Name: 鲁棒戊糖发酵酵母的木质纤维素生物转化的演进技术乙醇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 了解适应性进化技术如何培育Scheffersomyces stipitis酵母菌株，使其能够高效发酵木质纤维素水解液中的混合糖并生产乙醇。该方法无需基因工程即可获得耐受抑制剂的稳健菌株，推动生物燃料产业发展。

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我们衷心感谢美国内布拉斯加州林肯市农业研究局牧草、饲料和生物能源研究组的 Kenneth Vogel 博士、Robert Mitchell 博士和 Gautam Sarath 博士为本项目慷慨提供柳枝稷材料。同时，我们感谢美国能源部通过能源部大湖生物能源研究中心（GLBRC）授予 VB 的资助（项目编号：DE-FC02-07ER64494）。

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作者无任何利益冲突需要披露。

进化过程的成功依赖于多个关键步骤。首先，选择适当的选择压力至关重要，以驱动种群向实现成功应用所需的理想表型方向进化。S. stipitis 的进化过程中选择了以下选择压力，并在适当的时间施加以引导目标表型的富集：逐步增强的12%葡聚糖AFEX预处理玉米秸秆水解液（CSH），该条件迫使微生物在乙酸及低浓度呋喃醛类和其他抑制物存在下生长并发酵多种糖类；在连续培养中以木糖为碳源并逐步提高乙醇浓度，以促进木糖代谢酶的诱导，从而缩短双相生长滞后期；逐步增强的20%固体含量的PSGHL水解液，该条件迫使微生物在高浓度乙酸、呋喃类及其他抑制物存在下生长并发酵木糖。其次，在富集过程中通过冷冻保存种群样品的甘油菌种，以维持正在进化的酵母种群，这一点非常重要。这些种群的阶段性快照可长期保存，用于定期功能检测以记录进化进展，也可用于后续按需分离菌株，或在中断后重新启动进化过程。进化的第三个关键步骤是通过在便捷的选择性培养基（例如含有胁迫梯度的琼脂平板或微孔板，梯度中包含一系列水解液和/或乙醇浓度）上富集选择培养物或甘油保存的种群，从而分离出表现优异的单菌落。随后可挑选在最严苛条件下仍能生长的存活菌落，并保存以供后续表征。上述三个基本步骤可重...

