Name: 人胎盘滋养层细胞培养模型，研究褪黑素对缺氧的保护作用/复氧引起的中断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学习使用免疫纯化人绒毛膜滋养层细胞建立缺氧/复氧体外模型，研究褪黑素对氧化应激的保护作用。该方法有助于理解胎盘功能障碍相关妊娠并发症的分子机制。

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由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）（编号 262011-2009）向 CV 提供的资助，以及由“三月之约”社会与行为科学研究基金（March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant）（编号 #12-FY12-179）向 CV 和 JTS 提供的资助；由魁北克省教育、高等教育与研究部（MEESR）-魁北克研究基金（FRQ）-自然与技术（NT）以及阿曼-弗拉皮耶大学基金会（Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS）向 LSF 提供的研究生奖学金，由魁北克生殖研究网络-加拿大自然科学与工程研究委员会创新培训计划（Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE）向 HC 提供的研究生奖学金，由加拿大卫生研究院（CIHR）和魁北克健康研究基金（FRQ-Santé）向 AAHT 提供的研究生奖学金，以及由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）向 JBP 提供的研究生奖学金；由巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico，CNPq）以及魁北克省教育、高等教育与研究部-魁北克自然科学与技术研究基金优秀外国学生奖学金计划（Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT）向 EMAS 提供的博士后奖学金支持。

