Name: 从真核细胞染色体外的环状DNA基因组范围内的净化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: 学习Circle-Seq方法，用于真核细胞染色体外环状DNA的全基因组纯化与检测。该方法结合柱纯化、核酸外切酶消化、滚环扩增和高通量测序技术，可在Saccharomyces cerevisiae中高效富集并鉴定eccDNA，为基因组稳定性与进化研究提供高灵敏度工具。

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感谢 Kenn D. Møller 和 Claus Sternberg（DTU）提供的技术支持，以及 Tue S. Jørgensen 在定量 PCR 分析方面的帮助。

注意：环状DNA纯化与测序方法（Circle-Seq）的概述如图1所示。
1. 培养、细胞收获与质膜破裂
<ol>
	<li>接种酵母细胞（例如&#160;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）) 从过夜培养物中接种至50 ml酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）完全培养基中。以1-3 × 10的低初始细胞密度接种5 细胞/毫升或光密度约为0.01 OD600.
	<ol>
		<li>在30°C、150转/分钟（rpm）振荡条件下培养细胞，直至细胞密度达到最大值，约为1 x 1010 细胞，大约在24至48小时后，或光密度达到OD600 &#62; 10.0. 
		注意：培养时间并非关键，因为可使用较低的细胞浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将长满的培养物转移至50 ml锥形管中，以800 × g离心3 min收集细胞沉淀&#160;弃去上清液。</li>
	<li>用25 ml含10 mM Tris-Cl、1 mM EDTA、pH 8.0的缓冲液洗涤沉淀，800 × g离心3 min重新收集细胞，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1.2 ml质粒柱纯化试剂盒中提供的重悬缓冲液中。</li>
	<li>可选步骤：添加高度稀释的质粒作为对照，用于环状DNA元件纯化的对照20. 
	注意：在当前数据集中，每个含有10的样本使用了7.7 µl质粒混合物10 细胞。质粒储备混合物包含三种不同浓度的质粒：pBR322 为 38 ng/样本，pUC19 为 0.5 ng/样本，pUG72 为 0.01 ng/样本。</li>
	<li>将细胞悬液转移至两支2 ml微量离心管中，每管中加入0.5 mm玻璃珠，玻璃珠体积占总悬液体积的1:3比例。</li>
	<li>每管在最大转速下涡旋震荡10分钟，以破坏血浆细胞膜。在268 x g条件下离心30秒，使磁珠沉淀。&#160;将两个微量离心管中的1.2 ml合并上清液转移至一个新的离心管中。 
	注意：可替代步骤1.6–1.7，使用zymolyase在0.6 ml重悬缓冲液中裂解细胞。10单位zymolyase可裂解5 × 107 35°C 下 1.5 小时内培养细胞。</li>
</ol>
2. 通过柱层析富集eccDNA
<ol>
	<li>按照质粒柱纯化试剂盒的说明书进行操作。简而言之，每个样品加入1.2 ml碱性溶液，轻轻混匀，并在室温下孵育3分钟。</li>
	<li>加入1.2 ml中和缓冲液，轻轻混匀后，在9650 × g下离心5分钟。</li>
	<li>将溶液上样至已用1 ml平衡液预平衡的层析柱中，依靠重力使液体自然流过柱体。</li>
	<li>用4 ml洗涤液洗涤柱子。当溶液完全流经树脂后，小心加入0.3 ml洗脱液，以置换柱中大部分的0.35 ml空体积。</li>
	<li>用1 ml洗脱液将DNA洗脱至新的收集管中，并加入0.8 ml沉淀混合液以沉淀DNA。在9650 × g下离心10分钟。</li>
	<li>用0.5 ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，在9650 × g下离心5分钟，室温晾干5至15分钟，然后将纯化的DNA溶解于25 µl无菌水中。 
	注意：仅建议将DNA短期保存于水中。最好直接进入第3步。</li>
</ol>
3. 消化剩余的线性染色体DNA
<ol>
	<li>可选步骤：为了促进外切核酸酶对线性 DNA 的特异性消化，使用一种罕见切割的内切核酸酶（如 NotI）处理纯化的 DNA。对于 5 µg DNA，使用 1 单位 NotI、5 µl 10x 消化缓冲液，并用无菌水补足至总体积 50 µl。将反应在 37°C 下孵育 16 小时，然后在 80°C 下加热 5 分钟以灭活内切核酸酶。</li>
	<li>在 50 µl 经内切核酸酶切割的 DNA 中，直接加入 20 单位外切核酸酶（2 µl）、4 µl ATP（25 mM）、34 µl 无菌水和 10 µl 10x 反应缓冲液，使用 ATP 依赖性外切核酸酶试剂盒，使总体积达到 100 µl 的 1x 反应体积。</li>
	<li>在 37°C 下对线性单链和双链 DNA 进行水解，持续 5 天或更长时间。每隔 24 小时补充 4 µl ATP（25 mM）、0.6 µl 10x 反应缓冲液和 20 单位外切核酸酶，以维持 1x 反应体积，继续进行酶促 DNA 消化。</li>
