Name: 从人骨髓分离Mesangiogenic祖细胞（多用途储值卡） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解从人骨髓中分离间充质祖细胞（MPC）的标准化实验方案，通过选择性培养条件获得高纯度细胞群体。该方法支持血管生成研究和MSC样细胞培养，为再生医学应用提供可靠的技术基础。

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作者特别感谢比萨大学外科、医学和分子病理学与重症监护医学系的 Paolo Parchi 博士，感谢他提供骨髓样本以及在人类骨祖细胞研究方面的专业知识

注意：在获得书面知情同意后，于髋关节置换术期间采集人骨髓（hBM）样本。在股骨颈截骨后、股骨扩髓前，立即使用含有500 U.I.肝素的20 ml注射器抽取新鲜骨髓。该方案可广泛适用于任何骨髓来源。
1. 人骨髓单个核细胞（hBM-MNCs）的分离
<ol>
	<li>取5–10 ml新鲜骨髓（BM）用D-PBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）稀释至50 ml，通过倒置混匀。将稀释后的液体均分为两份，每份25 ml，分别加入两个新的50 ml锥形管中，再向每管加入25 ml D-PBS，倒置混匀。</li>
	<li>将试管在室温下静置10分钟，使矿物质骨碎片和脂肪与溶液分离。</li>
	<li>用无菌巴斯德吸管小心移除漂浮的脂肪，并将细胞悬液通过70 μm滤器过滤，注意不要扰动底部的矿物质骨碎片沉淀。</li>
	<li>准备四个50 ml离心管，每管加入15 ml用于不连续密度梯度离心的培养基（密度为1.077 g/ml），确保该培养基处于室温。</li>
	<li>将20–25 ml稀释后的骨髓样本轻柔地铺加在密度梯度培养基上方。操作时应小心缓慢，使细胞悬液沿管壁缓缓流下，避免两层液体混合。</li>
	<li>在室温下以400 × g离心30分钟，离心过程中关闭刹车。</li>
	<li>用无菌巴斯德吸管收集两相界面处的乳白色细胞环，转移至一个新的50 ml离心管中。</li>
	<li>用新鲜培养基洗涤细胞：无酚红、低葡萄糖（1,000 mg/l）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含10%（v/v）混合人AB型血清（PhABS）、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素（DMEM/10% PhABS）。在400 × g下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀细胞重悬于5–10 ml新鲜DMEM/10% PhABS培养基中。</li>
	<li>进行细胞计数。将细胞悬液与台盼蓝按1:1比例稀释后，加样至血细胞计数板，在相差显微镜下观察。计数时排除体积小且呈完美圆形的红细胞以及被染成蓝色的死细胞。 
	注意：强烈建议对不同批次的PhABS进行筛选，以评估其在MPC回收中的表现。来自美国来源的PhABS效果最佳，而多数其他来源的血清则导致MPC培养物中含有更高比例的MSC样细胞。</li>
</ol>
2. 从人骨髓单个核细胞中分离MPC
<ol>
	<li>将15 ml新鲜DMEM/10% PhABS加入疏水性T-75培养瓶中，并在37 °C、5% CO2条件下预孵育30分钟，使pH和温度达到平衡。</li>
	<li>每瓶接种4 - 6 × 107个hBM-MNCs，在37 °C、5% CO2条件下培养48小时。</li>
	<li>吸除并弃去培养瓶中的培养基及非贴壁细胞，加入15 ml新鲜DMEM/10% PhABS，于37 °C、5% CO2条件下继续培养6 - 8天，每48小时更换一次培养基。 
	可选：为提高MPC产量，可将步骤2.3中获得的非贴壁细胞重新接种至新的培养瓶中，并按原代培养所述条件进行培养。</li>
	<li>吸除并弃去培养瓶中的培养基，用新鲜DMEM洗涤一次，然后加入2 ml无动物成分的蛋白酶解离溶液。在37 °C下孵育5 - 15分钟（避免长时间孵育）。</li>
	<li>加入10 ml新鲜DMEM/10% PhABS，吸出细胞悬液，以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除并弃去上清液，将沉淀重悬于1 - 2 ml新鲜DMEM/10% PhABS中。按步骤1.10所述方法进行细胞计数。 
	注意：不可使用胰蛋白酶/EDTA作为解离试剂。MPC对胰蛋白酶具有抗性。在收获细胞前，强烈建议对培养物进行形态学观察，以评估是否存在纺锤形间充质干细胞样细胞。若发现大量MSC样细胞污染，可通过选择性去除污染细胞来提高细胞产物的纯度。为此，可在收获MPC前进行胰蛋白酶消化处理，即加入2 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA作用2分钟，随后用5 ml DMEM/10% PhABS洗涤两次，再按上述方法进行蛋白酶处理。</li>
</ol>
3. 细胞表征
<ol>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>设置两份重复样本，每份10个5 用洗涤液重悬新分离的细胞：D-PBS 加入 0.5%（v/v）牛血清白蛋白（BSA）和 0.02%（w/v）叠氮化钠。400 × g 离心 5 分钟。 
		警告： 叠氮化钠具有毒性。</li>
		<li>将沉淀物重悬于200 µl洗涤液中，加入与荧光染料偶联的抗CD90、抗CD45、抗CD73和抗CD31抗体（&#34;测试&#34;）；同时设立同型对照（&#34;CTRL&#34;). 
		注意：染色抗体的用量应通过滴定确定或遵照制造商说明书操作。</li>
		<li>4 °C 下孵育样品 30 分钟。</li>
		<li>400 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 500 µl 洗涤液中，并至少采集 5 × 10⁵ 个细胞4 多色流式细胞仪检测事件 7 9 10.</li>
		<li>通过点图分析结果并使用 &#34;CTRL&#34; 记录事件以设定象限。 
		注意：为了将培养物定义为MPC培养物，CD73阳性细胞的比例需达到一定标准阴性CD90阴性CD45+CD31+ 细胞纯度应超过95%。对于某些特定应用， 即，基因表达分析中，回收率截断值需提高至97-98%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nestin 检测与 F-actin 组织结构分析
