鲁棒戊糖发酵酵母的木质纤维素生物转化的演进技术乙醇
October 24th, 2016
适应进化和隔离技术进行了描述和展示，得到了能够迅速消耗己糖和酶戊混合糖的糖化undetoxified水解和超过40克/升乙醇积聚Scheffersomyces树干毕赤酵母株的衍生物NRRL Y-7124。
这种适应性进化程序的总体目标是获得天然木糖发酵酵母 scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 的健壮菌株，该菌株可以更快地将未糖醇化水解物中的己糖和戊糖发酵成经济可回收的乙醇。该方法通过提供具有复杂修饰的菌株的路线图，允许在含有微生物抑制剂的水解产物中发酵糖，从而推动木质纤维素乙醇工业向前发展。在这里，靶向进化的主要优点是健壮的菌株是由能够发酵木糖的天然酵母模制而成的，无需设计工业酵母菌株。
我们意识到，任何单一酵母菌株在不同类型的水解物中都不太可能稳健，例如 AFEX 预处理的玉米秸秆或稀酸预处理的柳枝稷。scheffersomyces stipitis 经历有性生殖周期的能力有利于本研究中的进一步开发，因为开发的各种菌株可以通过具有这些不同性状的菌株交配组合成一个单一的、更健壮的菌株。演示该程序的合著者 Stephanie Thomson 和 Maureen Shea-Andersh 将是我实验室的生物科学技术人员。
在开始此富集程序之前，在 125 毫升烧瓶中准备菌株 NRRL Y-7124 的预培养物和酶糖化氨纤维扩增预处理的玉米秸秆水解物或 AFEX CSH 的稀释系列。使用重复移液器以每孔 15 微升填充 96 孔微孔板，每次水解产物稀释液填充 8 孔。每孔接种几微升预培养物，以允许 620 纳米的初始吸光度或 A620 大于或等于 0.1。
将微孔板放入塑料盒中，用湿纸巾保持湿度，并在 25 摄氏度下静态孵育 24 至 28 小时。接下来，使用微孔板读数分光光度计鉴定在最浓的水解产物稀释液中物理生长至大于 1.0 的 A620 的培养物。将识别出的孔汇集在微量离心管中，并分配到填充板中。
将 1 至 5 微升从填充板转移到新的水解产物稀释系列的每个孔中，以达到大于或等于 0.1 的初始 A620，并像以前一样孵育板。使用微孔板读数分光光度计监测微孔板中培养物的生长。定期准备适应培养物的甘油储备液。
汇集在冷冻文件中定植的最大水解物浓度的四个孔，并与 20% 无菌甘油一比一混合。在零下 80 摄氏度下冷冻细胞。重复此富集程序，直到 24 小时时始终可以看到 12% 葡聚糖 AFEX CSH 的生长。
要开始此过程，将选定的适应培养物的甘油原液划线至酵母麦芽蛋白胨葡萄糖或 YM 琼脂。然后在生长后，使用条纹在三个微孔板孔中的每个孔中接种 50 微升 3% 或 6% 葡聚糖 AFEX CSH。将微孔板在 25 摄氏度下孵育 24 小时。
池以最高的水解液强度复制定植孔，生长强劲。并将板稀释至 YM 或 6% 葡聚糖 AFEX CSH 琼脂。将板在 25 摄氏度的培养箱中孵育 24 至 48 小时。
从最高稀释度的平板中挑选 5 个显示生长的单菌落，以甘油原液培养物的形式冷冻。将每个菌落划线到 YM 平板上并孵育 24 小时。使用无菌定量环，将显影的细胞条纹转移到小体积的 10% 甘油混合物中，以悬浮细胞并分配到两到三个冷冻文件中，以便在零下 80 摄氏度下冷冻。
为了在简单的 6% 葡聚糖 AFEX CSH 批量培养物中测试分离物，将细胞从甘油原液划线的 48 小时板转移到 pH 7 磷酸钾缓冲液中，以制备细胞悬液。测量每种细胞悬液的光密度后，用额外的缓冲液调节体积以达到 A620 的 10。使用每种悬浮液的 1 微升将 50 微升 3% 葡聚糖水解物的四个孔中的每一个接种至初始 A620 为 0.2。
将微孔板孵育 24 小时。接下来，转移两个 24 小时的微孔板孔，在 pH 值为 5 的条件下接种 25 毫升 6% 葡聚糖 AFEX CSH 预培养物。用硅胶海绵盖住培养瓶，并在 25 摄氏度和 150 RPM 下孵育 24 小时。
使用 6% 葡聚糖 AFEX CSH 预培养物接种类似的 25 毫升生长培养物，初始 A620 为 0.1，一式两份。将生长培养物在 25 摄氏度和 150 RPM 下孵育 24 小时。为了在最佳成分确定培养基 （ODM） 与混合糖的分批培养物中测试分离株的二氧离子缺乏，在带有硅胶海绵盖的 125 毫升烧瓶中接种 75 毫升 ODM 和每升 150 克木糖的预培养物。
在 25 摄氏度和 150 RPM 下孵育 24 小时。使用预培养物接种到 0.1 个类似的重复 75 毫升测试培养物的 A620 中，ODM 在 pH 值为 6.5 时含有 75 克/升葡萄糖和 75 克/升木糖。在 25 摄氏度和 150 RPM 下摇动培养瓶。
在接种连续培养物前 24 小时，在 125 毫升烧瓶中的无乙醇 ODM 中制备代表性 AFEX CSH 耐受菌落的预培养物。使用 5 至 10 毫升 AFEX CSH 耐受分离物预培养物，将 100 毫升 ODM 接种在带夹套的 100 毫升旋转瓶中，以获得 0.5 的初始 A620。将培养物保持体积保持在 25 摄氏度。
以 200 RPM 的速度搅拌，并为其配备可消毒的 pH 电极、pH 控制器和温控循环水浴。最初，由于乙醇暴露会导致细胞生长缓慢，因此请设置一个 pH 驱动泵，以便当培养发酵将 pH 值降低到 5.4 时，泵将向 pH 6.3 ODM 输送每升 100 克木糖和 50 克/升乙醇，以阻止 pH 值进一步降低。使用流出泵连续撇去培养物表面，将体积保持在 100 毫升。
测量收集的流出物体积，并每 48 至 72 小时从连续培养物中抽取样品，以分析活细胞浓度、产物和底物，如手稿中所述。通过从形成 30 至 100 个菌落的缓冲样品稀释液的活力板中分离菌落来定期保存甘油原液，这些菌落代表了当时最普遍的富集菌落。用 5 毫升 10% 甘油淹没板，以制备重复的冷冻文件。
如果在乙醇含量超过 25 克/升的情况下，木糖上的培养物可以以大于每小时 0.01 的比速稳定生长，则以每小时约 0.01 的低稀释率开始连续培养补料至 100 毫升的保持体积。随着时间的推移，将进料中的乙醇提高到每升 50 克。用于重新开始连续培养的接种物的紫外线照射是加快突变率的一种选择。
捕获甘油储备液中的高级群体。在分离单细胞集落之前，按照文本方案中的描述鉴定在乙醇存在下木糖发酵得到改善的甘油储备种群。使用这些优势群体对板进行划线。
条纹板用于制备等于 5 的 A620 的致密缓冲细胞悬液。然后使用细胞悬液接种 96 个深孔板中的预培养物。在 25 摄氏度、400 RPM 和 1 英寸轨道下孵育 48 小时。
