用于木质纤维素生物转化乙醇的耐受性戊糖发酵酵母的进化技术

本项适应性进化实验的总体目标是获得能够更快速地在未脱毒水解液中发酵己糖和戊糖并实现经济可回收乙醇产量的、性能稳定的谢弗氏酵母（Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124）菌株。该方法通过提供一条获得具有复杂性状改良菌株的技术路径，推动了木质纤维素转化为乙醇的产业发展，使菌株能够在含有微生物抑制物的水解液中发酵糖类。在此，靶向进化的最主要优势在于，可从一种天然具备木糖发酵能力的酵母出发，逐步塑造出性能稳定的菌株，从而避免了对工业酿酒酵母菌株进行基因工程改造的需要。

我们意识到，单一酵母菌株不太可能在不同类型的水解物中均表现出良好的耐受性，例如经AFEX预处理的玉米秸秆或经稀酸预处理的柳枝稷。在本研究中，Scheffersomyces stipitis 能够进行有性生殖周期的特性有利于进一步开发，因为可通过具有不同性状菌株之间的交配，将所获得的多种菌株整合为一个更具鲁棒性的单一菌株。示范该实验操作的合作者为本实验室的生物科学技术人员Stephanie Thomson和Maureen Shea-Andersh。

开始此富集程序之前，需在125毫升锥形瓶中制备菌株NRRL Y-7124的预培养物，并制备经酶水解的氨纤维膨胀预处理玉米秸秆水解液（AFEX CSH）的系列稀释液。使用重复移液器向96孔微孔板中每孔加入15微升，每种水解液稀释度分配8个孔。每孔接种少量预培养物，使初始在620纳米处的吸光度（A620）大于或等于0.1。

将微孔板放入含湿润纸巾的塑料盒中以保持湿度，并在25摄氏度下静置培养24至28小时。随后，使用微孔板读数分光光度计，鉴定在最高浓度水解物稀释度下物理生长达到A620大于1.0的培养物。将鉴定出的孔内培养物合并至微量离心管中，并转移至填充板中。

从加样板中转移一到五微升至新水解物稀释系列的每个孔中，使初始 A620 大于或等于 0.1，并按先前方法孵育该板。使用微量板读数分光光度计监测微孔板中培养物的生长。定期制备适应培养物的甘油菌种。

将定殖于冻存管中最高水解物浓度的四个孔中的菌液混合，与20%无菌甘油等体积混匀，于-80摄氏度冷冻保存细胞。重复该富集步骤，直至在12%葡聚糖AFEX CSH培养基中24小时可稳定观察到菌体生长。

开始此操作时，将选定的适应性培养物甘油菌种划线接种至酵母麦芽浸出物蛋白胨葡萄糖（YM）琼脂平板上。待菌落生长后，用划线菌落接种至三个微量孔板孔中，每孔含 50 µL 的 3% 或 6% 葡聚糖 AFEX CSH。将微量孔板在 25 °C 条件下孵育 24 小时。

将水解物浓度最高且生长旺盛的重复定植孔进行合并，并稀释涂布于YM培养基或6%葡聚糖AFEX CSH琼脂平板上。将平板置于25°C培养箱中培养24至48小时。

从显示生长的最高稀释度平板中挑选五个单菌落，制备成甘油冻存菌种。将每个菌落划线接种至YM平板，于37°C培养24小时。用无菌接种环取生长良好的菌苔，转移至少量含10%甘油的溶液中悬浮细胞，混匀后分装至两到三个冻存管中，于-80°C冷冻保存。

为了在简单的6%葡聚糖AFEX CSH分批培养物中测试分离株，将来自甘油冻存斜面、在48小时平板上划线培养的细胞转移至pH 7的磷酸钾缓冲液中，以制备细胞悬液。测定每种细胞悬液的光密度后，加入额外缓冲液调节体积，使A620达到10。取每种悬液1微升，分别接种至4个含有50微升3%葡聚糖水解物的孔中，初始A620调至0.2。

将微孔板孵育24小时。随后，转移两个24小时的微孔板孔样至25毫升、pH 5的6%葡聚糖AFEX CSH预培养物中。用硅胶海绵密封塞封闭锥形瓶，并在25°C、150 RPM条件下孵育24小时。

使用6%葡聚糖AFEX CSH预培养物，以初始A620为0.1的接种量，平行接种至两份相同的25毫升生长培养基中。在25°C、150 RPM条件下培养生长培养物24小时。为在含有混合糖的最适定义培养基（ODM）批量培养物中检测分离株的二氧缺乏情况，将75毫升ODM预培养物接种至含150克/升木糖的125毫升摇瓶中，并使用硅胶海绵密封。

在25摄氏度、150 RPM条件下培养24小时。用预培养物接种至A620为0.1的相似重复75毫升测试培养物中，培养基为含75克/升葡萄糖和75克/升木糖的ODM，pH值为6.5。在25摄氏度、150 RPM条件下振荡培养锥形瓶。