据估计，每年约有13亿吨干重的木质纤维素生物质可用于支持乙醇生产，使美国减少30%的石油消耗。1 尽管植物生物质水解可产生富含葡萄糖和木糖的糖混合物，但为降解半纤维素并暴露纤维素以供酶解而进行的化学预处理过程会生成发酵抑制物。乙酸、糠醛和羟甲基糠醛（HMF）被认为是预处理过程中产生的多种抑制物中的关键成分。为了推动木质纤维素乙醇产业的发展，亟需开展相关研究并建立相应方法，以促进酵母菌株的进化，使其能够在抑制物存在条件下存活，并高效利用己糖和戊糖。传统工业酵母菌株（如Saccharomyces cerevisiae）的一个显著缺陷是无法有效发酵植物生物质水解物中丰富的木糖。
Pichia stipitis 标准菌株 NRRL Y-7124（CBS 5773），最近被重新命名为 Scheffersomyces stipitis，是一种天然的戊糖发酵酵母，以能够将木糖发酵为乙醇而广为人知。2,3 本研究选择 NRRL Y-7124 菌株进行进化，是因为已有文献报道该菌株在所有天然酵母菌株中最具潜力积累经济可回收水平的乙醇（超过 40 g/L），且副产物木糖醇极少。4,5,6 在最优培养基中，S. stipitis 菌株 NRRL Y-7124 在高细胞密度培养（6 g/L 细胞）条件下，40 小时内可产生 70 g/L 的乙醇（速率为 1.75 g/L/hr），产率为 0.41 ± 0.06 g/g。7,8 该菌株对发酵抑制物乙醇、糠醛和 HMF 的耐受性也已有报道，9 并且 S. stipitis 被认为是目前可用于木质纤维素原料规模化生产乙醇的最有前景的天然戊糖发酵酵母之一。10 本研究的目标是利用多种未经脱毒处理的木质纤维素水解物并施加乙醇选择压力，推动菌株向更稳健的 NRRL Y-7124 衍生菌株进化，以适用于工业应用。期望获得的关键改良特性包括：在高浓度水解物中更快的糖摄取速率、减少双相生长以实现更高效的混合糖利用，以及对乙醇和抑制物更高的耐受性。本研究特别关注将 S. stipitis 应用于未经脱毒的水解物，旨在消除与水解物脱毒工艺（如过碱化处理）相关的额外运行成本。
两种具有工业应用前景的水解产物被用于驱动进化：酶解氨纤维膨胀预处理玉米秸秆水解物（AFEX CSH）和稀酸预处理柳枝稷水解液（PSGHL）。11,12 AFEX预处理技术正在发展以最小化发酵抑制物的生成，而稀酸预处理则代表了目前成本最低且最常用的处理技术，用于暴露纤维素生物质以便进行酶解糖化。PSGHL可在预处理后与残留的纤维素分离，其特征是富含来自半纤维素水解的木糖，但葡萄糖含量较低。AFEX CSH与PSGHL在多个关键组分上存在差异，这些差异被用于调控进化过程。与PSGHL相比，AFEX CSH中的呋喃醛类和乙酸等抑制物含量较低，但氨基酸和氨态氮源含量较高（表1）。PSGHL的另一个挑战在于其主要可利用糖为木糖。因此，PSGHL适用于特异性富集能够改善木糖利用能力的菌株，而木糖利用能力不足正是限制现有酵母商业化应用的薄弱环节。即使在天然能够发酵戊糖的酵母中，依赖非最优糖类——木糖——来支持细胞生长与修复的过程，在水解产物环境中会因多种因素而变得更加困难：营养缺乏、抑制物广泛破坏细胞结构完整性，以及由于氧化还原失衡导致的代谢紊乱。9 氮源补充，特别是以氨基酸形式添加，可能显著增加发酵过程的操作成本。本研究利用柳枝稷水解液探讨了氮源补充对分离菌株筛选与排序的影响。
通过利用 S. stipitis 群体的天然遗传多样性以及暴露于两种不同水解物、乙醇或紫外辐射所诱导的突变，结合多种选择压力，在进化种群中富集了性能改善的个体。这些选择压力被平行或串联施加，以探究 S. stipitis 向能够在水解物中高效生长和发酵的理想衍生物进化的进程（图1）。通过在微孔板中对功能种群进行连续传代培养，并逐步提高水解物的严苛程度，实现了这一进化过程；所用水解物为12%葡聚糖含量的AFEX CSH或20%固含量制备的PGSHL，采用梯度稀释方式处理。在连续培养条件下，进一步施加以木糖为碳源并含乙醇胁迫的生长选择，从而富集那些在木糖利用方面对乙醇抑制作用不敏感的表型，进而提升已适应AFEX CSH的种群性能。最近研究显示，在葡萄糖发酵后，菌株NRRL Y-7124的戊糖利用能力会受到此类抑制作用的影响。8 随后探索了在PSGHL上的富集，以拓展菌株对不同类型水解物的功能适应性。
通过在胁迫条件下进行靶向富集，并结合稀释涂布法从最优势的菌群中挑选菌落，从 S. stipitis NRRL Y-7124 进化过程的各个阶段分离出潜在的改良衍生菌株。采用无量纲的相对性能指数（RPI）对菌株进行综合性能排序，其中在不同类型的水解液及添加的营养补充物条件下评估其动力学行为。尽管此前已有文献报道多种适应性驯化方法成功提升了 S. stipitis 在木质纤维素水解液中的功能表现，但尚未有菌株被报道可在未经解毒处理的水解液中实现具有经济可行性的乙醇生产。13-17 通过本文将更详细展示的进化方法，Slininger 等18 获得了相较于亲本菌株 NRRL Y-7124 显著改良的菌株，能够在适当补充氮源的AFEX CSH和酶解柳枝稷水解液（SGH）中产生 &#62;40 g/L 的乙醇。这些新型菌株对未来木质纤维素制乙醇产业的发展以及基于已测序菌株 NRRL Y-11545 的进一步基因组学研究具有重要意义。19 对 图1 所示进化各阶段产生的优势菌株进行基因组学研究，将阐明在菌株发育过程中发生的遗传变异历史，为后续的菌株改良研究奠定基础。