胎盘取自加拿大魁北克省蒙特利尔市CHUM-St-Luc医院无并发症妊娠的自然阴道分娩后立即获取，所有样本均在患者知情同意及伦理委员会批准（CHUM-St-Luc医院和加拿大魁北克省拉瓦尔市INRS-Institut Armand-Frappier）的情况下进行。
1. 绒毛细胞滋养层细胞的分离与纯化
<ol>
	<li>溶液与培养基
	<ol>
		<li>通过在高糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-HG）中添加1% 体积比体积 抗生素（10,000 单位/毫升青霉素 G，100 毫克/毫升硫酸链霉素），4 °C 保存。</li>
		<li>通过在DMEM-HG中添加10% 体积比体积 胎牛血清（FBS），25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），1% 体积/体积 抗生素（10,000 单位/毫升青霉素 G，100 毫克/毫升硫酸链霉素），4 °C 保存。使用前将培养基预热至 37 °C。</li>
		<li>配制 4 升生理盐水溶液（0.9% 质量/体积氯化钠）。</li>
		<li>通过向1×HBSS（pH 7.4）中加入25 mM HEPES，制备改良型Hank's平衡盐溶液（HBSS）。</li>
		<li>准备新鲜的消化液四瓶，每瓶含改良HBSS（按1.1.4制备）、硫酸镁（MgSO₄）、氯化钙（CaCl₂）、胶原酶II和透明质酸酶，现配现用。4），氯化钙（CaCl2），胰蛋白酶，脱氧核糖核酸酶IV（DNase IV），和1% 体积比体积 抗生素（10,000 单位/毫升青霉素 G，100 毫克/毫升硫酸链霉素），如所示 表1.</li>
		<li>制备密度梯度离心介质
		<ol>
			<li>通过向密度梯度离心介质中添加10%的补充剂来制备密度梯度离心介质溶液 体积/体积 HBSS 10倍浓缩液</li>
			<li>按照所述方法，准备14个含有密度梯度离心介质溶液和改良HBSS的测定管。 表2.</li>
			<li>在将各密度溶液（步骤1.1.6.2）加入梯度之前，需充分混匀。使用蠕动泵（1 ml/min）将密度溶液缓慢加入50 ml玻璃离心管中，从最高浓度（70%）开始。为避免产生液滴，应沿管壁缓慢排入溶液，以保持梯度各层之间的清晰分界。
			<ol>
				<li>若无蠕动泵，可使用巴斯德吸管极其轻柔地逐层添加。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过向电泳缓冲液（见材料表）中添加2%的终浓度，制备最终的电泳缓冲液 体积比体积 抗生素/抗真菌素（10,000 单位/毫升青霉素 G，100 毫克/毫升硫酸链霉素）。4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绒毛细胞滋养层细胞分离 
	注意：使用无菌外科器械、玻璃器皿、移液管、烧瓶 等等。
	<ol>
		<li>在绒毛细胞滋养层细胞分离当天，于37 °C水浴中将消化液（步骤1.1.5制备）和70 ml FBS预热。注意：使用50 ml FBS终止消化反应，剩余20 ml用于冻存步骤&#160;(1.2.22) 解冻后可置于冰上。</li>
		<li>分娩后，尽快将胎盘置于冰冻运输培养基（来自步骤1.1.1）中送至实验室（不超过1小时）。</li>
		<li>弃去转运液和胎盘血至液体垃圾桶中。称量胎盘重量并浸入冷生理盐水中。</li>
		<li>测量并分析以下特征：脐带长度；脐带附着位置；胎盘长度、宽度、形状（椭圆形、盘状）；胎膜颜色；子叶结构病理变化。注意：数据在结果部分呈现。</li>
		<li>沿脐带在胎盘插入处切断脐带（即在其基部周围增加一个半径为1 cm的圆形区域。浸入300 ml组织学固定液（10%福尔马林）中，以备后续组织学分析。</li>
		<li>将整个胎盘切成 5 x 5 x 5 cm 的小块。用生理盐水（0.9%）彻底清洗（每次约 1 分钟，共 4 次），以去除血细胞，直至生理盐水变澄清。弃去清洗液。</li>
		<li>在表面皿中，去除胎盘膜并切碎组织以清除血管和钙化物。用镊子牢固夹住血管，使用梅岑鲍姆剪刀的背部去除组织。
		<ol>
			<li>将剪碎的胎盘组织放入布氏漏斗中，用约100 ml生理盐水缓冲液冲洗。继续剪碎组织，直至获得30–35 g剪碎后的组织（使用塑料称量皿和天平）。如有需要，可将剩余胎盘组织进一步剪碎，最多额外制备三份30–35 g的组织样品。在此期间，将剪碎的组织置于冰上的称量皿中保存。 
			注意：此步骤需要大约45分钟至1小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将30–35 g绞碎的胎盘组织加入消化瓶中。加入150 ml已配制的消化液1（表1将胰蛋白酶溶液加入培养瓶中并充分混匀。</li>
		<li>将消化瓶置于摇动水浴中，以不超过50次/分钟的转速振荡30分钟，并每5分钟手动混匀消化瓶一次，以确保消化均匀。</li>
		<li>第一次消化结束时，将消化瓶从水浴中取出，倾斜45°静置1分钟，使胎盘组织沉淀。用10 ml无菌移液管吸出并弃去约80 ml上清液，避免吸取组织。</li>
		<li>转移100 ml消化液2（表1将胰蛋白酶溶液加入培养瓶中；充分混匀，并重复步骤 1.2.9。</li>
		<li>第二次消化结束时，将消化瓶从水浴中取出，倾斜45°静置1分钟。用10 ml无菌移液管吸取80 ml上清液，轻轻转移至含有100 µm细胞滤网的离心管中。每次离心管装满后，将滤过的上清液转移至含有2 ml FBS的烧杯中。</li>
		<li>按照第二次消化的方法（1.2.11 和 1.2.12）使用 75 ml 消化液 3 进行第三次消化。同时，平行进行第二次消化的步骤 1.2.15 至 1.2.16.1。</li>
		<li>第四次消化与第三次消化操作完全相同，使用消化液4（75 ml），但收集最大量的上清液。并行进行第三次消化的步骤1.2.15至1.2.16.1，最后对第四次消化重复相同步骤。</li>
		<li>将上清液（来自消化步骤2、3和4）分装为每份13.5 ml，分别加入15 ml离心管中。使用一支长22.8 cm的玻璃巴斯德吸管，极其轻柔且缓慢地向每根离心管底部加入1.5 ml FBS，以形成独立的液层。切勿混合FBS与上清液。于室温下以1,250 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。 
		注意：离心后，离心管中可见4层，如图所示 图1胰蛋白酶与滋养层细胞的分离可避免细胞过度消化。</li>
		<li>使用真空泵吸除并弃去上清液（消化液）和胎牛血清层，包括两层之间的白色膜状物。用1 ml温热的细胞培养基（步骤1.1.2；不含胎牛血清和HEPES）重悬沉淀物（滋养层细胞和红细胞层）。
		<ol>
			<li>将所有离心管中的重悬细胞收集并合并至1个离心管中。将该管置于室温下，直至所有消化步骤结束。注意：完成所有消化后，通常可获得3管重悬细胞（每轮消化对应1管）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用预热的细胞培养基定容至15 ml。在室温下以1,250 × g离心10分钟。用真空泵吸除上清液，避免吸出沉淀。</li>
		<li>轻轻重悬从3个管中获得的沉淀，每管加入1 ml预热的细胞培养基，将所有管中的细胞悬液合并至1个管中。用预热的细胞培养基补足体积至8 ml。</li>
