由四种不同的成对亚基（H2A、H2B、H3 和 H4）组成，负责构成染色体的核小体结构30。尽管H2B可能是小鼠和细胞培养中使用最广泛的荧光蛋白标记组蛋白，但组蛋白2A家族Z（H2A.F/Z）在斑马鱼中的应用已被证明效果良好31,32。例如，刀豆蛋白A（Concanavalin A）和酪蛋白激酶1-γ（casein kinase 1-gamma）可定位于细胞膜，并已被证实可在海胆和果蝇中有效显示细胞膜结构33,34。其他研究也表明，CAAX荧光标记蛋白可标记细胞膜，并在斑马鱼中取得成功31。CAAX是一种基序，可被法尼基转移酶和牻牛儿基牻牛儿基转移酶等翻译后修饰酶识别。这些酶对蛋白的修饰使其与细胞膜结合，从而实现对细胞膜的标记35。
由于此前在斑马鱼中已有应用，本实验方案选择使用 H2A.F/Z 和 CAAX 分别标记染色质和细胞膜。该方法的应用可使研究人员在单细胞水平上监测有丝分裂过程，观察单个染色体的动态行为，同时还能同步监测可能影响组织分化与发育的多个细胞分裂事件。本文将重点介绍在单细胞水平上对有丝分裂过程中染色体分离动态的成像。在本论文中，将展示并讨论观察多次有丝分裂事件、计算分裂时间以及解析有丝分裂表型的能力。通过利用这些参数，可获取具有生理相关性的数据，并将其应用于多种受有丝分裂缺陷影响的疾病状态研究中。

<table><tbody><tr><td>pCS2 载体</td><td>由 K. Kwan 惠赠</td><td></td><td>用于目的质粒</td></tr><tr><td>NotI-HF 限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>用于质粒的限制性酶切</td></tr><tr><td>mMessage SP6 试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>用于&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;转录</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于纯化 mRNA</td></tr><tr><td>100 × 15 mm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>用于饲养胚胎</td></tr><tr><td>显微注射模具</td><td>自制</td><td></td><td>用于在显微注射过程中固定胚胎</td></tr><tr><td>琼脂糖 II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>用于包埋胚胎</td></tr><tr><td>三卡因（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>用于麻醉胚胎</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>亚甲蓝水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm 培养管</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>用于盛装熔化的琼脂</td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿（盖玻片底）&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>0 号，20 mm 玻璃，用于包埋胚胎</td></tr><tr><td>#5 镊子</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>用于去除胚胎的绒毛膜</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 规针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>用于在琼脂中定位胚胎</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>用于胚胎筛选和包埋，任何体视显微镜均可</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>用于延时成像</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜软件</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>用于图像采集与处理</td></tr></tbody></table>

活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

有丝分裂对生物体的生长和分化至关重要。该过程高度动态，需在较短时间内有序完成染色质凝缩、微管-动粒连接、染色体分离以及胞质分裂等一系列事件。这一精细过程中的任何错误均可能导致人类疾病，包括出生缺陷和癌症。传统研究人类有丝分裂相关疾病的方法通常依赖细胞培养系统，而此类系统缺乏研究人类疾病时所需的真实生理环境及发育或组织特异性背景。本实验方案通过提供一种在脊椎动物系统——斑马鱼（zebrafish）中高分辨率可视化染色体动态行为的方法，克服了诸多技术障碍。本方案将详细阐述一种可用于获取分裂细胞动态图像的技术流程，包括： 体外 转录、斑马鱼繁殖与收集、胚胎包埋以及延时成像。本方案的优化与改进方法也进行了探讨。利用注射了H2A.F/Z-EGFP（标记染色质）和mCherry-CAAX（标记细胞膜）mRNA的胚胎，对AB野生型中的有丝分裂进行观察， auroraBhi1045, 和 ESCO2hi2865 突变型斑马鱼被可视化。在斑马鱼中进行高分辨率活体成像，可观察到多次有丝分裂，从而在统计学上量化有丝分裂缺陷及有丝分裂进程的时间。此外，还可观察定义异常有丝分裂过程的定性特征（即， 染色体排列缺陷，染色体错误分离 等等。）以及染色体异常结果（即， 非整倍性，多倍性，微核， 等等。可观察到上述现象。该检测方法可用于观察组织分化/发育过程，并适用于突变型斑马鱼及药理学试剂的研究。通过可视化有丝分裂缺陷如何导致癌症和发育障碍，将极大增进对疾病发病机制的理解。