	<li>去除线性 DNA 后，从外切核酸酶处理的溶液中取 2 µl 样品，通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测染色体线性 DNA 是否被完全清除，使用如肌动蛋白基因 ACT120 等染色体标记进行验证。
	<ol>
		<li>每个 20 µl 的 qPCR 反应体系包含 2 µl 外切核酸酶处理的样品、150 nM ACT1 引物 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3' 和 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3'、2%（体积/体积）二甲基亚砜，以及 10 µl 绿色荧光预混液。</li>
		<li>采用以下反应条件：95°C 预变性 3 分钟，随后进行 45 个循环，每个循环为 95°C 变性 15 秒，60°C 退火延伸 30 秒。 
		注意：ACT1 是检测线性 DNA 的理想标记，因为该基因的拷贝数变异具有致死效应21-23，因此 eccDNA 不应携带 ACT1。</li>
		<li>除 qPCR 外，还可采用&#160;常规 PCR（4.3）或碘化丙啶染色（4.4）来分析 DNA 消化情况。
		<ol>
			<li>以 2 µl 外切核酸酶处理的样品作为 PCR 模板，使用 ACT1 引物 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3' 和 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3' 进行扩增。以 50–100 ng 基因组 S. cerevisiae DNA 作为阳性 ACT1 对照模板。PCR 反应条件为：95°C 预变性 3 分钟，随后进行 35 个循环，每个循环为 95°C 变性 30 秒，56°C 退火 30 秒，72°C 延伸 1 分钟。</li>
			<li>将 PCR 产物在含 0.5 µg/ml 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析。观察是否存在 0.8 kb&#160;ACT1 条带。&#160;</li>
		</ol>
		</li>
		<li>也可通过碘化丙啶染色在 DNA 扩增前后检测线性 DNA 的存在与否。&#8203;
		<ol>
			<li>将每个 DNA 样品与 20 mM 碘化丙啶储备液经 H2O 稀释 1,000 倍后的溶液按 1:1 体积混合。室温避光孵育 10–20 分钟&#160;，然后在荧光显微镜下使用红色激发滤光片（663–738 nm）以 100 倍放大倍数观察 DNA 染色情况，曝光时间为 5 至 30 秒。以 ø29 扩增的酵母基因组 DNA 和/或 ø29 扩增的质粒 DNA 作为 DNA 染色对照。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 70°C 下加热 30 分钟以灭活外切核酸酶溶液。</li>
</ol>
4. DNA 扩增
<ol>
	<li>根据DNA聚合酶生产商的说明书，使用ø29 DNA聚合酶对步骤3.5中纯化和富集的eccDNA进行扩增24-26。
	<ol>
		<li>简言之，将5 µl富集的eccDNA与5 µl变性&#160;缓冲液混合。</li>
		<li>室温孵育3分钟后，加入10 µl中和缓冲液。轻轻混匀后，加入30 µl预混液（包含29 µl反应缓冲液和1 µl ø29 DNA聚合酶）。在30°C下孵育反应体系16小时或更长时间（最长可达72小时）。随后在65°C加热3分钟以灭活ø29 DNA聚合酶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 测序与数据分析
<ol>
	<li>使用聚焦式超声波破碎仪将扩增的eccDNA剪切至平均目标片段大小为300 bp。针对130 µl的DNA样本，采用以下参数：峰值强度功率450 W，处理时间60秒，占空比30%，每脉冲循环200次，温度7°C。</li>
	<li>采用适当的文库构建方法，为片段化的DNA序列添加条形码索引标签和接头，以合成用于测序的文库。</li>
	<li>进行深度&#160;测序，例如在高通量测序平台上生成长度为141个核苷酸的单端读段。</li>
	<li>将测序读段比对至正在研究的酵母参考基因组，并允许读段比对到多个基因组区域。例如，可使用一种公开可用的工作流系统27,28和短读段比对软件29。</li>
	<li>利用连续覆盖的读段识别潜在eccDNA区域的读段，例如，在无间隙的情况下连续出现超过七个读段（&#62;1 kb）20。 
	注意：已有可用软件27,28用于分析目标基因组区域的比对读段。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

Circle-Seq 方法能够以序列水平分辨率实现从酵母细胞中全基因组范围检测染色体外环状DNA（eccDNA）。该方法采用温和的eccDNA纯化流程，无需剧烈涡旋或移液操作，并通过重力柱分离技术减少eccDNA断裂，从而避免因断裂导致的外切核酸酶消化。&#160;后续步骤。这些方法学特征对于检测包含基因序列的大片段eccDNA可能至关重要。Circle-Seq检测到了大量包含完整基因的eccDNA。数据集 1。它还检测到了86 kb的酵母线粒体DNA。因此，本方案&#160;有助于纯化大型环状DNA元件。尽量减少DNA提取步骤的次数可降低&#160;eccDNA 丢失的风险，并最大化&#160;产量。根据对照和添加质粒的实验结果，Circle-Seq 具有高度灵敏性，可从 2,500 个细胞中检测到单个环状 DNA。此外，去除高丰度的内源性质粒（如 2µ 质粒或线粒体 DNA）可能会&#160;显著提高灵敏度。固化&#160;来自酵母培养物的2µ已有所描述30或者，可使用罕见切割的内切核酸酶（如SwaI）去除2µ和线粒体DNA。然而，限制性酶切步骤可能靶向其他感兴趣的eccDNA，从而限制总eccDNA的得率。