	<ol>
		<li>将新分离的MPC接种于培养板腔载玻片上（20,000/cm²）2）。在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养，使细胞贴壁。2.</li>
		<li>用洗涤液洗涤细胞，然后在室温下用4% (w/v) 多聚甲醛固定15分钟。去除固定剂后，加入洗涤液，孵育2分钟，倾去。</li>
		<li>重复洗涤两次。</li>
		<li>在室温下用含0.05% (v/v) Triton X-100的D-PBS孵育细胞15分钟以进行透化处理。</li>
		<li>通过无蛋白信号增强剂（室温孵育30分钟）或标准封闭液（含3% (w/v) BSA的D-PBS）终止反应。</li>
		<li>去除信号增强剂/封闭液。</li>
		<li>加入终浓度为 7 µg/ml (w/v) 的抗人巢蛋白（nestin）一抗，于 4 °C 湿润孵育盒中孵育过夜。同时，使用同型对照抗体以评估非特异性荧光信号。</li>
		<li>加入 D-PBS 缓冲液洗涤载玻片，静置 2 分钟后倾去。重复洗涤两次。</li>
		<li>加入终浓度为 2 µg/ml (w/v) 的荧光标记二抗，4 °C 避光孵育 1 小时。</li>
		<li>按照上述方法清洗载玻片。</li>
		<li>加入荧光标记的鬼笔环肽（5 U/mL），室温避光孵育30分钟，然后用D-PBS洗涤3次。</li>
		<li>移除腔室壁，将切片置于含有抗荧光淬灭剂和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的水性封片剂中封片，用于细胞核检测。随后进行成像。 7 9 10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. MPCs 的中胚层分化
<ol>
	<li>接种 2 × 104/cm2 经TC处理的T75培养瓶中接种 freshly isolated MPCs，于DMEM/10% PhABS中37 °C、5% CO₂条件下培养过夜，使细胞贴壁2.</li>
	<li>更换为标准的低血清培养基，约 200 µl/cm²2，用于间充质基质细胞扩增的培养基（MSC-RS 培养基）。将细胞培养至融合状态（P1-MSCs），通常从诱导开始约 7 至 10 天。每 2 天更换一次培养基。</li>
	<li>吸弃培养瓶中的培养基，用新鲜的 MSC-RS 培养基洗涤，加入 2 ml 无动物成分的蛋白酶解离液。在 37 °C 下孵育 5–15 分钟（避免长时间孵育）。</li>
	<li>加入10 ml新鲜MSC-RS培养基，吸取细胞悬液并在400 × g下离心5分钟</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀物重悬于1 - 2 ml新鲜MSC-RS培养基中。按步骤1.10所述进行细胞计数。</li>
	<li>通过接种 3 - 5 x 10 进行继代培养3 细胞/厘米²2将细胞培养至融合（P2-MSCs）。</li>
	<li>通过蛋白酶消化收集细胞，具体步骤如4.3至4.5所述，并按第3节所述进行后续表征。 
	注意：CD73 的百分比+CD90+CD45阴性CD31阴性 细胞分化率低于95%表明仅为部分分化，需要进一步传代培养。</li>
	<li>将P2代MSCs以2 × 10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板中4/cm2 在六孔TC处理板中，使用MSC-RS培养基培养至汇合。</li>
	<li>标记两个孔 &#34;无差异&#34; 更换MSC-RS培养基。</li>
	<li>标记两个孔 &#34;骨关节炎&#34; 并用 200 µl/cm 的培养基替换原有培养基2 标准成骨培养基，专为MSC分化设计。</li>
	<li>标记两个孔 &#34;脂肪&#34; 并用 200 µl/cm 的培养基替换原有培养基2 标准脂肪生成培养基，专为MSC分化设计。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 每48小时更换一次全部培养基。 
	注意：为了确保实验的可重复性，强烈建议使用标准的市售分化培养基。在分化条件下培养2至3周后，成骨诱导的细胞中可见钙盐沉积，而脂肪生成诱导的细胞中则明显出现细胞内脂滴积累。</li>
	<li>吸弃培养基，用 D-PBS 洗涤。</li>
	<li>加入1 ml 4%（w/v）的对甲醛，在室温下固定15分钟。</li>
	<li>加入 D-PBS 以去除固定剂，孵育 2 分钟后倾去。重复洗涤两次。</li>
	<li>染色一 &#34;无差异&#34; 以及另外两个 &#34;骨关节炎&#34; 在羟基磷灰石特异性荧光溶液中标记孔洞及一个 &#34;无差异&#34; 以及两个 &#34;脂肪&#34; 将指定孔加入200 nM Nile Red溶液中，在室温下孵育30分钟11,12.</li>
	<li>去除染色液，用 D-PBS 洗涤两次。</li>
	<li>移除 D-PBS，加入含 50% (v/v) 甘油的 D-PBS，并进行成像7 9 10.</li>
</ol>
5. MPC 球状体出芽实验
<ol>
	<li>为制备三维球体，将20 µl新鲜分离的MPC悬液（1.5 × 104 个细胞/滴）滴加在培养皿盖的内表面。 
	注意：由于操作液滴可能导致其破裂，建议多滴加一些以作备用。</li>
	<li>小心地将盖子倒扣在含有D-PBS的培养皿上，以防止悬滴蒸发。在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，使细胞聚集形成三维球体。</li>
	<li>在预冷的24孔细胞培养板中加入300 µl标准小鼠细胞外基质（ECM）蛋白等分试样，形成较厚的凝胶，并在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>小心翻转培养皿盖，用无菌巴斯德吸管轻柔吸取球体。</li>
	<li>将球体置于ECM蛋白凝胶上，加入700 µl标准含丰富VEGF的内皮细胞生长培养基，于37 °C、5% CO2条件下继续孵育。</li>
	<li>在培养24小时及第7天时，以4倍放大倍数拍摄三维培养物图像。通过图像分析软件评估球体出芽情况，测量最远侵袭细胞与球体边缘之间的径向距离，并沿至少20个不同方向重复测量。当平均距离达到50 µm或以上时，视为阳性结果。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