接种连续培养物前24小时，在125毫升锥形瓶中用无乙醇ODM培养基制备一株代表性AFEX CSH耐受菌落的预培养物。取5至10毫升AFEX CSH耐受菌株预培养物，接种于带夹套的100毫升旋转烧瓶中的100毫升ODM培养基，使初始A620达到0.5。将培养物维持在25摄氏度。

以 200 RPM 转速搅拌，并配备可灭菌的 pH 电极、pH 控制器以及温度可控的循环水浴装置。由于细胞生长会因乙醇暴露而较为缓慢，因此初始阶段需设置一个由 pH 触发的泵，当培养物发酵使 pH 降至 5.4 时，该泵将补加含 100 克/升木糖和 50 克/升乙醇、pH 为 6.3 的 ODM 培养基，以阻止 pH 进一步下降。通过出流泵持续刮取培养液表面，维持培养体积在 100 毫升。

每48至72小时测量收集的流出液体积，并从连续培养物中取样，用于分析活细胞浓度、产物和底物，具体方法详见论文所述。定期保存甘油菌种：从缓冲液稀释样品的活菌平板上挑取30至100个菌落，选择当时富集培养中最占优势且生长良好的菌落，加入5毫升10%甘油溶液浸润平板，以制备两份相同的冷冻保存菌株。

若培养物能够在含有超过 25 克/升乙醇的条件下，以高于每小时 0.01 的特定速率在木糖上稳定生长，则以约每小时 0.01 的低稀释速率向 100 毫升的持留体积中启动连续培养进料。随着时间推移，逐步提高进料中的乙醇浓度至接近 50 克/升。重启连续培养时，可选择对接种物进行紫外线照射，以加快突变速率。

在甘油冻存管中保存进化后的菌群。在分离单菌落之前，根据文中所述实验方案，鉴定出在乙醇存在条件下木糖发酵能力提高的甘油冻存菌群。利用这些性能优良的菌群进行平板划线。

利用划线培养的平板制备 A620 等于 5 的浓稠缓冲细胞悬液，然后用该细胞悬液接种 96 深孔板中的预培养物。在 25 °C、400 RPM、振幅 1 英寸的条件下培养 48 小时。

接下来，利用每种预培养物接种16个1毫升的重复培养物，以富集耐受性菌落。将菌液按初始A620为0.5的浓度接种至经酸预处理的柳枝稷水解液培养基中，该培养基与ODM培养基按1:1混合，并添加50克/升木糖以及足量乙醇，使乙醇胁迫浓度分别为20、30或40克/升。在25°C、400 RPM转速及1英寸轨道直径条件下培养48小时。针对每种不同的甘油保存菌种，收集其中能够支持菌体生长并利用木糖的最高乙醇浓度对应的培养孔。

将每种细胞系接种于YM琼脂培养基上，以获得大量单菌落用于甘油保存。每种细胞系挑选10个菌落，分别划线接种至YM琼脂平板，用于制备甘油菌种。在AFEX CSH培养基上适应后，亲本菌株与适应菌群在ODM培养基中的发酵性能比较结果显示，适应菌群利用木糖生成乙醇的效率更高，乙醇产生速度更快且产量更高。

通过在含有木糖和高水平乙醇的ODM培养基上进行连续培养筛选，进一步选育出具有更强乙醇耐受性的水解物耐受菌落。所有经适应进化的菌群在40克/升乙醇存在条件下诱导木糖代谢的能力均超过亲本菌株。这些图表总结了在不同PSGHL配方条件下，优良耐受菌株相对于亲本菌株的木糖摄取速率和乙醇产率的性能评估结果。

从富含木糖的PSGHL初筛中选出的最佳菌株，随后在三种完全水解物上进行二次筛选，并计算各菌株在每种水解物中发酵的相对性能指数（RPI）。接着，计算每个菌株的综合总体性能指数。其中五个菌株（编号3、14、27、28和33）的总体RPI均超过60，在所有水解物类型与营养条件组合下的综合表现中，显示出最强的耐受性。

观看本视频后，您应了解如何对一种木糖发酵酵母（如 scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124）进行靶向进化过程中的胁迫培养，富集、分离并评估其更具抗逆性的衍生菌株，这些菌株可在未经脱毒处理的水解液中更高效地发酵混合糖类。掌握该技术后，每天仅需平均投入约一小时即可开展实验。在短短四个月内即可观察到进化过程中发生的显著变化。

在进行该实验操作时，定期通过制备甘油菌种并在负80摄氏度下冷冻保存以留存不断进化的菌群至关重要。这有助于菌群的恢复、定期评估、分离或重新启动进化过程。为了管理各种突变，请务必在特定工艺条件下定期对酵母进行多种表型的筛选。

基于动力学参数计算无量纲综合相对性能指数（RPI），可评估菌株在不同发酵条件（如水解液类型和营养补充）下的排序及稳健性。进化过程各阶段获得的优良酵母可作为基因组测序候选菌株，以解析其改进特性（如抑制物耐受性提高、双氧胁迫滞后期缩短）的分子机制，并用于设计下一代生物催化菌株。