检测eccDNA的关键步骤包括去除线性DNA（步骤3）和进行适当深度的DNA测序（步骤5）。为了记录来自细胞群体中的大多数eccDNA，需要进行深度测序&#160;测序可能是必需的20双端测序应提供&#160;对eccDNA检测具有更高的置信度，因为预期会出现环状DNA连接&#160;产生比对不一致的成对末端序列。这些差异支持环状DNA结构的发现，并可作为额外的eccDNA检测筛选条件。
Circle-Seq 方法通过三个独立的实验进行了验证 S. cerevisiae CEN.PK 群体。检测到的序列包括先前报道的染色体外环状DNA、内源性质粒、添加的质粒以及数百种假定的染色体外环状DNA（数据集 1）。这些发现支持了此前来自 Circle-Seq 的数据集 S. cerevisiae S288c20. 在CEN.PK和S288c群体中发现多个共有的eccDNA，表明这些基因座倾向于以环状元件形式存在（图4）。我们先前已证明 [GAP1圆形在CEN.PK背景下，氮限制条件下其含量升高8，尽管有[GAP1圆形] 在其他菌株背景中尚未发现。该发现的&#160;eccDNA 来自 CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111，以及 HXT6 HXT7 S288c 和 CEN.PK 中的位点表明，DNA 环化倾向在酵母菌株之间是保守的。尚需证明是否 [HXT6/7圆],&#160;[ASP3-1圆], [COS111圆]，以及[CUP1-1 RSC30圆] 赋予选择性优势&#160;细胞&#160;或者它们的存在仅仅是DNA环化率较高的结果。
综上所述，实验结果表明，Circle-Seq 非常适合检测千碱基大小的染色体外环状 DNA（eccDNA），并具有识别携带完整基因的 eccDNA 的优势。Circle-Seq 是一种高灵敏度的方法，可实现从酵母中进行全基因组规模的 eccDNA 筛查。该方法有望开辟一个旨在阐明 eccDNA 在基因缺失和扩增中作用的新研究领域。鉴于从真核酵母到高等真核生物的 DNA 结构和构型在很大程度上是保守的，原则上 Circle-Seq 方法应适用于所有真核细胞，仅需稍作修改。目前尚未发现该方法存在明显局限性，但其纯化兆碱基大小 eccDNA 的能力仍有待验证。此外，该方法使用了通过滚环扩增方式进行扩增的 ø29 DNA 聚合酶31，这会导致对较小的 eccDNA 产生偏好性，从而增加 eccDNA 定量的难度。Circle-Seq 能够检测到足以携带完整基因的 eccDNA，因此适用于对“双微体”（double minutes）——即来源于人类体细胞的环状 DNA——的研究。当原癌基因在这些元件上发生扩增时，双微体可能促进癌症的发生32-37。对生殖细胞中 eccDNA 的研究可用于测量生殖系突变率，并评估精子质量，例如在畜牧业中的应用。因此，Circle-Seq 有望揭示以拷贝数变异形式出现的遗传变异的发生速率，并推动对涉及基因拷贝数变异的疾病形成全新的认识38-40。

检测早期或短暂的染色体扩增十分困难，因为这需要在大量细胞群体中识别单个DNA分子的改变。染色体拷贝数变异（CNV）通常在其形成后较长时间才能被检测到，因此仅能保留最终的CNV结构作为产生该变异机制的证据1,2。在CNV形成的早期阶段检测并回收染色体外环状DNA（eccDNA），可能有助于阐明基因组重排过程中的动态机制。
此前， 从头合成 eccDNA的发现源于电子显微照片3，中期染色体的吉姆萨染色4，或二维凝胶电泳5这些方法无法或仅能提供极少关于环状DNA序列的信息。靶向技术（如Southern印迹法）6,7，反向PCR8，或荧光 原位 杂交9 仅能提供关于特定eccDNA元件的证据，这些方法均无法提供细胞群体中所有现存eccDNA类型的序列信息。
通过基因组测序和/或平铺阵列可对细胞群体中的基因组分歧进行表征10,11。利用传统的DNA纯化方法检测缺失或扩增通常要求突变等位基因在细胞群体中占比至少达到0.1-1%12,13。由于无着丝粒的染色体外环状DNA（eccDNA）缺乏着丝粒，并且在复制过程中可能无法进行DNA合成，因此其在细胞培养物中预计更加短暂易失。因此，鉴于大多数eccDNA含量较低且其序列与基因组相似，需要采用替代的DNA提取方法来检测eccDNA。
多种环状DNA纯化技术利用了染色体与环状DNA之间的结构差异。例如，可通过在氯化铯梯度中进行高速超速离心，从人宫颈癌HeLa细胞系中分离出大小为350-3000个碱基对（bp）的eccDNA14然而，高速离心可能会断裂或切开超螺旋环状DNA结构的骨架，从而改变其沉降速度15 以及eccDNA的产量。Dutta及其同事开发了一种方法 从头合成从小鼠组织以及鸡和人类细胞培养物中进行全基因组水平的环状DNA鉴定16,17通过蔗糖超速离心法从匀浆组织中提取细胞核，随后进行质粒纯化以及多轮酶促反应和DNA提取。该方案主要鉴定长度为200-400 bp的eccDNA，称为microDNA。Dutta及其同事还尝试从microDNA中进行纯化 酿酒酵母 但无法从该酵母物种中记录到微小DNA16.
