用于木质纤维素生物转化乙醇的耐受性戊糖发酵酵母的进化技术

本适应性进化实验的总体目标是从能够天然发酵木糖的酵母菌株 scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 中，获得可在未脱毒水解液中更快速发酵己糖和戊糖并实现经济可回收乙醇产量的稳定菌株。该方法通过提供一条获得具有复杂性状改良菌株的技术路径，推动木质纤维素制乙醇产业的发展，使菌株能够在含有微生物抑制物的水解液中完成糖的发酵。此处靶向进化的最主要优势在于，可直接利用具有木糖发酵能力的天然酵母菌株来定向培育稳定菌株，从而避免对工业酿酒酵母进行基因工程改造的需要。

我们意识到，任何单一的酵母菌株在不同类型的水解产物中（例如经AFEX预处理的玉米秸秆或经稀酸预处理的柳枝稷）都难以具备良好的耐受性。在本研究中，谢弗氏酵母（scheffersomyces stipitis）能够进行有性生殖周期的特性有利于进一步开发应用，因为具有不同优良性状的多个菌株可通过交配组合成一个性能更优、更稳定的单一菌株。演示该实验操作的将是本实验室的生物科学技术人员、共同作者Stephanie Thomson和Maureen Shea-Andersh。

在开始此富集程序之前，先在125毫升的锥形瓶中制备菌株NRRL Y-7124的预培养物，并制备经酶水解的氨纤维膨胀预处理玉米秸秆水解液（AFEX CSH）的系列稀释液。使用重复移液器向96孔微孔板中每孔加入15微升，每种水解液稀释度分配8个孔。每孔接种少量预培养物，使初始在620纳米处的吸光度（A620）大于或等于0.1。

将微孔板放入一个装有湿润纸巾以保持湿度的塑料盒中，在 25 摄氏度下静置培养 24 至 28 小时。随后，使用微孔板读数分光光度计检测在最高浓度水解物稀释液中实际生长且 A620 超过 1.0 的培养物。将鉴定出的孔中的培养物收集至微量离心管中，并转移至填充板中。

从填充板中转移一至五微升液体至新板中每个水解物稀释系列的孔中，使初始A620达到或超过0.1，然后按之前方法孵育该板。使用酶标仪监测微孔板中培养物的生长情况。定期制备适应性培养物的甘油冻存液。

将定殖于冷冻管中浓度最高的四种水解产物混合，与20%无菌甘油等体积混合。在-80摄氏度下冷冻保存细胞。重复此富集步骤，直至在24小时内持续观察到细胞在12%葡聚糖AFEX CSH中生长。

开始此实验步骤时，将选定的适应性培养物甘油菌种划线接种至酵母麦芽浸膏蛋白胨葡萄糖（YM）琼脂平板。待菌落生长后，用划线菌落接种至三个微孔板孔中，每孔含50微升3%或6%葡聚糖AFEX预处理玉米秸秆水解物（CSH）。将微孔板在25摄氏度下孵育24小时。

将水解物浓度最高且生长旺盛的重复定植孔进行合并，并稀释涂布于YM培养基或6%葡聚糖AFEX CSH琼脂平板上。将平板置于25°C培养箱中培养24至48小时。

从显示生长的最高稀释度平板中挑选五个单菌落，制备成甘油冻存菌种。将每个菌落划线接种至YM平板，于37°C培养24小时。用无菌接种环挑取生长良好的菌苔，转移至少量含10%甘油的溶液中悬浮细胞，并分装至两到三个冻存管中，于-80°C冷冻保存。

为了在简单的6%葡聚糖AFEX CSH分批培养物中测试分离株，将来自甘油保存液划线接种后培养48小时的平板上的细胞转移至pH 7的磷酸钾缓冲液中，以制备细胞悬液。测定每种细胞悬液的光密度后，加入额外缓冲液调节体积，使A620达到10。取每种悬液1微升，分别接种至4个含有50微升3%葡聚糖水解物的孔中，初始A620调至0.2。

将微孔板孵育24小时。随后，转移两个24小时的微孔板孔样至25毫升、pH 5的6%葡聚糖AFEX CSH预培养物中。用硅胶海绵密封塞封闭锥形瓶，并在25°C、150 RPM条件下孵育24小时。

使用6%葡聚糖AFEX CSH预培养物，以初始A620为0.1的接种量，平行接种两份相同的25毫升生长培养物。在25摄氏度、150 RPM条件下培养生长培养物24小时。为在含混合糖的最适定义培养基（ODM）批量培养物中检测分离株的二氧缺乏情况，用含150克/升木糖的75毫升ODM预培养物接种至125毫升锥形瓶中，瓶口使用硅胶海绵密封。

在25摄氏度、150 RPM条件下培养24小时。用预培养物接种至A620为0.1的相似重复75毫升测试培养物中，培养基为含75克/升葡萄糖和75克/升木糖的ODM，pH值为6.5。在25摄氏度、150 RPM条件下振荡培养锥形瓶。