		<li>用巴斯德移液管将细胞悬液非常轻柔地铺在分离梯度液上。室温下以507 × g离心30分钟，离心时勿使用刹车。</li>
		<li>离心后，利用背光法识别梯度中不同的细胞层。在密度为40–50%的离心介质中定位含有滋养层细胞及污染细胞的层。使用真空泵移除上层液体&#62; 50%).</li>
		<li>用巴氏吸管收集目标层中的细胞，转移至50 ml离心管中。用细胞培养基定容至50 ml。室温下以1,250 × g离心10 min。</li>
		<li>在无菌条件下，弃去上清液，加入 20 ml 胎牛血清（FBS）重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞悬液置于冰上，加入 2.22 ml 无菌二甲基亚砜（DMSO），通过轻柔翻转混匀。将 1.5 ml 细胞悬液分装至冻存管中，于 -80 °C 过夜冷冻后，转移至液氮罐中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滋养层细胞纯化
	<ol>
		<li>根据制造商的说明，在磁性纯化仪器上安装清洗缓冲液、运行缓冲液和新的过滤柱。执行 &#34;清洁程序&#34; 清洁负1、正1和正2端口，然后根据制造商说明将50 ml离心管分别接入各端口。</li>
		<li>快速将步骤 1.2.22 中冻存的细胞在 37 °C 水浴中解冻。将细胞转移至 50 ml 离心管中，加入 20 ml 冷的运行缓冲液，轻轻重悬细胞。在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。用冷的运行缓冲液重复洗涤步骤。使用血细胞计数板对细胞进行计数以确定细胞活力。再次离心（4 °C，450 × g，5 分钟）。小心移除上清液。加入含有 1% 的 1 ml 冷运行缓冲液 体积比体积 小鼠抗 HLA-ABC 抗体，4 °C 孵育 30 分钟，每 5 分钟轻柔混匀一次。</li>
		<li>加入6 ml预冷的运行缓冲液。在4 °C、450 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，并重复此步骤一次。将细胞重悬于1 ml含10%的预冷运行缓冲液中 体积/体积 加入与磁珠偶联的抗小鼠二抗，4 °C孵育15分钟，每5分钟轻柔混匀一次。</li>
		<li>加入6 ml预冷的运行缓冲液。在4 °C、450 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用5 ml预冷的运行缓冲液重悬。</li>
		<li>使用磁性纯化仪器分离滋养层细胞。从负极出口收集细胞，并加入20 ml冷的运行缓冲液。 
		注意：滋养层细胞不含复杂的 HLA-ABC，因此与其他细胞类型分离，并被导向负 1 孔。</li>
		<li>在 450 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞轻轻重悬于 20 ml 预热的基础培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数以测定细胞活力。</li>
		<li>以以下密度接种细胞：0.15 x 106 细胞/孔，置于96孔板中，1.6 × 106 细胞/孔，置于24孔板中，4.5 × 106 6 孔板中每孔接种细胞。在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养板子2.</li>
		<li>通过流式细胞术确认滋养层细胞的纯度16,17 和/或通过免疫细胞化学18. 
		注意：使用针对细胞角蛋白-7和波形蛋白的FITC标记单克隆抗体检测免疫纯化细胞的纯度17-19该方案在 Lanoix 中有详细描述。 等, 20087.</li>
		<li>至少 4 小时后，用温热的培养基将细胞冲洗两次，以去除未贴壁的细胞，然后将培养板转移至常氧培养箱中，该培养箱的环境由 8% O₂ 组成2 （参见 图2 以及第2节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外 常氧与缺氧/复氧的诱导
<ol>
	<li>培养箱操作（参见 图2A 用于设置。
	<ol>
		<li>在超净工作台中，将含有无菌水的培养皿置于培养箱室底部，以防止干燥；然后将先前制备好的细胞培养板或培养瓶（步骤 1.3.10）放置于箱内上层搁板上。</li>
		<li>在通风橱外，将腔室（进气口）连接至气体软管图2A：5a、b 和 c）以进入气体管（8% O₂2 或 0.5% O₂2) (图 2A：7）。打开腔室的进气口和出气口。此时，气体调节器（图2A：4）应保持关闭。</li>
		<li>小心打开气体调节阀（图2A4）以25 L/min的气流速度吹扫4分钟，彻底置换腔室内的空气。</li>
		<li>冲洗完腔室后，先关闭气体调节阀，然后关闭腔室的进气口和出气口。</li>
		<li>拔下流量计出口软管（图2A：5c）从培养室的进样口取出，并将培养室置于37 °C细胞培养孵育箱中。</li>
		<li>在步骤2.1.3之后1小时，通过向培养 chamber 中充入气体，替换培养板、培养瓶中现有的空气以及溶解在培养基中的气体。</li>
		<li>重复步骤 2.1.1 至 2.1.6，用于其他气体组成（例如，2% O₂2 用于孕早期滋养层细胞培养9).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认氧气百分比（图2B-C)
	<ol>
		<li>为确认培养 chamber 内细胞培养基（不含细胞）中的氧气浓度，使用连接至氧适配器的氧电极。将氧电极连接至伏特计。</li>
		<li>在相同溶液中绘制标准曲线（即，细胞培养基）通过将溶液暴露于已知氧含量的气体中（例如，0% 和 21% 氧气）。待每个浓度下的读数稳定后，将电极插入 chamber 中的培养基内。 
		注意：为避免氧气浓度出现偏差，所有测量均需在同一深度进行10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滋养层细胞中常氧及缺氧/复氧的诱导
	<ol>
		<li>将原代滋养层细胞接种至合适的细胞培养瓶、培养板或培养皿后，根据需要进行相应处理。</li>
		<li>同时，在培养箱内每隔24小时将细胞暴露于目标气体混合物中，以模拟特定条件图3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在哺乳动物中，胎儿发育直接依赖于胎盘功能的正常发挥。健康障碍的发育起源假说认为，成年后所表现出的疾病病因可追溯至早期发育阶段，且胎盘在胎儿程序化过程中具有机制性作用。30-32胎盘是胎儿生长发育的关键中介器官：它调节营养物质的转运，保护胎儿免受有害暴露的影响，并具有重要的内分泌功能。该方法由 Kliman 建立 等 一种可重复的分离活体初级细胞滋养层细胞技术的建立，是研究正常与异常胎盘功能的重要里程碑6许多研究人员已采用此技术来重现特定条件 体外 了解胎盘生理学18,20,33,34如Petroff所述 等，许多步骤对于确保获得高纯度且活力良好的分离细胞滋养层细胞至关重要18例如，自1988年该技术建立以来，消化步骤已进行了多项改进，包括增加消化次数和消化时间，以及调整消化酶的种类和用量，从而获得了更大量具有活性的分离细胞滋养层细胞18本方案目前具有三个主要优势：冷冻保存，使得后续继续进行实验成为可能；免疫磁珠纯化，可提高细胞滋养层细胞的纯度；以及使用预包被微孔板，以增强细胞...