接下来，通过使用每种预培养物将 16 个 1 mL 重复培养物接种到酸预处理的柳枝稷水解液中的初始 A620 中，与 ODM 和 50 克/升木糖和足够的乙醇一对一混合，以提供每升 20、30 或 40 克乙醇攻击。在 25 摄氏度、400 RPM 和 1 英寸轨道下孵育 48 小时。对于每种不同的甘油原液，以最高的乙醇浓度收获培养孔，以允许生长和木糖使用。
将每个细胞系接种到 YM 琼脂上，以获得普遍的单菌落以保存在甘油中。每个细胞系挑选 10 个菌落，并将每个菌落划线到 YM 琼脂平板上进行甘油原液制备。在 AFEX CSH 上适应后，亲本菌株和适应种群之间在 ODM 中的发酵性能比较表明，适应种群更有效地利用木糖来更快、更大量地制造乙醇。
通过在含有木糖和高水平乙醇的 ODM 上进行连续培养选择，进一步开发耐水解物集落以提高乙醇耐受性。在每升乙醇 40 克存在下，所有适应的种群在诱导木糖代谢的能力上都超过了亲本。这些图表总结了根据每种 PSGHL 制剂的木糖摄取率和乙醇产量相对于母株评估的卓越耐受性分离株的性能。
随后在三种完全水解产物上筛选从富含木糖的 PSGHL 的初步筛选中选择的最佳菌株，并计算每种水解产物中每种分离物发酵的相对性能指数或 RPI。接下来，计算每个分离株的综合总体性能指标。5 个分离株（3 个、14 个、27 个、28 个和 33 个分离株）的总体 RPI 高于 60，这使它们成为对所有水解产物和营养条件组合最稳健的分离株。
看完这个视频，你应该知道如何在有针对性的进化过程中挑战像 scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 这样的木糖发酵酵母，富集、分离和评估更强大的衍生物，这些衍生物可以更有效地发酵未被毒素化的水解物中的混合糖。一旦掌握，这种技术就可以用于平均每天约一个小时的每日时间投资。进化过程中的重大变化可以在短短四个月内记录下来。
在尝试此程序时，重要的是要通过准备甘油原液以在零下 80 摄氏度下冷冻来定期拯救不断增长的种群。这允许种群恢复、定期评估、隔离或重新启动进化过程。为了管理各种突变，请记住在工艺特定条件下定期筛选酵母的一系列表型。
基于动力学参数计算总体无量纲相对性能指数 （RPI） 可以评估菌株等级和对发酵条件变化（如水解产物类型和营养补充）的稳健性。进化过程每个阶段产生的优质酵母菌是基因组测序的候选者，因此可以减少抑制剂耐受性等改进的性质，并且可以理解二氧滞后并将其用于下一代生物催化菌株的设计。
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概述
本研究聚焦于Scheffersomyces stipitis 菌株NRRL Y-7124的适应性进化，以提高其将木质纤维素水解物中的混合糖发酵为乙醇的能力。该研究展示了能产生高效酵母衍生物的技术，这些衍生物能够有效地将己糖和戊糖转化为乙醇。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物发酵
- 生物燃料生产
- 酵母遗传学
背景
- Scheffersomyces stipitis是一种原生的木糖发酵酵母。
- 高效发酵混合糖对于生物乙醇生产至关重要。
- 当前的工业菌株通常需要基因工程。
- 需要强大的菌株来处理各种水解物类型。
研究目的
- 得出能够快速发酵未解毒水解物中的糖的菌株。
- 消除对工业菌株进行工程改造的需求。
- 通过配对结合不同菌株的有益特性。
使用的方法
- 适应性进化技术以选择强大的酵母菌株。
- 使用各种水解物进行发酵测试。
- 通过有性繁殖结合菌株。
- 评估乙醇生产效率。
主要结果
- Scheffersomyces stipitis的衍生物可以产生超过40 g/L的乙醇。
- 菌株显示出对混合糖的发酵速率有所提高。
- 目标进化成功增强了对抑制剂的鲁棒性。
- 不同菌株特性的结合导致了更好的性能。
结论
- 适应性进化可以产生用于生物乙醇生产的强大酵母菌株。
- 这种方法推动了木质纤维素到乙醇产业的发展。
- 未来的工作可以在这些发现的基础上优化发酵过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Adaptive evolution of native xylose-fermenting yeast enables robust fermentation of mixed sugars in undetoxified lignocellulosic hydrolysates, reducing reliance on costly detoxification and genetic engineering. This approach advances bioethanol production by delivering strains with improved inhibitor tolerance, ethanol yield, and fermentation kinetics under industrially relevant conditions. The method supports strain development pipelines focused on predictive confidence and risk-adjusted advancement in renewable fuel platforms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by linking xylose metabolism to ethanol production under inhibitor stress.
- Operational Value: Uses natural genetic diversity and mutagenesis to enrich functional variants without recombinant DNA.
- Predictive Value: Enhances confidence in target pathway functionality through phenotypic selection in relevant stress conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via enrichment on selective media with stress gradients.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of predominant isolates using dilution plating.
