从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（MPCs）

本实验的总体目标是通过选择性培养条件，从人骨髓中分离间血管生成祖细胞（MPC）。我们正在检测这些细胞的成 meso（间质）潜能和血管生成潜能。间血管生成祖细胞在骨髓中所占比例较低，需采用针对临床应用优化的间充质干细胞培养体系进行鉴定。

当使用人血清替代胎牛血清（FBS）时，该技术具有独特优势，因为它能够非常稳定地分离出大量适用于出芽型血管生成的同种异体诱导型NPCs，并可生成同步化的间充质干细胞（MSC）培养物。我们是在将MCS培养物在胎格拉姆血清中进行消化处理后发现这一现象的：少数呈煎蛋样形态的细胞仍保持贴壁状态，并在FPS处理后分化为MCs。

分离人骨髓单个核细胞（MNC）时，首先用DPBS将5至10毫升新鲜骨髓稀释至总体积50毫升，并通过倒置混匀细胞悬液。接着将25毫升细胞悬液均分至两个新的50毫升锥形管中，每管加入25毫升新鲜DPBS，再次通过倒置混匀。然后将细胞在室温下静置，使矿化的骨碎片和脂肪从悬液中分离。

10 分钟后，使用巴斯德吸管小心移除上层漂浮的脂肪，并将细胞悬液分别通过 70 微米滤膜过滤，注意不要扰动矿化骨碎片沉淀。为了分离单个核细胞层，将每根 50 毫升离心管中 20–25 毫升稀释后的骨髓样品小心铺加在室温下 1.007 克/毫升密度梯度介质上方，通过离心分离细胞。然后使用无菌巴斯德吸管收集两管中界面处的乳白色细胞环，合并至一个新的 50 毫升离心管中。

在400 × g、室温条件下，用新鲜培养基洗涤分离的单个核细胞5分钟。然后将沉淀重悬于5至10毫升新鲜培养基中。为分离MPC，需在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用15毫升新鲜培养基预平衡疏水性T75培养瓶。

30分钟后，每瓶接种4×10⁷至6×10⁷个人类骨髓单个核细胞，培养48小时。第二天，弃去培养瓶中的培养基和非贴壁细胞，加入15 mL新鲜培养基继续培养。将培养物放回培养箱中继续培养6至8天。

孵育结束后，用新鲜的DMEM洗涤贴壁细胞。然后加入2毫升无动物成分的Proteas解离溶液，在37摄氏度下孵育5至15分钟。当细胞从培养瓶底部脱落时，加入10毫升新鲜培养基以终止反应，并通过离心收集细胞，将沉淀重悬于1至2毫升新鲜培养基中。

将MPC细胞以每平方厘米10的4次方个细胞的密度接种到经组织培养处理的T75培养瓶中，每瓶加入15毫升新鲜培养基，在细胞培养箱中过夜贴壁。次日早晨，更换为每平方厘米200微升的间充质基质细胞（MSC）扩增培养基，继续培养7至10天。当细胞培养达到汇合状态时，以每平方厘米3至5×10³个细胞的密度进行传代，直至获得第二代（passage two）MSC的完全汇合状态，随后通过蛋白酶消化法收集细胞，操作步骤如前所述。

在经组织培养处理的六孔板中，以每平方厘米2×10⁴个细胞的密度接种，并加入新鲜扩增培养基。待细胞再次生长至融合后，标记两个孔为“无分化”组，并更换为新鲜扩增培养基。另标记两个孔为“成骨细胞”组，弃去原培养基，加入专为间充质干细胞分化设计的标准成骨诱导培养基，用量为每平方厘米200 µL。

然后标记两个孔为成脂位点，并将培养基更换为200 µL/cm²的标准成脂诱导培养基，该培养基专为MSC分化设计。将细胞放回细胞培养箱中培养2至3周，直至细胞完成分化。随后进行细胞外钙沉积物的荧光检测以及细胞内脂滴积累的检测。

为生成三维球状体，将大量新鲜分离的MPC悬液以每滴20 µL的体积接种到培养皿盖内表面。待所有液滴放置完毕后，小心地将皿盖置于含有DPBS的培养皿底部上，以防止悬滴蒸发，并将整个培养皿放入细胞培养箱中孵育过夜。次日早晨，向预冷至4 °C的24孔板的每个孔中加入300 µL标准细胞外基质蛋白等分试样，并在37 °C下孵育30分钟，使基质蛋白凝胶化。

向凝胶化的细胞外基质蛋白中加入 700 µL 含标准浓度血管内皮生长因子的内皮细胞生长培养基。当多能前体细胞聚集成 3D 球体后，小心翻转培养皿盖，用无菌巴斯德吸管轻柔地收集球体。最后将球体接种至培养孔中，并将培养板放回培养箱。

形态学上，MPC 具有独特的煎蛋状外形，其特征为具有较厚的核心区域，周围环绕着平坦且较薄的边缘，边缘处可见许多伪足。还常观察到细胞外边界出现极性伸长。在 MSC 扩增培养基中培养 MPC 时，细胞会迅速发生部分分化，产生增殖性的扁平多分支细胞，但仍可检测到残存的未分化 MPC。

经过进一步传代培养后，可获得呈指数生长的、类似间充质干细胞（MSC）的单层细胞。在此过程中，肌肉前体细胞（MPC）将其F-肌动蛋白重组为应力纤维，而Nestin的表达则仅局限于极少数稀有细胞。对 freshly isolated MPC 进行流式细胞术分析显示，超过95%的细胞表达CD31和CD45，但缺乏间充质相关抗原CD90和CD73。

这些最新的抗原仅在完全分化为间充质干细胞（MSC）后才高度表达。将这些细胞用诱导分化培养基培养至少两周后，可观察到其向成骨细胞分化，表现为钙盐沉积，或向脂肪细胞分化，表现为脂滴积聚，从而证实了其多向分化潜能及间充质干细胞特性，进一步验证了预分化细胞培养物的MSC性质。

通过出芽型血管生成实验进一步验证MPC的分型：在血管内皮生长因子刺激24小时后，细胞能够从3D球状体侵入Matrigel基质胶。一周后，侵袭细胞迁移的距离更远，而这种侵袭能力在间充质分化后的第二代MSC中则丧失。若操作得当，掌握技术后可在1小时内建立MSC培养，不到一周即可获得一百万至两百万个MPC。

在进行该操作时，重要的是在将人源CR批次用于培养前，先评估其性能。目前，我们的MPC分离方案是获得高重复性、接近纯化的MC培养物以用于后续下游应用的唯一方法。该技术建立后，为细胞治疗领域的研究人员探索MPC在骨骼组织再生中应用的可能性开辟了道路。