在整个妊娠过程中，胎盘的细胞滋养层细胞（即单核干细胞）会迅速增殖并分化为绒毛或绒毛外细胞滋养层细胞。绒毛外细胞滋养层细胞侵入并重塑子宫壁的螺旋动脉。而绒毛细胞滋养层细胞则继续增殖、分化并融合，形成多核的合体滋养层（合胞体）1。维持绒毛滋养层的稳态对胎儿健康和正常妊娠至关重要。事实上，绒毛滋养层介导母体与胎儿之间的氧气和营养物质交换，并产生妊娠所必需的激素。此外，合体滋养层是唯一直接与母体血液循环接触的细胞类型，提供重要的物理和免疫屏障。因此，合体滋养层必须经历凋亡并被更新，以维持稳态，防止胎盘发生病理变化2-5。
Kliman 开发的技术 等6 1986年，从人胎盘中分离原代绒毛细胞滋养层细胞的技术引发了胎盘研究领域的革命，使得研究者能够深入探讨绒毛滋养层细胞分化过程中涉及的分子机制。这一经典技术基于连续使用胰蛋白酶和DNase进行酶消化，随后通过密度梯度离心介质（聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅颗粒，即Percoll）实现细胞分离，现已被公认为分离绒毛细胞滋养层细胞的金标准。该技术可通过磁性免疫纯化进一步优化，此方法依据不同类型细胞表面特定抗原表达的差异，将绒毛细胞滋养层细胞与非滋养层细胞分离开来。我们选择人类白细胞抗原ABC（HLA-ABC）作为标记物，因其在滋养层细胞膜上不表达7,8.
胎盘是一种在妊娠期间经历显著氧浓度变化的器官。在妊娠早期，其氧合水平在生理上非常低（2% O₂）。2）但增加至轻度氧合水平（8% O₂2）在妊娠第二和第三期。Tuuli 等9 描述了该 体外 在胎盘绒毛内模拟滋养层环境具有挑战性，氧合水平的变化甚至可能导致表型改变。因此，建议采用8%氧气作为常氧条件，以模拟妊娠第三孕期胎盘绒毛中的氧张力8,9. Chen 等10 广泛研究了与滋养层细胞培养中氧张力相关的多个变量，并证明了确定细胞周围微环境中氧水平的重要性。由于血管发生，绒毛中的氧水平 tends to 增加。胎盘绒毛中的血流持续增加，而过氧化氢（一种丰富的活性氧）的水平是调控血管发生的重要信号。11,12在妊娠并发症中，血管发生不足会导致缺氧，更重要的是引起氧合状态的间歇性波动（称为缺氧/再氧合）。这些情况会引起氧化应激异常升高，进而损害胎盘和胎儿的存活能力13,14滋养层细胞所经历的改变 体内 在缺氧/复氧期间可被模拟 体外 如下：绒毛细胞滋养层细胞在常氧条件下（8% O₂）维持培养。2）直至其分化为合体滋养层细胞，随后将其置于低氧条件（0.5% O₂）下处理。2）孵育4小时，随后再于常氧条件下（复氧）培养18小时。采用此缺氧/复氧处理方法，滋养层细胞表现出氧化还原状态失调以及内源性凋亡水平升高8，这在某些妊娠并发症中已有观察到。因此，这是一种有用的 体外 用于评估针对胎盘缺氧/再复氧相关妊娠并发症的新型预防和治疗方法的模型。
胎盘细胞可产生褪黑素，褪黑素具有多种重要功能，例如能够缓解氧化应激并防止胎盘功能障碍15。本文介绍了用于在分子、细胞和功能水平上证明褪黑素对胎盘滋养层细胞保护作用的实验方法和细胞模型8。