- Scalability Value: Supports platform reuse by cryopreserving intermediate populations for periodic evaluation and restart.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by testing isolates across multiple hydrolyzate types.
- Risk-Adjusted Advancement: Uses dimensionless relative performance index (RPI) to rank strains based on xylose uptake and ethanol yield under varying nutrient and inhibitor conditions.
- Mechanistic De-risking: Identifies superior isolates with reduced lag phases and enhanced fermentation rates, informing strain robustness predictions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting strain selection for biofuel production pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by evolving strains under selection pressures mimicking industrial hydrolysate conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through isolation of variants with consistent growth in concentrated hydrolyzates.
- Analytics: Provides quantitative outputs via RPI transformation of kinetic parameters to enable cross-condition strain comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating performance across AFEX CSH, switchgrass hydrolysate, and defined media.
- Enterprise Reuse: frames the evolution workflow as a reusable capability via glycerol stock banking and periodic phenotypic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in strain robustness, reduced mechanistic ambiguity in xylose-ethanol pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of strain enrichment and isolation procedures.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biofuel development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement of strains with RPI >60 across multiple hydrolysate formulations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial evolution, yeast handling, and spectrophotometric growth monitoring.
- Needs incubation infrastructure, microplate readers, and cryostorage for glycerol stocks at −80°C.
- Demands cross-team standardization of hydrolysate preparation, pH control, and ethanol challenge assays.
- Involves adaptation considerations when transferring evolved strains between AFEX CSH, switchgrass liquor, and defined media.
- Limited by the need to maintain selection pressure consistency and avoid genetic drift during long-term enrichment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
Enrichment of Robust Derivatives during Serial Transfer on AFEX CSH
3:42
Isolation of Single Cell Tolerant Derivatives after Enrichment on AFEX CSH
4:58
Performance Evaluation of AFEX CSH Tolerant Derivatives Compared to Parent
7:15
Applying Continuous Culture to Select for Ethanol-challenged Xylose Utilization
9:43
Isolation of Single-cell Colonies That Utilize Xylose in PSGHL When Ethanol Is Present
11:20
Results: Derivatives of S. stipitis Parent Strain Have Improved Efficiency in Converting Hydrolyzates to Ethanol
12:54
Conclusion