图2展示了利用宽视野观察AB野生型斑马鱼尾部多个细胞分裂的能力。在14分钟的时间范围内成像了超过7个有丝分裂细胞（视频1）。在连续两小时的时间序列中，共捕获了超过40次有丝分裂事件。平均而言，在AB胚胎中观察到50个分裂细胞，而在aurBm/m胚胎中观察到30个分裂细胞（图2B）。为校正成像细胞数量的影响，计算了有丝分裂细胞数与成像细胞总数的比值（图2C）。这些数据表明，aurBm/m胚胎中并非经历有丝分裂的细胞数量更少（图2B），而是成像的细胞总数较少。能够获取此类具有统计学意义的事件数量，将有助于提高统计效能。
图3 扩展了该技术，以...

有丝分裂对每一种生物都至关重要，其缺陷常导致癌症和发育障碍。利用本成像方案并以斑马鱼作为模型系统，研究人员可以在活体脊椎动物中观察有丝分裂过程，以及当有丝分裂过程出现异常时所产生的多种缺陷。

有丝分裂对生物体的生长和分化至关重要。该过程具有高度动态性，需要一系列有序的事件以完成染色质的正确分离……

本实验的总体目标是利用荧光标记的染色质和细胞膜蛋白，结合高分辨率共聚焦显微镜，对活体斑马鱼胚胎有丝分裂过程中染色体分离的保真度进行实时监测。该方法有助于回答有丝分裂领域中的关键科学问题，例如：有丝分裂缺陷如何在活体脊椎动物中导致发育异常或肿瘤形成？该技术的主要优势在于，我们能够在活体脊椎动物中直接观察有丝分裂过程，从而获取具有生理相关性的实验数据。在繁殖成年斑马鱼并将 H2A.F/Z-EGFP 和/或 pCS2 mCherry-CAAX RNA 注射到卵子后，成像前约两小时，使用荧光解剖显微镜鉴定表达 GFP 的胚胎。将亮绿色的 GFP 阳性胚胎转移至新的 100 × 15 毫米含 E3 蓝色培养基的培养皿中。将1%低熔点琼脂糖的E3蓝溶液煮沸。取3毫升融化的琼脂糖加入一支17 × 100毫米的培养管中。将培养管置于42°C水浴中保温，待用。准备15毫摩尔的三卡因、筛选后的胚胎、低熔点琼脂糖、E3蓝液、35毫米玻璃盖玻片底培养皿以及解剖显微镜。接下来，使用5号镊子小心去除3个胚胎的绒毛膜，并将胚胎放入单独的容器中进行麻醉。然后，用移液器向含有胚胎和5毫升培养基的培养皿中加入3滴15毫摩尔的三卡因。向含有1%熔化的琼脂糖的离心管中加入三到四滴15毫摩尔的三卡因溶液。当胚胎充分麻醉后，使用P200移液枪（剪去枪头前端约1厘米）将麻醉后的胚胎转移至载玻片底培养皿中。去除多余的E3蓝色三卡因溶液。缓慢加入5至10微升低熔点琼脂糖-三卡因溶液至胚胎上方，保持每滴溶液相互分离，以确保胚胎之间不会相互靠近。然后，使用21号1.5英寸针头轻轻将胚胎在琼脂糖中调整至所需方向；若使用倒置显微镜，应将感兴趣区域尽可能贴近盖玻片。由于可能发生位移，可能需要逐一检查每个胚胎，以确保其保持在所需位置。这一步可能需要重复多次，直至达到理想位置，因为琼脂在凝固过程中会固定位置。数分钟后，用一根细针挑取一小块琼脂糖，测试其是否已凝固；若该小块可从液滴中分离，则使用额外的低熔点琼脂糖在嵌入的胚胎上方形成一个穹顶状结构，完全覆盖整个盖玻片。在琼脂糖凝固的同时，准备 3 毫升含 5 滴 15 毫摩尔三卡因的 E3 蓝色培养基，用于覆盖成像过程中的包埋胚胎。为进行活体斑马鱼胚胎的 5D 共聚焦成像，打开成像软件，并将显微镜设置为 60 倍、数值孔径 1.4 的物镜。在物镜上滴加浸油，然后将培养皿放入显微镜载物台的样品夹中。使用轴控制器将目标胚胎置于物镜上方居中位置，并升起物镜使其接触培养皿。将E3蓝液和三卡因溶液倒入含有琼脂包埋胚胎的培养皿中。然后，单击目镜图标，通过目镜观察胚胎。禁用眼孔选择，选择“视图”、“采集控制”、“A1扫描区域”，以打开A1扫描区域工具。选择GFP通道，重新开始扫描，并聚焦于靠近盖玻片的感兴趣区域。停止扫描，选择GFP和mCherry通道，并将线平均选项设置为正常。