我们开发了一种新的方法 从头合成 从酵母中检测eccDNA的Circle-Seq方法。该方法能够对足够大以携带完整基因、最大可达86千碱基（kb）的线粒体DNA（mtDNA）的环状DNA分子进行全基因组尺度的筛查。Circle-Seq方法源自一种成熟的原核质粒纯化技术。18,19，针对真核酵母细胞优化，并结合深度&#160;测序。利用Circle-Seq方法，从十个样本中检测到1756种不同的eccDNA，均大于1 kb S. cerevisiae S288c 群体20选择大小截断值以聚焦于eccDNA&#160;足够大以携带完整的基因。Circle-Seq 具有高度灵敏性，可在数千个细胞中检测到单个eccDNA20在本研究中，采用Circle-Seq从另一组三个生物学重复样本中分离并鉴定了294个eccDNA S. cerevisiae 酵母菌株，CEN.PK。数据表明，eccDNA 是一种常见的遗传元件 S. cerevisiae 菌株

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD Difco</td><td>211677</td><td>可使用替代产品。</td></tr><tr><td>Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>600882</td><td>用于qPCR分析。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>葡萄糖（D-葡萄糖）</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.4</td><td>可使用替代产品。</td></tr><tr><td>破碎珠，0.5 mm</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-BG05</td><td>用于破坏血浆细胞膜的玻璃珠。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Carl Roth</td><td>2218.2</td><td>用于检测DNA/RNA的琼脂糖凝胶染色剂。</td></tr><tr><td>GeneJet质粒小量提取试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0502</td><td>用于从细菌中纯化质粒。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>NotI，FastDigest</td><td>Life Technologies -&amp;nbsp; Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>FD0594</td><td>内切核酸酶。可使用替代产品。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Plasmid Mini AX试剂盒&amp;nbsp;</td><td>A&amp;A Biotechnology, Poland</td><td>010-50</td><td>用于纯化eccDNA的质粒纯化试剂盒。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP依赖性DNase试剂盒</td><td>Epicentre, USA</td><td>E3105K</td><td>ATP依赖性外切核酸酶试剂盒。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>碘化丙啶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>81845</td><td>可使用替代产品。</td></tr><tr><td>pUG6质粒</td><td>EUROSCARF, Germany</td><td>P30114</td><td>标记基因：loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP。</td></tr><tr><td>QIAGEN基因组-tip 100/G&amp;nbsp;</td><td>Qiagen, USA</td><td>13343</td><td>用于从酵母中纯化基因组DNA。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>REPLI-g Mini试剂盒方案&amp;nbsp;</td><td>Qiagen, USA</td><td>150023</td><td>利用phi29聚合酶扩增eccDNA。</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD Difco</td><td>210929</td><td>可使用替代产品。</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T（溶菌酶，酵母裂解酶）</td><td>Nordic BioSite, Sweden</td><td>Z1004-3</td><td>可使用替代产品。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;序列文件数据访问&lt;/strong&gt;</td><td>欧洲核苷酸数据库&amp;nbsp;</td><td></td><td>来自&lt;i&gt;Saccharomyces cerevisiae&lt;/i&gt; CEN.PK113-7D的eccDNA数据集。研究登录号PRJEB9684。第二个登录号为ERP010820。基因座标签前缀为BN2032。