在过去的几十年中，间充质干细胞（MSCs）已被广泛研究，并在多种骨骼/关节、免疫、神经、心血管、胃肠道及血液系统疾病的治疗中进行了临床前评估。14,15多能间充质干细胞（MSCs）可从多种不同组织中简便且低成本地分离获得，且具有较低的免疫原性16，使得这些细胞成为细胞治疗应用中最引人关注的细胞群体之一。然而，其在原始组织中的极低频率严重限制了间充质干细胞在临床中的应用，因而必须对这些细胞进行扩增， 体外 在输注或移植之前。 
扩增的MSC培养物显示出高度的异质性和变异性17-19，使得在MSC的制备和表征方案上难以达成共识。此外，最近的研究表明，在多种组织中存在多种in vivo MSC前体细胞，这些细胞导致了培养物的异质性10,20。事实上，已有研究提出，特定的培养条件可能选择性地富集或促进“原始”且未经处理的样本（如骨髓单个核细胞（hBM-MNCs）或脂肪组织的基质血管组分）中以不同比例存在的MSC前体细胞的特定亚群2。因此，MSC起始细胞群体的差异性，加上所采用的各种富集/分离和培养方案的多样性，构成了实现可行的MSC基础治疗的重大障碍。
影响间充质干细胞（MSC）培养物异质性的关键因素之一是血清补充物21。在我们的实验中，使用PhABS替代FBS，并结合在疏水性塑料表面高密度接种人骨髓单个核细胞（hBM-MNCs），成功分离出一种具有独特生物学特性的新型高贴壁细胞群体，即MPCs5,6。我们还观察到，在FBS为主的原代培养体系中添加少量PhABS也可实现MPC的分离，提示人血清中存在可诱导MPC生成的活性成分6。目前，MPC的分离与鉴定方案是唯一可用于获得近乎纯化MPC群体的方法。该方案经过精细优化，具有高度可重复性，适用于在进一步应用前对MPC制备物进行质量筛选。
MPC 可用作 MSC 生产的来源，从而限制使用未分选起始材料所引入的变异性。明确界定文献中报道的 MPC 成间质系分化过程中的多个步骤9，将有助于实现间充质细胞的同步扩增。然而，这一理想状态只有在应用高度纯化的 MPC 群体时才能实现，因此，对本方案所获得细胞产物的表征显得至关重要。已有研究报道，该分离方法可实现 MPC 的回收，纯度通常约为 95%。然而，由于供体/患者之间的差异，以及所使用不同批次人混合血清带来的变异性，在选择性条件下，可能导致相当比例的类 MSC 细胞与 MPC 共同被分离出来。
目前尚不清楚这些“污染性”的类似MSC细胞是否可能来源于骨髓中描述的其他不同类型in vivo前体细胞22，或源于不受控且自发的MPC分化。无论何种情况，MPC产物中稳定存在的一定比例的类似MSC细胞，使得这些细胞无法作为均一的起始材料用于MSC扩增。因此，本文提出一种基于MPC对胰蛋白酶消化具有抗性的简单且低成本方法，以提高MPC产物的纯度。通过荧光或磁性细胞分选技术进行CD73和/或CD90耗竭，也可获得相似甚至更优的MPC培养纯化效果，但会显著延长操作时间并增加成本。
此外，MPCs 表达多能性相关标志物和 Nestin，这些标志物在向间充质谱系分化过程中迅速丢失7。出芽实验显示 MPCs 能够侵入小鼠 ECM 蛋白凝胶。综合这些结果表明，MPCs 应被视为一种更为原始的前体细胞，保留了血管生成潜能。然而，目前对 MPCs 向中胚层分化潜能的最初热情正在减退。事实上，在对 MPCs 进行了超过 7 年的研究后，其向间充质和血管生成方向的分化潜能虽已被广泛描述5-9，但尚未有证据表明其可分化为其他中胚层来源的细胞类型。因此，本文提出对这类细胞采用一种新的、更为严谨的定义，即“间血管前体细胞”（Mesangiogenic Progenitor Cells），并保留其缩写 MPCs。
我们还认为，关于间充质干细胞促血管生成潜能的大多数争议可能与扩增培养物的异质性组成有关，这些培养物包含不同比例的间充质前体细胞（MPCs）和间充质干细胞（MSCs）23。
最后，MPCs 在适用于组织重建的 CBMPs 实施过程中也可能发挥关键作用，因为这些细胞还可支持新生血管形成。事实上，未来的再生研究应考虑到，新形成组织的生长需要伴随的新生血管生成来提供支持。MPCs 中间充质分化潜能与血管生成潜能的共存，可显著提升涉及这些有趣细胞的新型治疗策略的再生能力。