<table><tbody><tr><td>弯头梅岑鲍姆剪刀</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>外科手术器械（细胞分离）（2 件）</td></tr><tr><td>精细分裂镊 41/2 英寸</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>外科手术器械（细胞分离）（2 件）</td></tr><tr><td>4.5 英寸解剖剪</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>外科手术器械（细胞分离）（2 件）</td></tr><tr><td>纱布海绵 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td>361020733</td><td></td></tr><tr><td>长方形玻璃烤盘</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>玻璃器皿（2.8 L）</td></tr><tr><td>布赫纳漏斗</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>玻璃器皿（114 mm 直径）</td></tr><tr><td>表面皿&amp;nbsp;</td><td>派热克斯</td><td>9985100EMD</td><td>玻璃器皿</td></tr><tr><td>中性缓冲甲醛溶液，10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>组织学组织固定液</td></tr><tr><td>胰酶消化培养瓶</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>玻璃器皿（1 个）</td></tr><tr><td>一次性培养管</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>玻璃器皿</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管（22.8 cm）</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>玻璃器皿</td></tr><tr><td>250 ml 玻璃烧杯</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td>玻璃器皿</td></tr><tr><td>带盖玻璃培养基瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>玻璃器皿（8 件）</td></tr><tr><td>50 ml Corex 管&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>8422-A</td><td>（1单位）</td></tr><tr><td>15 ml 聚苯乙烯离心管</td><td>康宁</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚苯乙烯离心管</td><td>康宁</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清移液管</td><td>康宁</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛 100 &amp;mu;m 尼龙</td><td>康宁</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>吸水垫层</td><td>科学工具</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&amp;nbsp;毫升瓶 顶部滤器</td><td>康宁</td><td></td><td>孔径：0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m / 培养基与HBSS的制备</td></tr><tr><td>2 ml 冻存管</td><td>康宁</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty 冻存容器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3 模型</td><td></td></tr><tr><td>摇床水浴箱</td><td>Fisher</td><td>模型 127</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>0.9% 盐水溶液</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;Hank's 平衡盐溶液（Hbss）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>数量：9.25（一管）用于1 L消化液</td></tr><tr><td>羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）</td><td>&lt;a 名称=&quot;RANGE!B29&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>15630-080</td><td>25 ml（1 M）用于配制 1 L 消化液</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 I 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9,888 U</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 IV</td><td>罗氏</td><td>10-104-159-001</td><td>402,000 U</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基高糖（DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素硫酸盐</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>康宁</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>密度梯度离心培养基。体积：36 ml</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>顶体</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs 磁力分离器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>模型 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&amp;nbsp;列&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs 运行缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Automacs 清洗液&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>抗人 HLA-ABC 纯化克隆 W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>抗小鼠抗体</td></tr><tr><td>抗小鼠IgG微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>多孔板&amp;nbsp; 6 孔板（带盖）</td><td>康宁</td><td>3335</td><td>细胞黏附表面</td></tr><tr><td>多孔板&amp;nbsp; 24孔板（带盖）</td><td>康宁</td><td>3337</td><td>细胞黏附表面</td></tr><tr><td>多孔板&amp;nbsp; 96孔板（带盖）</td><td>康宁</td><td>3300</td><td>细胞粘附表面</td></tr><tr><td>模块化培养箱&amp;nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>同时产生常氧和缺氧/复氧条件需要一组两个</td></tr><tr><td>单一流量计</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm 一次性在线滤器</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>聚四氟乙烯，孔径：1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>气体调节器</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>同时产生常氧和缺氧/复氧条件需要一组两个</td></tr><tr><td>气体软管 Class Vi 透明 5/16&amp;nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3个样本，每个约0.5 m</td></tr><tr><td>17 mm 可调式气体软管夹</td><td>扎带</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>常氧气体钢瓶&amp;nbsp;</td><td>普莱克斯</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>K 型尺寸（3&lt;sup&gt;rd&lt;/sup&gt; 孕早期的组成：5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，8% O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, Bal. N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>常氧气体钢瓶&amp;nbsp;</td><td>普莱克斯</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>K 型（3&lt;sup&gt;rd&lt;/sup&gt; 孕早期的组成：5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.5% O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，Bal. N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Oxygen Microelectrode Mi-730</td><td>微电极公司 INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td>氧气适配器</td><td>Microelectrodes INC</td><td>3572</td><td></td></tr><tr><td>ROS检测试剂：CM-H2DCFDA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-hCG ELISA试剂盒&amp;nbsp;</td><td>DRG internatinal</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>抗波形蛋白纯化抗体</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>宿主：小鼠</td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白7（FITC）抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>宿主：小鼠</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG H&amp;amp;L 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