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Saccharomyces cerevisiae&lt;/i&gt; CEN.PK113-7D</td><td></td><td></td><td>基因型 MATa MAL2-8c SUC2</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Saccharomyces cerevisiae&lt;/i&gt; 酵母基因敲除文库混合物</td><td>EUROSCARF, Germany</td><td></td><td>S288c BY4741菌株，包含4400个由KanMX模块中断产生的可存活单基因敲除突变体的混合物。基因型为&lt;em&gt;MAT&lt;strong&gt;a&lt;/strong&gt; his3&amp;Delta;1 leu2&amp;Delta;0 met15&amp;Delta;0 ura3&amp;Delta;0 genexxx::KanMX。&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA分光光度计&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop 1000分光光度计，Thermo Fisher</td><td></td><td>用于测定DNA浓度。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon Optronics Magnafire。红色激发荧光滤光片，663-738 nm。</td><td></td><td>可使用替代产品。</td></tr><tr><td>自动化文库构建系统</td><td>Apollo 324，IntegenX Inc.</td><td></td><td>用于DNA文库制备。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>测序平台</td><td>Illumina HiSeq 2000平台，Illumina Inc.</td><td></td><td>用于DNA测序。可使用替代产品。</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Covaris LE220，microTUBE AFA Fiber管</td><td></td><td>可使用替代产品。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;方法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% YPD培养基&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>将10 g葡萄糖、10 g酵母提取物、20 g胰蛋白胨混合，加水至总体积1000 ml，高压灭菌。</td></tr><tr><td>基因组DNA的Circle-Seq检测</td><td></td><td></td><td>从酵母基因敲除文库（Euroscarf）混合物中提取基因组DNA（Qiagen）。使用NanoDrop测定DNA浓度，并将30 &amp;micro;g基因组DNA分装至两个微量离心管中。其中一个微量离心管中加入100纳克质粒（pUG6）。使用Circle-Seq方法纯化DNA，省略方案中的步骤1.1-1.3和1.5-1.7。使用NanoDrop测定洗脱后DNA浓度，并将样品GD和GD+P的全部DNA产物进行29小时外切核酸酶处理。取10%的样品用于phi29扩增和PCR分析，其余DNA继续进行72小时外切核酸酶处理。通过PCR分析各样品中的线性DNA含量，使用&lt;i&gt;ACT1&lt;/i&gt;基因作为染色体标记。将每个外切核酸酶处理样品的5%部分用phi29 DNA聚合酶扩增16小时（Qiagen）。通过凝胶电泳后，将等量（7 &amp;micro;l）的各样品加载到含0.5 &amp;micro;g/ml溴化乙锭的0.9%琼脂糖凝胶孔中，检测各样品中DNA的存在情况。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>比对软件</td><td>Bowtie2比对器，约翰·霍普金斯大学</td><td></td><td>超快速短序列比对。参考文献：29。</td></tr><tr><td>碘化丙啶染色</td><td></td><td></td><td>使用荧光显微镜在100倍放大倍数下（100x/1.30油镜，Nikon）的RFP通道（红色激发荧光滤光片，663-738 nm）拍摄碘化丙啶染色DNA的图像，曝光时间保持一致（5秒）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物信息学工作流系统</td><td>Galaxy，开源平台。</td><td></td><td>一个免费的基于网络的平台，用于数据密集型生物医学研究。参考文献：27-28。</td></tr></tbody></table>

真核细胞中外染色体环状dna的全基因组纯化

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