间充质基质细胞（MSCs）因其多向分化潜能以及支持造血、分泌生长因子/细胞因子并在免疫调节中发挥作用的能力，具有重要的临床应用价值1。在基于MSC的治疗定义中，细胞的生产与应用已成为大量临床及临床前研究的重点2，尤其关注针对细胞治疗药物（CBMP）安全性和有效性的特定国际法规3。目前，人源MSC广泛使用含有动物来源补充物和试剂的培养基进行扩增，例如胎牛血清（FBS）和牛胰蛋白酶。因此，除了细胞操作相关的感染风险外，患者还可能面临朊病毒暴露风险，以及因动物来源的蛋白质、多肽或其他生物分子在细胞收获和移植后仍可能残留而引发的免疫学风险4。
为解决这一问题，我们采用无动物成分的培养基培养人骨髓来源的间充质干细胞（hBM-MSCs），以人AB型混合血清（PhABS）替代胎牛血清（FBS）。在此条件下，除了培养MSCs外，我们还鉴定出一种新的细胞群体。这些细胞在形态学和表型上均不同于MSCs，具有独特的基因表达谱以及特征性的生长/黏附特性。它们保留了中胚层分化潜能和促血管生成潜能，因此被命名为中胚层祖细胞（Mesodermal Progenitor Cells, MPCs）5。随后，我们成功确定了可选择性且可重复的培养条件，能够以高纯度获得MPCs6。
我们进一步研究了MPC的形态学和生物学特性。MPC呈nestin阳性，细胞周期缓慢，Ki-67阴性，其染色体具有较长的端粒5。它们表达多能性相关转录因子Oct-4和Nanog，而不表达间充质干细胞（MSC）主调控因子Runx2和Sox97。在表型上，MPC表达内皮糖蛋白（CD105）的水平低于MSC，且缺乏间充质标志物CD73、CD90和CD166。MPC还表现出独特的黏附分子表达模式，持续表达血小板-内皮细胞黏附分子（PECAM，CD31）、整合素αL（CD11a）、αM（CD11b）、αX（CD11c）以及整合素β2（CD18），后者可特异性维持类足体样结构8。在标准MSC扩增培养基中，MPC通过一个中间阶段迅速分化为MSC，该过程涉及Wnt5/钙调蛋白细胞信号通路的激活9。此外，MPC保留了血管生成能力，表现为在小鼠细胞外基质（ECM）蛋白三维培养中能够从小球体出芽形成血管样结构。然而，当MPC沿间充质谱系分化后，其血管生成潜能迅速丧失。
本文介绍了从人骨髓（hBM）血液样本中分离和表征高纯度MPC的优化方案。同时描述了MPC成间质和促血管生成分化的可重复性实验方案。