接种连续培养物前24小时，在125毫升锥形瓶中用无乙醇ODM培养基制备一株具有代表性的耐AFEX CSH菌落的预培养物。取5至10毫升该耐AFEX CSH菌株的预培养物，接种于带夹套的100毫升旋瓶中的100毫升ODM培养基中，使初始A620达到0.5。将培养物的持留体积维持在25摄氏度。

以 200 RPM 的转速搅拌，并配备可灭菌的 pH 电极、pH 控制器以及温度可控的循环水浴装置。由于细胞生长会因乙醇暴露而较为缓慢，因此初始阶段应设置一个由 pH 触发的泵，当培养物发酵使 pH 降至 5.4 时，该泵将补加含 100 克/升木糖和 50 克/升乙醇、pH 为 6.3 的 ODM 培养基，以阻止 pH 进一步下降。通过出流泵持续刮取培养液表面，维持培养体积在 100 毫升。

每 48 至 72 小时测量收集的流出液体积，并从连续培养物中取样，用于分析活细胞浓度、产物和底物，具体方法如论文所述。定期保存甘油菌种：从缓冲液稀释样品的活菌平板上挑取 30 至 100 个菌落，选取当时富集培养中最占优势且生长良好的菌落，制备双份冷冻保藏菌种。向平板中加入 5 毫升 10% 甘油溶液，以利于双份冷冻菌种的制备。

若培养物能够在含有超过25克/升乙醇的条件下，以每小时大于0.01的比生长速率在木糖上稳定生长，则可开始以约0.01每小时的低稀释速率向100毫升的持留体积中进行连续培养进料。随着时间推移，逐步提高进料中的乙醇浓度至接近50克/升。重启连续培养时，可选择对接种物进行紫外线照射，以加快突变速率。

在甘油保存液中收集进化后的菌群。在分离单细胞菌落之前，根据文本方案所述，鉴定出在乙醇存在条件下木糖发酵能力提高的甘油保存菌群，并利用这些优良菌群进行平板划线。

采用划线平板制备A620等于5的浓缓冲细胞悬液，然后用该细胞悬液接种96深孔板中的预培养物。在25摄氏度、400 RPM、1英寸轨道条件下培养48小时。

接下来，利用每份预培养物接种16份1毫升的重复培养物，以初始A620为0.5的酸预处理柳枝稷水解液培养基进行耐受菌落富集，该培养基与ODM按1:1混合，并添加50克/升木糖以及足量乙醇，以提供20、30或40克/升的乙醇胁迫条件。在25°C、400 RPM、1英寸轨道摇床中培养48小时。针对每种不同的甘油保存菌株，收集能够支持生长并利用木糖的最高乙醇浓度对应的培养孔。

将每种细胞系接种于YM琼脂培养基上，以获得大量单菌落用于甘油保存。每种细胞系挑选10个菌落，分别划线接种至YM琼脂平板，用于制备甘油菌种。在AFEX CSH培养基上适应后，亲本菌株与适应菌群在ODM培养基中的发酵性能比较结果显示，适应菌群利用木糖的效率更高，乙醇生成速度更快且产量更高。

通过在含有木糖和高水平乙醇的ODM培养基上进行连续培养筛选，进一步培育出一种耐水解物且耐乙醇性能提高的菌株。所有适应后的菌群在40克/升乙醇存在条件下诱导木糖代谢的能力均超过亲本菌株。这些图表总结了在不同PSGHL配方条件下，各优良耐受菌株相对于亲本菌株的木糖摄取速率和乙醇产率的表现。

在富含木糖的PSGHL培养基上初筛获得的最佳菌株，随后在三种完全水解液中进行复筛，并计算各分离株在每种水解液中发酵的相对性能指数（RPI）。接着，计算每个分离株的综合总体性能指数。其中五个分离株（编号3、14、27、28和33）的总体RPI超过60，表明它们在各种水解液成分与营养条件变化下均表现出最强的耐受性和稳定性。

观看本视频后，您应了解如何对一种木糖发酵酵母（如 Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124）进行靶向进化过程中的胁迫筛选，富集、分离并评估其更耐受且能更高效地在未经脱毒处理的水解液中发酵混合糖类的衍生菌株。一旦掌握该技术，每天仅需平均投入约一小时即可开展实验。在短短四个月内即可观察并记录到进化过程中的显著变化。

在进行该实验流程时，需定期制备甘油菌种并保存于负80摄氏度，以持续保存不断进化的菌群。这一步骤可实现菌种恢复、定期评估、突变体分离或重新启动进化过程。为有效管理各类突变，应定期在特定工艺条件下对酵母进行多种表型的筛选。

基于动力学参数计算整体无量纲相对性能指数（RPI），可评估菌株在不同发酵条件（如水解液类型和营养补充）下的排序及其稳健性。进化过程各阶段获得的优良酵母可作为基因组测序的候选菌株，从而明确其改良特性（例如抑制物耐受性的提高和双氧滞后期的缩短），并用于下一代生物催化菌株的设计。