染色体外环状DNA（eccDNA）是多种生物中常见的遗传元件 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 在其他真核生物中也有报道。eccDNA有助于多细胞生物体细胞间的遗传变异以及单细胞真核生物的进化。为了阐明这些元件如何影响基因组稳定性，以及环境和生物学因素如何作用，亟需灵敏的eccDNA检测方法。&#160;诱导其在真核细胞中形成。本视频介绍了一种灵敏的eccDNA纯化方法，称为Circle-Seq。该方法包括环状DNA的柱纯化、去除残留的线性染色体DNA、eccDNA的滚环扩增、深度测序及序列比对。通过充分的外切核酸酶处理&#160;是&#160;足以实现线性染色体 DNA 充分降解所必需的。滚环扩增步骤通过 φ29聚合酶对环状DNA的富集程度高于线性DNA。在三个样本上对Circle-Seq方法进行验证 S. cerevisiae CEN.PK 群体数量为 1010 检测到数百个尺寸大于1千碱基的eccDNA谱型。反复发现 ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30&#160;HXT6, HXT7 S288c 和 CEN.PK 菌株中环状 DNA 上的基因表明，这些位点的 DNA 成环机制在不同菌株间具有保守性。总之，Circle-Seq 方法在真核生物全基因组水平筛选染色体外环状 DNA 以及特异性 eccDNA 类型的检测方面均具有广泛的应用价值。

为验证 Circle-Seq 方法，对三组分别在 YPD 培养基中独立培养十代后的 S. cerevisiae CEN.PK 群体（每组 1 × 1010 个细胞）进行了筛选。如先前所述20，通过定量 PCR 检测不到 ACT1 信号来确认染色体线性 DNA 的消除（数据未显示）。纯化并富集的 eccDNA 被测序至最多 6800 万条读长（141 核苷酸单端读长），并比对至 CEN.PK113-7D 参考基因组（2012 年 6 月 19 日版本）。来自命名为 C1、C2 和 C4 的三个样本中假定 eccDNA 的记录被分配至由长度超过 1 kb 的连续读长所覆盖的基因组区域。基于 10,000 次蒙特卡洛模拟，估算了每个由长度超过 1 kb 的连续读长覆盖区域的显著性。据此，分别将 79、159 和 56 个区域注释为可能的 eccDNA 序列（p &lt; 0.1，数据集 1）。记录到的长度 > 1 kb 的连续读长数量随测序深度增加而上升，表明若进一步测序，可能会检测到更多的 eccDNA 元件（图 2）。正如预期，Circle-Seq 方法从多个已知的环状 DNA 元件中获得了大量读长，包括 2µ 质粒、线粒体 DNA、位于第 XII 号染色体上的核糖体 RNA 基因，以及在柱纯化前加入样本作为内参对照的三种质粒 pBR322、pUC19 和 pUG72（图 3）。
视频展示了一个连续读段比对到IV号染色体上HXT7_ARS432_HXT6位点的示例。此前，通过Circle-Seq在十个S288c群体（每个群体含1 x 1010个细胞）中检测到了[HXT6/7circle]，并通过反向PCR分析确认了其环状DNA结构20。在三个CEN.PK群体中也均检测到了[HXT6/7circle]（图4A）。此外，CEN.PK重复样本中大多数常见的eccDNA基因与S288c数据集中的eccDNA基因存在重叠（图4B）。
为了检验Circle-Seq方案在环状DNA纯化中的特异性，准备了两个样本，每个样本均含有 30 µg 基因组DNA进行了检测。其中一个样本添加了100 ng质粒DNA，两个样本的eccDNA均通过Circle-Seq方案进行纯化。经过柱层析分离后，未加质粒样本（GD）的DNA得率为1.27%（380 ng），添加质粒样本（GD+P）的得率为1.60%（480 ng）。通过PCR检测了外切酶处理29小时和72小时后的线性DNA含量，以评估处理效率。 ACT1 无样本含有扩增产物 ACT1 （数据未显示）。将每份经外切核酸酶处理的样品的一部分通过ø29进一步扩增 聚合酶及酶促反应产物通过碘化丙啶染色进行分析 (图5A-F）以及琼脂糖凝胶电泳（图 5G). 经核酸外切酶处理后的样品几乎不显示碘化丙啶染色（图5A-B）。ø29-仅含基因组DNA的扩增样本显示出丝状结构（图5C）与对照样品相似（图5E）。ø29-添加质粒后扩增的样本显示出焦点（图 5D）与质粒对照相似（图5F). 图像结果表明，ø29 DNA聚合酶对环状DNA的富集效果优于线状DNA。经过29小时的外切酶处理后，大部分线性染色体DNA已从样品中去除。图5A-B，G）。然而，需要超过100小时的 extensive 外切酶处理并使用超过100个单位的酶量，才能完全去除染色体线性DNA，如ø29所示-扩增后的样本在经过72小时外切酶处理后，仍显示出丝状结构的背景信号图5C-D).
<img alt="细胞培养与DNA分析流程；包含纯化、消化、扩增步骤的示意图" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. Circle-Seq方法的流程示意图。 该方案包含5个步骤：1）细胞培养，2）通过柱层析纯化和富集eccDNA，3）消化洗脱组分中残留的线性染色体DNA，4）利用ø29 DNA聚合酶扩增DNA，5）对高度富集的eccDNA进行测序并将读段比对至参考基因组 S. cerevisiae 参考基因组 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="连续读段与比对读段图；基因组测序分析中的数据可视化" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 连续读长 &gt; 1 kb 作为测序深度的函数。 1 × 10 的 eccDNA10 细胞数量随测序深度（以百万条比对上的读段计）的增加而增加。图示：来自单倍体 CEN.PK 的生物学三重复 S. cerevisiae 种群（C1、C2、C4）相隔1010 细胞分裂。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="比较2μ、rDNA、mtDNA以及质粒pBR322、pUC19、pUG72的测序读段覆盖百分比图" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 已知环状DNA元件的检测。（A-B）CEN.PK生物学重复样本C1、C2和C4中质粒测序读段覆盖度（读段密度）百分比的散点图。（A）比对到内源性酵母质粒的读段包括：2µ；[rDNAcircle]（来自染色体XII的核糖体RNA基因）；以及mtDNA（线粒体DNA）。（B）唯一比对到对照质粒的读段。对照质粒在柱纯化前被添加至样本中。每细胞中质粒比例为：pBR322（加号）1:1，pUC19（圆圈）1:50，以及pUG72（三角形）1:2,500。