<table><tbody><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>BD Bioscience (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>354230</td><td>小鼠 ECM 蛋白&lt;br/&gt; 储存浓度：100% (9 - 12 mg/ml)&lt;br/&gt; 最终浓度：100%</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 (D-PBS)</td><td>Sigma (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Miltenyi Biotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare (瑞典乌普萨拉)</td><td>17-5442-03</td><td>不连续密度梯度离心介质</td></tr><tr><td>人 AB 型混合血清 (PhABS)</td><td>LONZA (美国马里兰州沃克维尔)</td><td>14-490E</td><td>最终浓度：10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>35050-038</td><td>稳定型 L-谷氨酰胺&lt;br/&gt; 储存浓度：100x&lt;br/&gt; 最终浓度：2 mM</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>A8412</td><td>储存浓度：7.5%&lt;br/&gt; 最终浓度：0.5%</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>S8032</td><td>最终浓度：0.02%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 (Pen Strep)</td><td>Gibco (美国纽约州大岛)</td><td>15070-063</td><td>抗生素&lt;br/&gt; 储存浓度：5,000 UI/ml 青霉素，5,000 &amp;#956;g/ml 链霉素&lt;br/&gt; 最终浓度：50 UI/ml 青霉素，50 &amp;#956;g/ml 链霉素</td></tr><tr><td>悬浮培养用 T-75 培养瓶</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp; (德国弗里克豪森)</td><td>658 190</td><td></td></tr><tr><td>T-75 细胞培养处理培养瓶</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp; (德国弗里克豪森)</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>12563-011</td><td>无动物源性蛋白酶解离溶液&lt;br/&gt; 储存浓度：1x&lt;br/&gt; 最终浓度：1x</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>15400-054</td><td>无酚红&lt;br/&gt; 储存浓度：0.5%&lt;br/&gt; 最终浓度：0.25%</td></tr><tr><td>抗 CD90 APC 抗体&amp;nbsp; (CD90)</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-095-402</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>抗 CD45 APC-Vio770 抗体 (CD45)</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-096-609</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>抗 CD73 PE 抗体 (CD73)</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-095-182</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>抗 CD31 PE Vio-770 抗体 (CD31)</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-105-260</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 APC 抗体</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-098-846</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>小鼠 IgG2a APC Vio770 抗体</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-096-637</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 PE 抗体</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-098-845</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 PE Vio-770 抗体</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-098-563</td><td>最终浓度：1:40</td></tr><tr><td>低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基&amp;nbsp; (DMEM)</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>13-1331-82</td><td>无酚红最低必需培养基&lt;br/&gt; 储存浓度：1,000 mg/L 葡萄糖</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp; (FBS)</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>10500</td><td>储存浓度：0.2 mg/ml&lt;br/&gt; 最终浓度：2 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>含 4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>P-36931</td><td>水性封片介质 + DAPI&lt;br/&gt; 最终浓度：1x</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>P6148</td><td>固定剂&lt;br/&gt; 最终浓度：4%</td></tr><tr><td>LAB-TEK 双孔腔室载玻片</td><td>Sigma (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>C6682</td><td></td></tr><tr><td>抗 Nestin 抗体 [克隆 10C2]</td><td>Abcam (英国剑桥)</td><td>ab2035</td><td>储存浓度：1 mg/ml&lt;br/&gt; 最终浓度：7 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 鬼笔环肽</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>A34055</td><td>储存浓度：200 UI/ml&lt;br/&gt; 最终浓度：5 UI/ml</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Euroclone (意大利米兰)</td><td>EMR237500</td><td>最终浓度：0.05%</td></tr><tr><td>MesenPRO RS 培养基&amp;nbsp; (MSC-RS 培养基)</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>12746-012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗小鼠 SFX 试剂盒</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>A31619</td><td>山羊抗小鼠二抗 + 信号增强剂&lt;br/&gt; 储存浓度：2 mg/ml&lt;br/&gt; 最终浓度：2 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Kartell Labware&amp;nbsp; (意大利诺维廖 (MI))</td><td>329</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS AdipoDiff&amp;nbsp; 培养基</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-091-679</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS OsteoDiff&amp;nbsp; 培养基</td><td>MiltenyiBiotec (德国贝尔吉施格拉德巴赫)</td><td>130-091-678</td><td></td></tr><tr><td>Osteoimage 骨矿化检测试剂盒</td><td>LONZA (美国马里兰州沃克维尔)</td><td>PA-1503</td><td>特异性针对羟基磷灰石的荧光染色溶液</td></tr><tr><td>50 ml 聚苯乙烯锥形管</td><td>Greiner bio-one (奥地利克雷姆斯明斯特&amp;uuml;nster&lt;br/&gt;)</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>尼罗红</td><td>ThermoFisher (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆&amp;nbsp;)</td><td>N1142</td><td>脂质荧光染色溶液&lt;br/&gt; 储存浓度：100 mM&lt;br/&gt; 最终浓度：200 Nm</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>G2289</td><td>最终浓度：50%</td></tr><tr><td>聚苯乙烯培养皿</td><td>Sigma (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养处理板</td><td>Greiner Bio-one GmbH (德国弗里克豪森)</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 EGM-2 BulletKit&amp;nbsp; (EGM-2)</td><td>LONZA (美国马里兰州沃克维尔)</td><td>CC-3162</td><td>富含 VEGF 的内皮细胞生长培养基</td></tr><tr><td>Leica Qwin 图像分析软件</td><td>Leica (德国韦茨拉尔)</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr></tbody></table>