<table><tbody><tr><td>Cellic Ctec，含有木聚糖酶（内切-1,4-）</td><td>诺维信</td><td>无产品编号</td><td>www.novozymes.com，1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Cellic Htec，含有纤维素酶和木聚糖酶</td><td>诺维信</td><td>无产品编号</td><td>www.novozymes.com，1-919-494-3000</td></tr><tr><td>烘烤大豆粉</td><td>阿彻丹尼尔斯米德兰公司（ADM）</td><td>63160</td><td>ADM，费里斯公园路4666号，迪凯特，伊利诺伊州&amp;nbsp; 1800-37-5843</td></tr><tr><td>Pluronic F-68（表面活性剂）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1300</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Difco 维生素测定用酪蛋白氨基酸</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>228830</td><td>多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;、Fisher Scientific、VWR、Daigger</td></tr><tr><td>D,L-色氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3300</td><td>多家供应商 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;、Fisher Scientific、VWR、Daigger</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td>多个供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Fisher Scientific，Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td>214010</td><td>多个供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;、Fisher Scientific、VWR、Daigger</td></tr><tr><td>麦芽提取物</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>218630</td><td>多个供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;、Fisher Scientific、VWR、Daigger</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;、Fisher Scientific、VWR、Daigger</td></tr><tr><td>大豆蛋白胨 IV 型</td><td>Fluka</td><td>P0521-500g</td><td>多家供应商 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Fisher Scientific，VWR，Daigger</td></tr><tr><td>腺嘌呤, &gt;99% 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8626</td><td>CAS 73-24-5。可使用其他品牌。多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>胞嘧啶, &gt;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3506</td><td>CAS 71-30-7。可使用其他品牌。多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;西格玛奥德里奇，Acros Organics，MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>鸟嘌呤，SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6779</td><td>CAS 73-40-5。可使用其他品牌。多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>胸腺嘧啶，99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td>CAS 65-71-4。可使用其他品牌。多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>尿嘧啶，99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>CAS 66-22-8。可使用其他品牌。多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>无水右旋糖（D-葡萄糖），分析纯（符合美国化学会标准）</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>CAS 50-99-7。可使用其他品牌。多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>D-木糖，检测 &gt;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1500</td><td>CAS 58-86-6。可使用其他品牌。多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>351172</td><td>多家供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;赛默飞世尔科技，VWR，戴杰</td></tr><tr><td>Wypall L40 擦拭布</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>在微孔板盒中放置毛巾以吸收水分实现加湿；多家供应商 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;赛默飞世尔科技，Uline，戴杰工业</td></tr><tr><td>康宁刻度耐热玻璃烧瓶，125 ml，窄口（5号塞）</td><td>康宁生命科学玻璃</td><td>4980-125</td><td>多个供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;赛默飞世尔，VWR，戴杰</td></tr><tr><td>Innova 42R 摇床/培养箱，2.5 cm（1&quot;旋转</td><td>新不伦瑞克科学公司（1-800-631-5417）</td><td>M1335-0016</td><td>多个供应商： &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Eppendorf，Thermo-Fisher。其他具有2.5 cm（1&quot;) 可使用投掷法。</td></tr><tr><td>用于4块深孔MTP板的Duetz盖板夹具</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001700</td><td>applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396</td></tr><tr><td>用于96孔深孔板的Duetz系统三明治盖</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001296</td><td>applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Duetz系统硅胶密封垫（0.8 mm黑色低蒸发），用于96深孔板盖</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040027</td><td>applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Duetz 系统三明治盖蓝色超细纤维层</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040001</td><td>applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96孔，2 ml方形井锥底板，天然聚丙烯</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>ZC3DXP0240</td><td>applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Bellco 32 mm 硅胶海绵塞盖，每包25个，适用于125 ml 培养瓶</td><td>Bellco</td><td>1924-00032</td><td>Thomas Scientific，其目录编号为 1203K27</td></tr><tr><td>Bellco 旋转烧瓶，1968-玻璃罩，可密封法兰型，工作体积100 ml。此型号已停产。</td><td>Bellco</td><td>1968-00100（原始货号）</td><td>夹套容器的入口较低 &amp;amp; 用于通过循环水浴进行温度控制的上出口端口。容器外径为75 mm，高度为200 mm。在约45°位置设有四个侧端口&amp;#176; 角度和一个顶部接口。接口开口尺寸适合0号氯丁橡胶塞（接口内径21-22 mm）。</td></tr><tr><td>Mathis Labomat IR 烘干 oven</td><td>MathisAg</td><td>型号 BFA12 215307</td><td>Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157</td></tr><tr><td>双通道生化分析仪</td><td>YSI生命科学</td><td>2900D-UP</td><td>www.ysi.com，用于96孔微孔板格式快速糖类检测的机器人系统</td></tr><tr><td>PowerWave XS 微孔板分光光度计</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc</td><td>MQX200R</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biotek.com/">www.biotek.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