<img alt="维恩图展示eccDNA研究中基因/质粒的重叠情况；突出显示实验差异性。" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. CEN.PK与S288c中的常见eccDNA元件 (A维恩图显示476个中的重叠部分 三个CEN.PK样品（C1、C2、C4）中294个eccDNA元件上的基因。标注了16个共同重叠的eccDNA基因/质粒（所有基因名称均以 数据集 1). (B三个CEN.PK样本（C1、C2、C4）中位于推定eccDNA上的所有记录基因与10个S288c样本（S1-S2、R1-R4、Z1-Z4）中位于推定eccDNA上的所有记录基因的维恩图（见参考文献）20显示的是13个生物学重复（S1-S2，R1-R4，Z1-Z4，C1-C3），包含在至少2种菌株背景以及3种或以上实验设置中重叠的基因/质粒和假定的eccDNA区域。C样本：CEN.PK；R和Z样本：S288c BY4741；S样本：S288c M3750。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="外切核酸酶DNA处理：显微镜图像、凝胶电泳、DNA消化数据分析" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 外切酶处理后DNA样品的可视化 ø29 次处理。 (A-F碘化丙啶染色DNA。比例尺， 10 µm. (A, C 和 E) 基因组DNA（GD）样品；（B 和 D含GD质粒（GD+P）的样品。A-B) 经29小时外切核酸酶处理（EXO 29 h）；(C-D) 经72小时外切核酸酶处理后，再进行ø29聚合酶扩增（EXO 72 h + ø29）。E) φ29 DNA聚合酶扩增后的基因组DNA对照； (F质粒对照（5.5 kb）后 29聚合酶扩增；（Gø) 琼脂糖凝胶电泳。从左至右：L，1 kb 标记物；P，质粒对照（5.5 kb）经 EXO 29 小时处理后；GD，经 EXO 29 小时处理后（样品同前） A）；GD+P，EXO处理29小时后（样品为 B）；GD 和 GD+P，经 EXO 29 小时 + ø29 处理后；GD 和 GD+P，经 EXO 72 小时 + ø29 处理后（样本同 C-D）。参见表 S1 如需更多详细信息。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="展示基因分析结果的 EcoDNA 映射表；以表格形式呈现数据。" src="/files/ftp_upload/54239/54239dataset1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Dataset 1"> 
数据集 1. CEN.PK 中潜在的 DNA 环化区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">请点击此处下载该文件。</a> 
显示了 348 个区域的序列数据及分析结果。A-D 列为 eccDNA 映射信息：A（最左侧第一列），鉴定出潜在 eccDNA 的样本；B，染色体；C-D，潜在 eccDNA 的起始和终止坐标。E-H 列为 eccDNA 内容信息：E，该区域内的自主复制序列（ARS）；F，该区域内的完整基因；G，该区域包含的部分基因；H，通过 BLASTN 鉴定的基因。I-O 列为 eccDNA 覆盖度和 p 值信息：I，具有唯一注释序列的最长区域（单位为 bp）；J，所有比对读段的数量；K，每百万比对读段中每千碱基片段的覆盖度（FPKM）；L，与蒙特卡洛模拟随机发生情况相比，潜在 eccDNA 的 p 值；M，唯一比对读段的数量；N-O，仅使用唯一比对读段计算的 FPKM（UFPKM）及相应的 p 值。读段比对和蒙特卡洛模拟的参数设置如文献20所述。

本文介绍了一种名为Circle-Seq的高灵敏度方法，用于纯化染色体外环状DNA（eccDNA）。该方法包括柱纯化、去除残留的线性染色体DNA、滚环扩增以及高通量测序。Circle-Seq适用于真核生物eccDNA的全基因组规模筛选，并可用于研究基因组不稳定性和拷贝数变异。

真核细胞中外染色体环状DNA的全基因组纯化

染色体外环状DNA（eccDNA）是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中常见的遗传元件，也在其他真核生物中被报道存在。eccDNA……

从真核细胞中全基因组范围纯化染色体外环状 DNA。大家好，我是 Rasmus。在这里，我将介绍环状 DNA 纯化方法的完整流程。在第一部分中，培养并收集酵母细胞。随后，通过三个步骤纯化并扩增环状DNA。第一步是柱层析分离，通过该步骤纯化并富集DNA环。然后，通过使用外切酶处理DNA，降解所有残留的线性DNA，最后利用phi-29 DNA聚合酶扩增DNA环。在本实验方案的第五部分，对DNA环进行测序，并将测序读长比对至酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）参考基因组。在本视频的最后，我们将展示一些代表性结果。我们将讨论该方法在今后研究中的应用前景及其优势。第一部分：细胞收获。将起始培养物在30°C条件下振荡培养至最大密度，约为每毫升2亿个细胞，通常在24至48小时内达到。将长好的培养物转移至Falcon管中，离心3分钟以收集沉淀。弃去上清液。将大沉淀在TE缓冲液中涡旋重悬，再次离心收集沉淀。第二部分，柱层析纯化。在此步骤中，我们使用一种市售的柱纯化试剂盒，可从细菌基因组DNA中获得高纯度的质粒。在将该试剂盒用于酵母之前，需要先破坏细胞壁。通过将洗涤后的细胞沉淀重悬于试剂盒中的L-1缓冲液中来进行此步骤。将细胞悬液转移至微量离心管中，并加入相当于总体积三分之一的玻璃珠。