从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（mpcs）

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

在一项旨在分离用于临床应用的人类骨髓（hBM）来源的间充质基质细胞（MSCs）的研究中，我们鉴定出一种新型细胞群体，该群体可在添加人血清的培养基中特异性生长。这些细胞在形态学、表型和分子特征上均与MSCs不同，我们将其命名为中胚层祖细胞（Mesodermal Progenitor Cells, MPCs）。MPCs呈圆形，具有致密且高度折光的核心区域；它们对塑料表面具有强而耐胰蛋白酶的黏附性。MPCs难以扩增的结果直接表明其细胞周期缓慢，Ki-67阴性也进一步支持了这一特性。另一方面，将MPCs培养于专为MSC扩增设计的标准培养基中，可产生一群呈指数生长的、类似MSC的细胞。除了具备间充质分化潜能外，MPCs还保留了促血管生成潜能，证实其具有多谱系祖细胞的特性。本文中，我们描述了一种优化的、高度可重复的方案，用于通过流式细胞术（CD73、CD90、CD31和CD45）、巢蛋白（nestin）表达以及F-actin结构来分离和鉴定hBM-MPCs。同时提供了MPCs向间充质系和血管生成方向分化的实验方案。此外，我们建议对这些细胞采用更为恰当的命名，现已将其重新命名为“促血管生成性中胚层祖细胞”（Mesangiogenic Progenitor Cells）。

本文所述的选择性培养条件已成功分离出一种新型的贴壁且几乎呈单形性的细胞群体，占人骨髓单个核细胞（hBM-MNCs）的1.0%（从5–10 ml新鲜骨髓样本中获得0.5–2.0 × 106个hBM-MNCs）5,6。我们鉴定出这些较大（直径40–60 µm）、呈圆形、静息状态且Ki-67阴性的细胞为MPCs5。在形态学上，它们具有明显的“煎蛋样”外形，中心区域较厚，周围为扁平而薄的边缘，在高倍镜下可见大量丝状伪足（图1 A.1中的白色箭头）。细胞外边界常出现极性伸长现象（图1 A.1中的黑色箭头）。这种形态明显不同于标准MSC培养中报道的典型纺锤形间充质基质细胞形态。流式细胞术分析显示，新分离的MPCs中有超过95%表达CD31和CD45，而间充质相关标志物CD90和CD7313则无法检测到（图1 A.2）。我们认为这四种抗原的特定表达模式是MPCs的指示性特征。MPCs的其他鉴别特征包括呈点状分布的F-actin，显示出多个类似足体（podosome）的结构（图1 A.3中红色信号），以及nestin的强烈表达（图1 A.3中绿色信号），而在使用同型对照抗体染色的细胞中未检测到nestin表达（数据未显示）。
在专为MSC扩增设计的标准RS培养基中培养MPC，会导致其迅速分化为呈指数生长的类MSC细胞（图1 B.1）。经过两次传代后，细胞的表型最终从CD73negCD90negCD45+CD31+转变为CD73+CD90+CD45negCD31neg（图1 B.2）。在此过程中，MPC将F-肌动蛋白重组为应力纤维，而nestin的表达则局限于极少数稀有细胞中（图1 B.3）。MPC向明确的类MSC表型的间充质分化通过两个不同阶段完成，这两个阶段可通过细胞形态的差异加以识别。在MSC RS培养基中培养一周后，在融合生长的扁平、多角形多分支细胞层中仍可检测到少量残余的类MPC细胞（图2 A中的P1-MSCs）。需再进行一次传代，才能获得几乎单形性的梭形类MSC细胞群体（图2 A中的P2-MSCs）。这些呈指数生长的细胞在转入选择性诱导培养基培养至少2周后，可轻松分化为成骨细胞或脂肪细胞，从而证实其MSC特性。在成骨诱导培养物中，可通过比色法茜素红染色或特异性荧光染料（图2 B中绿色）检测到钙沉积。经脂肪诱导后，细胞内脂滴积聚，可通过比色法油红O染色或荧光尼罗红染色（图2 B中红色）显示。
通过出芽式血管生成实验确认了MPC的分型。在VEGF刺激24小时后，MPC表现出从三维球状体侵袭小鼠ECM蛋白凝胶的能力（超过50 µm）（图2 C）。一周后，可在距离300 - 600 µm处检测到侵袭的细胞。相反，P2-MSC在成间质细胞分化后丧失了侵袭能力（图2 D）。
<img alt="显示显微镜图像和流式细胞术图的细胞分化示意图；免疫荧光染色。" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 新分离的MPC具有独特的特征。 将hBM-MNC在DMEM/10% PhABS中培养七天，可获得一群静息状态的MPC(A)，其在形态学（A.1，B.1，比例尺 = 100 µm）、表型（A.2，B.2）、F-肌动蛋白分布（A.3，B.3中的红色）以及巢蛋白表达（A.3，B.3中的绿色，比例尺 = 20 µm）等方面均明显区别于MSC(B)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="P1与P2代间充质干细胞显微观察、荧光检测、7天细胞生长分析、蛋白表达" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. MPCs 分化为标准 MSCs 并表现出出芽式血管生成 体外. 将DMEM/PhABS替换为市售的专用于MSC扩增的RS培养基，可触发MPC的间充质向诱导。培养一周后，仍可检测到少量残余的MPC（P1-MSCs），而在MSC-RS培养基中进一步传代后，则获得融合生长的MSC样细胞群（P2-MSCs）。 A 比例尺 = 100 µm）。在适当刺激下，P2-MSCs 可终末分化为成骨细胞或脂肪细胞，这一点通过钙沉积（绿色）得以证实 B）以及脂滴积累（B图中的红色，比例尺 = 200 µm），分别。在小鼠ECM蛋白凝胶中，MPCs从小球体中表现出一致的出芽现象。C) 与P2-MSCs存在差异（D，比例尺 = 1.0 mm）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种优化的、高度可重复的人骨髓（hBM）中胚层祖细胞（MPCs）分离方案。通过流式细胞术和巢蛋白（nestin）表达对MPCs进行了表征。这些细胞能够产生呈指数生长的类似间充质干细胞（MSC）的细胞培养物，同时保留其血管生成潜能。

