如何学习基底膜刚度生物物理触发在前列腺癌和其他与年龄相关的病理或代谢性疾病

该模型的总体目标是研究由于晚期糖基化和产物暴露而导致的基底膜刚度和厚度如何调节对应于转移性前列腺癌早期和晚期的侵袭性细胞行为。这种方法可以帮助回答年龄相关病理学领域的关键问题。例如基底膜刚度和厚度的增加如何导致癌症进展，以及糖尿病等代谢紊乱。

该技术的主要优点是它提供了一种简单的方法来模拟在临床环境中测量的人前列腺肿瘤的硬度水平。这项技术的影响通过提高我们对基底膜刚度如何促进分子和细胞变化的理解，延伸到我们对前列腺癌的治疗和诊断。刚接触这种方法的人可能会很困难，因为该模型是多学科的。

结合化学、物理和生物学领域的技术。当我们假设前列腺中的基底膜刚度可以促进已知转化的上皮细胞的新发侵袭行为时，我们第一次有了这种方法的想法。这种方法的视频演示至关重要，因为需要描述跨学科步骤。

包括基底膜的交联，然后进行 3D 细胞培养。首先准备一个均匀的冰表面，并用它将八孔室玻璃载玻片冷却至 4 摄氏度。然后，切掉 200 μL 移液器吸头的末端，并将吸头冷却至 4 摄氏度。

冷却后，将吸头放在容量为 200 μL 的移液辅助装置上。并使用它将 40 微升冰冷的 BM 基质溶液转移到冷藏的八孔室载玻片的每个孔中。然后将腔室载玻片置于 37 摄氏度下 30 分钟，以促进基底膜的聚合。

非常小心地关闭培养箱门，以免干扰液体重构的基底膜。正好 30 分钟后，加入 250 微升准备好的乙醛溶液，以覆盖聚合、重构的基底膜。接下来，通过将 250 微升无菌 PDS 添加到天然、重构的基底膜凝胶中来制备阴性对照。

此外，在将 50 毫摩尔氰基氢化钠或 250 毫摩尔氨基胍添加到基底膜凝胶中之前，向乙二醇溶液中加入 50 毫摩尔氰基氢化钠或 250 毫摩尔氨基胍，以制备两种额外的对照。然后，将凝胶在 37 摄氏度下孵育 6 小时，以产生半硬凝胶。或持续 14 小时以产生坚硬的凝胶。

孵育后，小心地从凝胶中取出溶液，并向每块凝胶中加入 250 μL 1 摩尔甘氨酸乙酯。并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。在 500 微升 PBS 中洗涤每块凝胶 10 次，以去除所有痕量的乙醛溶液和甘氨酸乙酯。

然后加入 400 微升 PBS 以防止脱水，并将重构的基底膜凝胶在 37 摄氏度下孵育过夜。准备继续时，从重构的基底膜凝胶中取出 PBS，并向每个孔中加入 250 微升冰冷的双蒸水。将凝胶在 4 摄氏度下孵育 16 至 24 小时，以确保基质完全液化。

然后将液化的基底膜转移到 1.5 毫升的管中，并使用分光光度计测量溶液的荧光发射。然后离心溶液并去除所得上清液。将沉淀重悬于 500 微升含有 20 毫克/毫升溴化氰和 70% 甲酸的溶液中。

将样品在室温下孵育过夜。接下来，使用 1 毫升一次性注射器将重悬的基底膜凝胶转移到截留分子量为 3.5 道尔顿的透析盒中。将溶盒浸入装有 500 毫升双蒸水的 500 毫升玻璃烧杯中。

并用磁力搅拌棒搅拌水。将此设置在 4 摄氏度下过夜，以去除所有痕量的溴化氰和甲酸。使用 1 毫升一次性注射器将透析液从透析盒转移到 1.5 毫升试管中。

然后通过在 12% 聚丙烯酰胺凝胶上运行来分析溶液。用银染剂对凝胶进行染色，以观察溴化氰基质肽的电泳模式。从覆盖有 PBS 的基底膜凝胶开始，用 300 微升含有 0.1 毫摩尔氯化钙的 PBS 再冲洗凝胶两次。