样品在最大转速下涡旋振荡10分钟，然后以2,000转/分钟离心30秒以去除玻璃珠。将上清液转移至新的离心管中。在本方法中，我们将高度稀释的质粒以三种不同的比例加入上清液中。我们建议将高度稀释的质粒纳入循环过程。这可作为内部参考指南。您可用其对DNA纯化和扩增进行质量检查，同时亦可通过这些外源添加的质粒对每个细胞中非环状DNA进行半定量估算。仅应添加高度稀释的质粒，因其会影响其他环状DNA的测序分辨率。将含有 spiked 质粒的细胞悬液用试剂盒中的 L-2 溶液处理，并按照试剂盒说明书进行操作。上柱后，通过两次洗涤去除蛋白质、脂质和染色体 DNA。附加体环状 DNA 在洗脱组分中得到高度富集。第三步，线性DNA消化。在此步骤中，我们使用外切核酸酶消化残留的线性DNA。一种依赖ATP的外切核酸酶可特异性地降解线性双链和单链DNA，而不会消化环状DNA。外切酶对线性DNA的特异性通过DNase处理29小时后的凝胶电泳得到证实。结果显示，基因组DNA被降解，而质粒DNA保持完整，如红箭头所示。酵母含有16条染色体，长度可达1,500千碱基。为了促进外切核酸酶消化，使用一种切割位点稀有的限制性内切酶，以获得更多的可及DNA末端。若使用基于Ate的限制性内切酶NotI，每条染色体最多可被切割七次，如图所示。将柱纯化的DNA在37摄氏度的加热块中用NotI处理过夜。按照生产商的方案，在56 °C下热失活NotI酶后，将已切割的DNA在37 °C下用外切核酸酶处理。外切核酸酶处理后，于70 °C加热失活酶30分钟。为确保所有线性染色体DNA被完全消化，可额外添加ATP和外切核酸酶，该消化过程可能需要数天时间。通过PCR或qPCR方法使用内参基因（如ACTI）对样品进行分析，以确认所有线性DNA均已彻底降解。第四部分，DNA 扩增。在此步骤中，我们使用 phi-29 聚合酶，通过随机六聚体寡核苷酸在 30 摄氏度下对环状 DNA 进行富集和扩增。该聚合酶具有高保真性和校对活性，可确保无偏倚的DNA扩增。通过滚环复制，每个聚合酶可合成长达100 kb的DNA。该聚合酶还具有高度的持续合成能力，可将DNA扩增至原始量的10⁹倍。第五部分，测序。按照高通量下一代测序平台的操作流程，将 DNA 超声打断至平均长度为 300 个碱基对，并进行 141 个核苷酸的单端测序。使用 Galaxy 免费数据库，将测序得到的读段比对至酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）参考基因组。测序数据上传至Galaxy平台后，使用允许部分读段比对的短读段比对工具Bowtie2进行读段比对。第六部分，代表性结果。完成测序并比对至酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）参考基因组后，可在Galaxy软件的基因组浏览器中可视化读段。例如，环状来源的DNA可被计为包含长度超过一千碱基连续读段的区域，如屏幕上所示。在四号染色体上存在一个这样的区域，其包含跨越超过一千碱基的连续读段，该区域含有己糖转运蛋白基因6和7。当在酵母细胞群体中使用此方法时，该位点常能检测到比对上的读段，且读段覆盖度明确提示在旁系同源的己糖转运蛋白基因之间形成了DNA环状结构。由于己糖转运蛋白基因之间具有高度的序列同源性，我们推测非法同源重组导致了该DNA的环化。环状DNA突变的模型发生在DNA修复过程不完全时。例如，如果在重复元件中发生双链断裂，则同一染色单体上的同源序列可作为同源重组介导的DNA修复的模板。在切除、链侵入、DNA合成以及所有中间结构解析完成后，DNA环可从基因组上环出，从而导致染色体上的DNA片段缺失。通过使用碘化丙啶染色，可以观察用外切核酸酶和phi-29 DNA聚合酶处理DNA后的效应。基因组DNA的染色对照如左图所示，而质粒DNA则如右图所示。经过外切酶处理基因组 DNA 29 小时后，400 纳克的 DNA 大部分已被消化，如左侧图像所示。右侧凝胶图像中的琼脂糖凝胶电泳结果证实了这一现象。经过 72 小时外切酶处理后，再由 phi-29 聚合酶进行扩增合成，仍可检测到数百万拷贝的 DNA。同样，在对400纳克基因组DNA以及额外添加的100纳克质粒DNA进行29小时的外切酶处理后，大部分基因组DNA被消化。然而，凝胶图像显示质粒DNA未被消化。在对经72小时外切酶处理的样品进行phi-29 DNA聚合酶处理后，扩增出的DNA大部分呈现为染色后的质粒条带。因此，我们首先对环状DNA的基因进行了筛选，结果惊讶地发现了数百种不同类型的DNA样本。的确，DNA环在酵母群体中如此普遍，令人十分意外，我们相信该方法可应用于多种类型的研究。显然，其中之一便是对人体组织进行分析。我们知道基因可以在环状结构元件上发生扩增，这在酵母中很常见，甚至在肿瘤细胞中也是如此。我认为，总体而言，研究体细胞并探究其中存在的环状DNA类型及其可能产生的影响将具有重要意义。在衰老细胞中，会随着年龄增长而积累环状DNA分子，我们预期将发现更多位于环状DNA上的基因。此外，我们还希望研究DNA环化的分子机制，一个显而易见的方向是利用酵母进行研究，因为我们拥有在同源重组方面存在缺陷的突变体，以及非同源末端连接相关的突变体。通过研究这些突变体，我们预期不同突变体的DNA环化特征会有所不同，而通过酵母研究，我们有望更深入地了解DNA环化的机制。因此，与其他方法相比，该方法的灵敏度要高得多，实际上可能能够在约每10,000个细胞中检测到一个DNA环。据我所知，来自长期开展的试验研究结果表明，突变等位基因通常必须达到群体中1%至10%的比例才能被检测到。而通过本技术，无需事先了解所形成的DNA环的具体信息，与那些必须对DNA环进行一定程度富集才能通过测序或染色体染色检测其扩增的技术不同。是的，我认为主要优势确实在于其灵敏度，我希望我们能够利用这一方法开展许多有趣的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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