人原代滋养层细胞培养模型研究褪黑素对缺氧/复氧诱导损伤的保护作用

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

本方案描述了通过连续的酶消化、密度梯度离心、培养基梯度分离以及免疫磁珠纯化，从足月胎盘中分离绒毛细胞滋养层细胞的方法。如观察所示 体内，原代培养的单核绒毛细胞滋养层细胞在72小时后分化为多核合体滋养层细胞。与常氧（8% O₂）相比2），经历缺氧/复氧（0.5% / 8% O₂）的绒毛细胞滋养层细胞2) 经历增加的氧化应激和内在凋亡，类似于所观察到的现象 体内 在子痫前期、早产和胎儿宫内生长受限等妊娠并发症中，原代培养的绒毛滋养层细胞在缺氧/复氧条件下构成了一种独特的实验体系，有助于深入理解人类胎盘中发生改变的机制与信号通路，并推动寻找可有效防治特定妊娠疾病药物的研究。人类绒毛滋养层细胞能够合成褪黑素，并表达其合成酶及受体。由于褪黑素具有保护性的抗氧化作用，已被提出作为子痫前期和胎儿宫内生长受限的潜在治疗手段。在本文所述的原代绒毛细胞滋养层细胞模型中，褪黑素在常氧状态下对滋养层细胞无明显影响，但可恢复因缺氧/复氧而破坏的合体滋养层细胞的氧化还原平衡。因此，原代培养的人类绒毛滋养层细胞是研究褪黑素在缺氧/复氧条件下对胎盘功能保护作用机制的理想模型。

通过阴道分娩获得的正常足月胎盘中分离并免疫纯化出绒毛细胞滋养层细胞，获得 1 × 108 个活细胞。胎盘重 350 g，直径 19 cm，高 4 cm，呈盘状，胎膜透明。未发现小叶畸形。脐带为偏心附着，长度为 56 cm。通过波形蛋白（vimentin）和细胞角蛋白-7（cytokeratin-7）标记物的流式细胞术评估纯度。超过 98% 的细胞波形蛋白阴性、细胞角蛋白-7 阳性，证实了免疫纯化所得绒毛滋养层细胞的高纯度。将绒毛细胞滋养层细胞接种于 96 孔培养板中，在常氧条件下培养，并设置添加或不添加 1 mM 褪黑素的组别。通过检测 β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）的分泌水平来监测绒毛细胞滋养层细胞的生化分化，方法如先前所述1,7,20,21。通过免疫荧光染色抗桥粒斑蛋白（desmoplakin）和抗半胱天冬酶切割的细胞角蛋白 18 中间丝抗体评估细胞的形态学分化和凋亡情况7,22。收集从第 1 天（主要为绒毛细胞滋养层细胞）至第 4 天（主要为合体滋养层细胞）的细胞培养上清液，离心后测定上清中 β...

本文介绍了一种独特的 体外 低氧/复氧条件下培养的免疫纯化人绒毛细胞滋养层细胞模型。该模型适用于研究潜在治疗方法（如褪黑素）对与氧化应激增加及胎盘功能异常相关的妊娠并发症的保护作用。