和 0.5 毫摩尔氯化镁。在室温下放置 5 分钟。然后，去除 PBS 并加入 300 微升 4% 多聚甲醛以覆盖每个重构的基底膜凝胶。

在室温下孵育凝胶 30 分钟，以固定重构的基底膜组分。接下来，去除固定剂并加入 300 微升含有 75 毫摩尔氯化铵和 0.5 毫摩尔氯化镁的淬灭液。在室温下孵育溶液 5 分钟，然后取出溶液并再次重复冲洗 4 次。

最后一次冲洗后，向重构的基底膜凝胶中加入 300 μL 免疫荧光缓冲液，以防止非特异性反应。将凝胶在室温下在摇动平台上在溶液中孵育 2 小时。然后去除免疫荧光封闭缓冲液。

并加入 300 μL 在封闭缓冲液中稀释的一抗。将复溶的基底膜凝胶在 4 °C 下孵育 16 小时。第二天，去除一抗，用 300 μL 免疫荧光缓冲液洗涤凝胶 3 次。

每次添加缓冲液后，在室温下在摇动平台上摇动凝胶 10 分钟。然后去除缓冲液并加入 300 μL 荧光标记的二抗，在封闭缓冲液中稀释。将样品放在摇动平台上，并在室温下孵育凝胶 2 小时。

去除二抗。在免疫荧光缓冲液中冲洗样品，然后用 PBS 冲洗，然后再次固定和淬灭样品。最后，封固凝胶并使用显微镜分析致密束的形成。

为了形成前列腺腺泡，在 300 微升完全 KSFM 中稀释 5， 000 个 RWPE-1 细胞，并补充有 2% 的基底膜溶液。对于前列腺肿瘤细胞聚集体，在 300 微升 RPMI-1640 培养基中稀释 2， 500 个 PC3 细胞，并补充有 2% 的基底膜溶液。将重构的基底膜凝胶在 PBS 中孵育过夜后，用 500 μL 培养基冲洗两次。

在接种细胞之前。轻轻地将细胞接种到天然和晚期糖基化终产物硬化的重组基底膜上。并小心地将培养物放入培养箱中，以确保生长的腺泡和球体均匀分布。

对于腺泡形成细胞，每两天用含有 2% 基底膜溶液的新鲜培养基更换培养基。确保细胞具有正常腺泡稳态所需的生长因子。培养 6 天后，前列腺上皮细胞在天然重构的基底膜上形成腺泡。

并组织成上皮细胞的均匀球体。这些腺泡还具有高度组织化的 PEC 的特征，具有顶端到基底极性和可见的管腔空间。在硬化的膜上培养 6 天后，细胞的结构被破坏。

并将形状从椭球体更改为多边形。此外，这些腺泡是高度杂乱无章的。并且已经失去了它们的顶端到基底极性，有一个小或不存在的管腔空间。

受良性前列腺增生影响的前列腺衍生细胞也是如此。当测量前列腺肿瘤细胞时，发现细胞在坚硬的、重建的基底膜上更长，迁移速度也更快，细胞持久性增加。观看此视频后，您应该对如何模拟基底膜刚度对上皮和肿瘤细胞行为的影响有很好的了解。

在尝试此过程时，重要的是要记住，会诱导所需的基底膜刚度水平，并且会正确形成单个腺泡或 s 球体。开发后，这项技术为肿瘤学领域的研究人员探索前列腺基底膜刚度诱导癌细胞侵袭铺平了道路。按照该方案，可以进行其他方法，如细胞裂解物的免疫印迹，以回答与信号通路相关的其他问题，受基底膜刚度调节。

不要忘记，使用氰基硼氢化钠、溴化氰和甲酸可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在通风橱中工作时佩戴实验服、手套、面罩和呼吸器。