用于木质纤维素生物转化乙醇的耐受性戊糖发酵酵母的进化技术

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

木质纤维素生物质是一种丰富且可再生的原料，可用于生产燃料级乙醇及其他生物产品。预处理和酶解糖化过程可释放出可被酵母发酵的糖类。传统的工业酵母无法发酵木糖（可占植物糖类含量的40%），并且不能在浓缩水解物中正常发挥作用。虽然浓缩水解物对于实现经济可行的乙醇回收至关重要，但其中含有大量在预处理过程中产生的有毒副产物。尽管脱毒方法可使水解物变得可发酵，但这些方法成本高昂，并会产生废物处理负担。本文介绍并演示了利用适应性进化与分离技术，获得源自天然 Scheffersomyces stipitis 菌株 NRRL Y-7124 的衍生菌株，这些菌株能够在不利培养条件下高效地将水解物转化为经济可回收的乙醇。通过利用 S. stipitis 种群的天然遗传多样性以及暴露于两种不同水解物、乙醇或紫外辐射所诱导的突变，结合多种选择压力，在进化种群中富集性能更优的个体。最终的进化培养物通过稀释涂布法分离出优势菌株；而在进化过程的不同阶段以甘油冷冻保存的中间种群，则在选择性培养基上利用适当的压力梯度进行富集，再通过稀释涂布法回收最具潜力的菌株。菌株在多种类型的水解物上进行筛选，并采用一种新颖的方法进行排序，该方法基于对木糖摄取速率和乙醇产率数据进行无量纲相对性能指数（RPI）转换。利用RPI统计参数，计算出综合相对性能平均值，以根据多个因素（包括培养条件（营养和抑制物水平不同）以及动力学特征）对菌株进行排序。通过应用这些技术，亲本菌株的衍生菌株在pH为5–6的酶解糖化水解物中表现出以下改进特性：生长前的初始滞后期缩短，葡萄糖-木糖转换期间的双相生长滞后期减少，发酵速率显著提高，乙醇耐受性增强，并可积累至40 g/L。

S. stipitis 通过三种选择性培养环境的组合进行进化，这些培养环境包括 AFEX CSH、PSGHL 以及乙醇胁迫下的木糖连续培养。 图 1 展示了所进行的进化实验的示意图，以及筛选出的在所有测试水解物中总体表现最优或在某一种水解物上表现最佳的菌株。 表 3 列出了这些优良菌株的 NRRL 登录编号，并总结了在获得各菌株所来源的富集群体过程中施加的适应性胁迫条件。部分菌株在一种或两种水解物上表现出相对更优的性能，但 11 个菌株中有 7 个在所有类型的水解物上均表现良好，尽管其中大多数菌株在进化过程中仅暴露并经受过单一类型水解物的胁迫。本研究所采用的不同进化策略的成功结果体现在 图 2–7 和 表 4 中。
图2展示了在适应性进化的第一阶段后所观察到的显著改进，该阶段通过连续传代将菌株NRR...