本方案描述了通过连续酶消化法，随后进行密度梯度分离，从足月胎盘中分离绒毛细胞滋养层细胞的方法……

本实验的总体目标是利用在低氧或复氧条件下培养的免疫纯化原代人绒毛滋养层细胞，研究褪黑素的保护作用。该方法有助于理解与胎盘在低氧及复氧条件下妊娠并发症相关的机制和信号通路。该技术的主要优势在于适用于研究褪黑素等有望治疗与氧化应激增加相关的妊娠障碍的治疗方法。对于初次接触该方法的研究者而言，绒毛细胞滋养层的分离步骤（如组织切碎和密度梯度离心介质的制备）可能存在操作困难。尽管本方法主要为研究妊娠晚期滋养层细胞而设计，但也可适用于其他体系，例如妊娠早期胎盘以及其它物种的胎盘组织。该方法的可视化演示至关重要，因为许多操作步骤若无直观展示则难以掌握，而视频演示可显著提高实验的可重复性并缩短学习周期。本实验操作将由我实验室的研究生 Andree-Anne Hudon-Thibeault、Philippe Wong Yen 和 Eugenia Assuncao 演示。开始操作时，沿脐带在胎盘上的插入部位将其切断，并将胎盘和脐带置于 300 ml 组织固定液中，用于组织学分析。随后将整个胎盘切成小块。用生理盐水反复冲洗组织块，以去除所有血细胞，直至生理盐水变得清澈。接着，去除胎盘膜并切碎组织，以进一步清除血管并促进钙化。然后用镊子牢固夹住血管，移除切碎的组织。随后，将剪碎的胎盘组织置于布氏漏斗中，用 100 ml 生理盐水缓冲液冲洗组织。继续剪碎组织，直至获得 30 至 35 克的碎组织，并将其放置于冰上的称重舟中。接着，将剪碎的胎盘组织加入胰蛋白酶消化瓶中。然后，将150 ml制备好的消化液1转移至消化瓶中，并充分混匀。将消化瓶放入摇床水浴中孵育30分钟，每隔5分钟手动混匀一次，以确保消化均匀。第一次消化结束后，从水浴中取出消化瓶，倾斜45度静置1分钟，使胎盘组织沉淀。用 10 ml 无菌移液管移除并弃去约 80 ml 上清液，注意不要吸出组织。随后，向消化瓶中加入 100 ml 消化液 2，并充分混匀。将消化瓶置于摇床水浴中孵育 30 分钟，每隔 5 分钟手动混匀一次，以确保消化均匀。第二次消化结束时，将消化烧瓶从水浴中取出，倾斜45度静置1分钟。吸取80 ml上清液，并通过孔径100微米的细胞滤网轻轻转移至离心管中。进行第三次和第四次消化，并将第二、三、四次消化所得的上清液分别分装至15 ml离心管中，每管13.5 ml。然后，将1.5 ml FBS轻轻且缓慢地加入每根试管底部，以形成独立的分层。在室温下离心试管20分钟。之后，吸除并弃去上清液和FBS层，包括两层之间的白色薄膜。用1 ml温热的细胞培养基重悬沉淀。收集所有试管中的重悬细胞，并将同一消化批次的细胞合并至一个试管中。随后，用温热的细胞培养基补加体积至15 ml。将细胞在室温下离心10分钟。随后，用真空泵吸除上清液，注意不要吸到沉淀。接着，用1 ml预热的细胞培养基轻轻重悬沉淀。合并所有消化管中的内容物，加入预热的细胞培养基至总体积为 8 ml。随后，将细胞悬液轻柔地铺加到分离梯度介质上，室温下离心 30 分钟。离心后，通过背光识别梯度中不同细胞层。定位含有滋养层细胞及污染细胞的层，该层位于密度梯度离心介质的40%至50%之间，并用真空泵移除上层。随后，收集目标层中的细胞，并将其转移至50 ml离心管中。用细胞培养基定容至50 ml，室温下离心10分钟。在无菌条件下，将步骤1.2.22中冷冻的细胞在37摄氏度水浴中快速解冻。将解冻后的细胞转移至50 ml离心管中，加入20 ml预冷的运行缓冲液，轻轻重悬细胞。接下来，将离心管在4摄氏度下离心五分钟。弃去上清液，并用预冷的运行缓冲液重复洗涤步骤。然后，使用血细胞计数板对细胞进行计数以测定其活力，随后再次重复离心步骤。随后，小心吸除上清液，并向细胞中加入1 ml含1%体积比小鼠抗-HLA ABC抗体的冷洗涤缓冲液。4摄氏度下孵育30分钟，每5分钟轻柔混匀一次。孵育结束后，加入6 ml冷洗涤缓冲液，4摄氏度下离心5分钟。弃去上清液，并重复此步骤。然后，将细胞重悬于1 ml含有10%（体积比）偶联抗小鼠二抗的磁珠的预冷运行缓冲液中。接着，将细胞在4摄氏度孵育30分钟，每5分钟轻轻混匀一次。随后，加入 6 ml 冷的运行缓冲液，在 4 摄氏度下离心 5 分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于 5 ml 冷的运行缓冲液中。接着，使用磁性纯化仪器分离滋养层细胞，并从负极出口收集细胞。向细胞中加入 20 ml 冷的运行缓冲液，于 4 摄氏度离心 5 分钟。弃去上清液，用 20 ml 含 10% FBS 的温热原代细胞培养基轻轻重悬细胞，然后进行细胞计数以确定细胞活力。随后将细胞接种并置于 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养。至少四小时后，用预热的培养基将细胞冲洗两次，以去除未贴壁的细胞。然后将培养板转移至常氧培养舱中，该培养舱将充入8% O₂。在超净台外，将培养舱的进气口连接至气体软管，以接入气体管路。打开腔室的进气口和出气口，保持气体调节阀关闭。随后，小心打开气体调节阀，以每分钟25升的气流通入空气，持续4分钟，以彻底置换腔室内的气体。吹洗完成后，先关闭气体调节阀，然后关闭腔室的进气口和出气口。将流量计出口软管从腔室的进气口拔下，并将腔室置于37摄氏度的细胞培养孵育箱中孵育1小时。以每分钟25升的流速向腔室内重新充入气体4分钟，以置换培养板、培养瓶中现有的空气以及培养基中溶解的气体。该图显示了褪黑素对绒毛滋养层细胞分化过程中β人绒毛膜促性腺激素分泌的影响。绒毛细胞滋养层向合体滋养层的生化分化通过人绒毛膜促性腺激素β亚基水平的升高来确定，该值在细胞培养72小时后达到最高，如图所示。与对照组相比，8%氧气条件下培养时，褪黑素处理对细胞滋养层分化无影响。图中显示了在正常氧或培养72小时后诱导的缺氧-复氧条件下，1毫摩尔褪黑素对合体滋养层细胞内活性氧水平的影响。褪黑素处理可通过将活性氧水平恢复至常氧水平，保护合体滋养层细胞免受缺氧-复氧所增加的氧化应激损伤。该示意图展示了褪黑素在原代合体滋养层细胞中对缺氧-复氧诱导的氧化应激及线粒体凋亡所发挥的广泛细胞内保护作用。一旦掌握该分离技术，可在八小时内完成，若操作得当，仅需三小时即可获得纯化的滋养层细胞。在建立低氧-复氧条件下细胞滋养层细胞的分离纯化及原代细胞培养技术后，为深入理解妊娠并发症以及改善胎盘和胎儿健康奠定了基础。在进行该操作时，需注意在免疫纯化结束后评估绒毛滋养层细胞的纯度，例如通过流式细胞术进行检测。观看本视频后，您应能较好地掌握如何分离经免疫纯化的原代绒毛滋养层细胞，并在缺氧-复氧条件下进行培养。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