从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（MPCs）

在一项旨在分离人骨髓（hBM）来源的间充质基质细胞（MSCs）用于临床应用的研究中，我们鉴定出一种新型……

本实验的总体目标是通过选择性培养条件，从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（MPC）。我们正在检测这些细胞的成间质潜能和血管生成潜能。在优化用于临床应用的间充质细胞培养体系中，间血管生成祖细胞仅以较低比例被鉴定出来。当使用人血清替代FBS时，该技术具有独特性，因为它能够非常稳定地分离出大量适用于出芽性血管生成的异源性NPC，并可生成同步化的MSC培养物。我们是在用塔尔格拉姆血清消化MCS培养物后发现这一现象的：少数呈煎蛋样形态的细胞在FBS处理后仍保持贴壁状态，并分化为MC。分离人骨髓单个核细胞（MNC）时，首先用DPBS将5至10毫升新鲜骨髓稀释至总体积50毫升，并通过倒置混匀细胞悬液。接着，将25毫升细胞悬液均分至两个新的50毫升锥形管中，每管加入25毫升新鲜DPBS，再次通过倒置充分混匀。然后将细胞在室温下静置，使矿化骨碎片和脂肪从悬液中分离。10 分钟后，使用巴斯德吸管小心移除上层漂浮的脂肪，并将细胞悬液分别通过 70 微米滤膜过滤，注意不要扰动矿化骨碎片沉淀。为了分离单个核细胞层，将 20–25 毫升稀释后的骨髓液小心加在两个 50 毫升离心管中室温下预平衡的 1.007 克/毫升密度梯度介质上方，通过离心分离细胞。然后使用无菌巴斯德吸管收集两管中界面处的乳白色细胞环，合并至一个新的 50 毫升离心管中。以400 × g在室温下用新鲜培养基洗涤分离的单个核细胞5分钟。然后将细胞沉淀重悬于5至10毫升新鲜培养基中。为分离MPC，用15毫升新鲜培养基在37摄氏度、5%二氧化碳条件下平衡疏水性T75培养瓶。30分钟后，每瓶接种4×10⁷至6×10⁷个人类骨髓单个核细胞，培养48小时。第二天，弃去培养瓶中的培养基和非贴壁细胞，加入15毫升新鲜培养基继续培养。将培养物放回培养箱中继续培养6至8天。孵育结束后，用新鲜的DMEM洗涤贴壁细胞。然后加入2毫升无动物成分的蛋白酶解离液，在37摄氏度孵育5至15分钟。当细胞从培养瓶底部脱落时，加入10毫升新鲜培养基以终止反应，并通过离心收集细胞，将沉淀重悬于1至2毫升新鲜培养基中。将MPC细胞以每平方厘米10的4次方个细胞的密度接种到经组织培养处理的T75培养瓶中，每瓶加入15毫升新鲜培养基，在细胞培养箱中过夜贴壁。次日早晨，更换为每平方厘米200微升的MSC完全培养基或MSC扩增培养基，继续培养7至10天。当细胞培养达到汇合状态时，以每平方厘米3至5×10³个细胞的密度进行传代，直至获得第二代MSC的新一轮汇合，随后通过蛋白酶消化法收集细胞，操作步骤如前所述。在经组织培养处理的六孔板中，以每平方厘米2×10⁴个细胞的密度接种，并加入新鲜扩增培养基。待细胞再次生长至融合后，标记两个孔为“无分化”组，并更换为新鲜扩增培养基；另标记两个孔为“成骨细胞”组，弃去原培养基，加入专为间充质干细胞分化设计的标准成骨诱导培养基，用量为每平方厘米200 µL。然后标记两个孔为成脂孔，并将培养基更换为200微升/平方厘米的标准成脂诱导培养基（专为MSC分化设计）。将细胞放回细胞培养箱中培养2至3周，直至细胞完成分化。随后进行细胞外钙沉积物的荧光检测以及细胞内脂滴积累的检测。为制备三维球状体，将大量 freshly isolated MPC 悬液的 20 微升液滴接种于培养皿盖内表面。待所有液滴放置完毕后，小心将皿盖置于含有 DPBS 的培养皿底部上，以防止悬滴蒸发，并将培养皿放入细胞培养箱中孵育过夜。次日早晨，向预冷至 4 摄氏度的 24 孔细胞培养板的每孔中加入 300 微升标准细胞外基质蛋白等分试样，并在 37 摄氏度下使基质蛋白凝胶化 30 分钟。向凝胶化的细胞外基质蛋白中加入 700 µL 含标准浓度血管内皮生长因子的内皮细胞生长培养基。当 MPC 细胞聚集成 3D 球体后，小心地将培养皿盖倒置，并使用无菌巴斯德吸管轻柔地收集球体。