现在，选择“查看”→“采集控制”→“ND采集”，打开A1 ND采集工具。开始扫描，然后使用轴控制器调整胚胎位置，使扫描区域尽可能多地包含斑马鱼。将Z轴堆栈的上限设置在细胞失焦的位置，确保样本上方留有额外三微米的空间，以容纳细胞生长和移动。然后，将下限设置在细胞不再可见的位置，并将Z轴步进间隔设为两微米。对于本实验中展示的实验，分别根据下表调整成像激光功率、HV（或增益）以及偏移水平。参数设置完成后，应关闭扫描以避免不必要的激光照射，从而防止样品发生光毒性和荧光淬灭。接下来，选择2倍线平均图标，以获得最佳的图像质量和最快的扫描速度。根据实验需求，选择适当的时间间隔和时间持续长度。对于野生型细胞分裂，以每2分钟为时间间隔、持续2小时的成像已足以确定有丝分裂的持续时间。对于激活纺锤体组装检查点超过30分钟的细胞分裂，则更适合采用每4至5分钟为时间间隔、持续4小时的成像，以保留荧光信号，如此处所示。为在采集过程中自动保存文件，请勾选“保存到文件”选项，并为文件命名。最后，仔细检查所有参数是否已正确设置，然后点击“Run Now”开始运行。采集完成后，若要以三维形式查看文件，请点击“Volume Threshold”图标。该图展示了利用AB野生型斑马鱼尾部的宽视野观察到的多次细胞分裂能力。细胞分裂以星号标示。相应的视频如下所示。平均观察到 AB 中有 50 个分裂细胞，aurora B 突变体中有 30 个分裂细胞。为了校正极光激酶B突变体胚胎中所成像的有丝分裂细胞数量减少的情况，计算了有丝分裂细胞数与成像细胞总数的比值，结果表明极光激酶B突变体胚胎中并非进行有丝分裂的细胞比例降低，而是成像的总细胞数量较少。为了定量有丝分裂持续时间，将完成一次细胞分裂所经历的时间间隔数乘以每个Z轴层扫图像之间的时间间隔。如本图所示，AB野生型细胞的平均分裂时间为25分钟，而极光激酶B突变体为58分钟。如在野生型胚胎中所见，每次有丝分裂的各个阶段均可区分。然而，在aurora B突变体胚胎中可观察到有丝分裂缺陷，包括有丝分裂停滞和失败的胞质分裂，导致形成双核细胞，以及随后微核的产生，这些现象支持了在该突变体中测得的分裂时间延长。一旦掌握，该技术从胚胎筛选到共聚焦显微镜参数设置可在一小时内完成。在进行该实验操作时，需始终牢记实验的具体背景，包括目标区域、持续时间、时间间隔以及Z轴深度。这有助于提高实验效率，同时避免光漂白和光毒性。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如染色体铺展技术，以探究所观察到的有丝分裂缺陷的成因，或通过药物处理来评估其对有丝分裂进程、持续时间或细胞命运的影响。该技术发展之后，为发育生物学和癌症生物学领域的研究人员利用斑马鱼探索有丝分裂奠定了基础。观看本视频后，您应充分了解如何包埋斑马鱼胚胎、进行有丝分裂的活体成像，以及分析有丝分裂的频率、持续时间与细胞命运。请注意，使用高功率激光器和荧光光源可能对眼睛造成伤害，因此在操作过程中必须采取预防措施，例如避免激光直接照射眼睛。

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发育生物学

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学习使用高分辨率共聚焦显微镜观察活体斑马鱼胚胎有丝分裂的方法。该技术利用荧光标记的染色质和细胞膜蛋白，帮助研究人员监测染色体分离保真度，并研究有丝分裂缺陷对发育和肿瘤形成的影响。

活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

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