人胎盘滋养层细胞培养模型，研究褪黑素对缺氧的保护作用/复氧引起的中断

传统的二维细胞培养技术通常会导致分化标志物、细胞因子和生长因子等特性的改变。在旋转细胞培养系统（RCCS）中进行三维细胞培养可重建许多此类因子的表达，本文以绒毛外滋养层细胞系为例展示了这一效果。...

用于人类细胞培养的旋转细胞培养系统：以人类滋养层细胞为模型

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein...

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

本文介绍了一种人胎盘绒毛组织取样后分离细胞滋养层细胞用于原代细胞培养的实验方案。用TNFα处理滋养层细胞可模拟肥胖子宫内环境中的炎症状态，有助于发现母体肥胖胎盘中受炎症调控的分子靶点。...

一种原代人类滋养层细胞模型，用于研究母体肥胖相关炎症对胎盘自噬调控的影响

本文介绍了一种简便易行的实验方案，利用三种体外实验方法评估人类滋养层细胞的细胞运动能力：划痕实验、Transwell侵袭实验和细胞增殖实验。...

评估永生化人孕早期滋养层细胞系迁移、侵袭和增殖能力的体外实验方法

本文介绍了一种方法，用于解冻玻璃化保存的人类囊胚，将其在体外培养至着床时期，消化为单细胞，并收集早期滋养层细胞以供进一步研究。...

单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞

不同深度低温对心肌保护作用的差异尚未得到充分评估。本研究旨在利用基于人源心肌细胞的模型，定量分析不同低温处理后细胞死亡水平，为后续深入的分子机制研究奠定基础。...

体外评估低温预处理对人心肌细胞模型的心肌保护作用

本研究旨在开发一种新型的人类类器官视网膜培养（HORC）模型，以防止在移植体操作过程中破坏视网膜的完整性。该目标通过将视网膜与其上方的玻璃体以及下方的视网膜色素 上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜共同培养来实现。...

一种新型人类类器官视网膜培养技术的表征

模拟近端肾小管上皮细胞的缺氧/复氧损伤

自组装人源心脏类器官（hCOs）是一种新兴的人类心脏发育和疾病建模系统。本文提供了一种生成人源心脏类器官并利用缺氧-复氧方法对其进行损伤的实验方法，以及损伤后预期的组织学和功能学结果的详细描述。...

一种自组装人源心脏类器官的缺氧-复氧损伤模型

采用tBHP诱导HNM细胞早衰的标准化方案，以及分析关键衰老标志物（包括生长停滞、SA-β-半乳糖苷酶活性和SASP因子）的标准化检测方法。...

一种使用叔丁基过氧化氢诱导原代人黑素细胞产生应激诱导性早衰的标准化方案

学习使用免疫纯化人绒毛膜滋养层细胞建立缺氧/复氧体外模型，研究褪黑素对氧化应激的保护作用。该方法有助于理解胎盘功能障碍相关妊娠并发症的分子机制。

人原代滋养层细胞培养模型研究褪黑素对缺氧/复氧诱导损伤的保护作用

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