最后将球体接种至培养板孔中，并将培养板放回培养箱继续培养。形态学上，MPC 的特征是其独特的煎蛋样形状，具有较厚的核心区域，周围环绕着扁平且较薄的边缘，边缘表现出许多伪足。常可观察到外层细胞边界的极性伸长。在 MSC 扩增培养基中培养 MPC 时，会迅速发生部分分化，形成增殖性的扁平且多分支的细胞，但仍可检测到残留的未分化 MPC。经过进一步传代培养后，获得呈指数生长的MSC样细胞的单层细胞。在此过程中，MPC将其F-肌动蛋白重组为应力纤维，而Nestin的表达则仅局限于极少数稀疏的细胞。对 freshly isolated MPC 进行流式细胞术分析显示，超过95%的细胞表达CD31和CD45，但不表达间充质相关抗原CD90和CD73。这些最新的抗原仅在完全分化为间充质干细胞（MSC）后才高度表达。当使用诱导分化培养基培养至少两周后，这些细胞可被迅速诱导分化为成骨细胞，表现为钙盐沉积，或分化为脂肪细胞，表现为脂滴积聚，从而证实了前体细胞培养物的间充质干细胞特性。MPC 分型通过出芽型血管生成实验进一步验证，结果显示，在血管内皮生长因子刺激 24 小时后，细胞能够从三维球状体侵入 Matrigel 基质胶。一周后，侵袭细胞迁移的距离更远，而经中胚层分化后的第二代 MSCs 则丧失了这种侵袭能力。一旦掌握该技术，若操作得当，可在 1 小时内建立 MSC 培养体系，于不到 1 周的时间内获得一百万至两百万个 MPC。在尝试该操作时，重要的是在将人源条件培养基（CR）批次用于培养前，先评估其性能。目前，我们的MPC分离方案是获得高重复性、近乎纯化的MC培养物以用于后续下游应用的唯一方法。该技术建立后，为细胞治疗领域研究人员探索MPC在骨骼组织再生中应用的可能性开辟了道路。

isolating-mesangiogenic-progenitor-cells-mpcs-from-human-bone-marrow

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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本实验方案的目的是从脐带血中分离内皮祖细胞。这些细胞的一些应用包括将其作为生物标志物用于识别心血管疾病风险患者、治疗缺血性疾病，以及构建组织工程化的血管和心脏瓣膜结构。...

从人脐带血中分离内皮祖细胞

本文介绍了一种分离和培养小鼠腹腔肥大细胞的实验方案。同时，我们还描述了两种用于其功能表征的方法：一种是通过荧光成像检测细胞内游离Ca2+浓度的变化，另一种是基于比色法定量释放的β-己糖胺酶来评估脱颗粒反应的实验方法。...

腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca2+-成像与脱颗粒实验进行的功能表征

我们介绍了从骨骼肌活检组织中分离、培养、鉴定和诱导人原代肌前体细胞（hMPCs）的技术。...

从骨骼肌活检手术中分离、培养、鉴定及诱导人肌肉前体细胞分化

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

本方案描述了一种经济高效的方法，用于纯化、扩增和表征小鼠来源的高度均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。该方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜能的BMSCs，可支持小鼠模型研究并推动临床前研究的进展。...

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

了解从人骨髓中分离间充质祖细胞（MPC）的标准化实验方案，通过选择性培养条件获得高纯度细胞群体。该方法支持血管生成研究和MSC样细胞培养，为再生医学应用提供可靠的技术基础。

从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（MPCs）

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