描述并演示了适应性进化和分离技术，以获得能够快速消耗酶解未经脱毒的水解物中混合的己糖和戊糖，并积累超过40 g/L乙醇的Scheffersomyces stipitis菌株NRRL Y-7124的衍生菌株。

木质纤维素生物质是一种丰富且可再生的原料，可用于生产燃料级乙醇及其他生物产品。预处理与酶解……

本项适应性进化实验的总体目标是获得能够更快速地在未脱毒水解液中发酵己糖和戊糖并实现经济可回收乙醇产量的、性能稳定的谢弗氏酵母（Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124）菌株。该方法通过提供一条获得具有复杂性状改良菌株的技术路径，推动了木质纤维素转化为乙醇的产业发展，使菌株能够在含有微生物抑制物的水解液中发酵糖类。在此，靶向进化的最主要优势在于，可从一种天然具备木糖发酵能力的酵母出发，逐步塑造出性能稳定的菌株，从而避免了对工业酿酒酵母菌株进行基因工程改造的需要。我们意识到，单一酵母菌株不太可能在不同类型的水解物中均表现出良好的耐受性，例如经AFEX预处理的玉米秸秆或经稀酸预处理的柳枝稷。在本研究中，Scheffersomyces stipitis 能够进行有性生殖周期的特性有利于进一步开发，因为可通过具有不同性状菌株之间的交配，将所获得的多种菌株整合为一个更具鲁棒性的单一菌株。示范该实验操作的合作者为本实验室的生物科学技术人员Stephanie Thomson和Maureen Shea-Andersh。开始此富集程序之前，需在125毫升锥形瓶中制备菌株NRRL Y-7124的预培养物，并制备经酶水解的氨纤维膨胀预处理玉米秸秆水解液（AFEX CSH）的系列稀释液。使用重复移液器向96孔微孔板中每孔加入15微升，每种水解液稀释度分配8个孔。每孔接种少量预培养物，使初始在620纳米处的吸光度（A620）大于或等于0.1。将微孔板放入含湿润纸巾的塑料盒中以保持湿度，并在25摄氏度下静置培养24至28小时。随后，使用微孔板读数分光光度计，鉴定在最高浓度水解物稀释度下物理生长达到A620大于1.0的培养物。将鉴定出的孔内培养物合并至微量离心管中，并转移至填充板中。从加样板中转移一到五微升至新水解物稀释系列的每个孔中，使初始 A620 大于或等于 0.1，并按先前方法孵育该板。使用微量板读数分光光度计监测微孔板中培养物的生长。定期制备适应培养物的甘油菌种。将定殖于冻存管中最高水解物浓度的四个孔中的菌液混合，与20%无菌甘油等体积混匀，于-80摄氏度冷冻保存细胞。重复该富集步骤，直至在12%葡聚糖AFEX CSH培养基中24小时可稳定观察到菌体生长。开始此操作时，将选定的适应性培养物甘油菌种划线接种至酵母麦芽浸出物蛋白胨葡萄糖（YM）琼脂平板上。待菌落生长后，用划线菌落接种至三个微量孔板孔中，每孔含 50 µL 的 3% 或 6% 葡聚糖 AFEX CSH。将微量孔板在 25 °C 条件下孵育 24 小时。将水解物浓度最高且生长旺盛的重复定植孔进行合并，并稀释涂布于YM培养基或6%葡聚糖AFEX CSH琼脂平板上。将平板置于25°C培养箱中培养24至48小时。从显示生长的最高稀释度平板中挑选五个单菌落，制备成甘油冻存菌种。将每个菌落划线接种至

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科研

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Bioengineering

生物工程

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用于木质纤维素生物转化乙醇的耐受性戊糖发酵酵母的进化技术

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