真核细胞中外染色体环状DNA的全基因组纯化

从真核细胞中全基因组范围纯化染色体外环状 DNA。大家好，我是 Rasmus。在这里，我将介绍环状 DNA 纯化方法的完整流程。

在第一部分中，培养并收集酵母细胞。随后，通过三个步骤纯化并扩增环状DNA。第一步是柱层析分离，通过该步骤纯化并富集DNA环。

然后，通过使用外切酶处理DNA，降解所有残留的线性DNA，最后利用phi-29 DNA聚合酶扩增DNA环。在本实验方案的第五部分，对DNA环进行测序，并将测序读长比对至酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）参考基因组。在本视频的最后，我们将展示一些代表性结果。

我们将讨论该方法在今后研究中的应用前景及其优势。第一部分：细胞收获。将起始培养物在30°C条件下振荡培养至最大密度，约为每毫升2亿个细胞，通常在24至48小时内达到。

将长好的培养物转移至Falcon管中，离心3分钟以收集沉淀。弃去上清液。将大沉淀在TE缓冲液中涡旋重悬，再次离心收集沉淀。

第二部分，柱层析纯化。在此步骤中，我们使用一种市售的柱纯化试剂盒，可从细菌基因组DNA中获得高纯度的质粒。在将该试剂盒用于酵母之前，需要先破坏细胞壁。

通过将洗涤后的细胞沉淀重悬于试剂盒中的L-1缓冲液中来进行此步骤。将细胞悬液转移至微量离心管中，并加入相当于总体积三分之一的玻璃珠。样品在最大转速下涡旋振荡10分钟，然后以2,000转/分钟离心30秒以去除玻璃珠。

将上清液转移至新的离心管中。在本方法中，我们将高度稀释的质粒以三种不同的比例加入上清液中。我们建议将高度稀释的质粒纳入循环过程。

这可作为内部参考指南。您可用其对DNA纯化和扩增进行质量检查，同时亦可通过这些外源添加的质粒对每个细胞中非环状DNA进行半定量估算。仅应添加高度稀释的质粒，因其会影响其他环状DNA的测序分辨率。

将含有 spiked 质粒的细胞悬液用试剂盒中的 L-2 溶液处理，并按照试剂盒说明书进行操作。上柱后，通过两次洗涤去除蛋白质、脂质和染色体 DNA。附加体环状 DNA 在洗脱组分中得到高度富集。

第三步，线性DNA消化。在此步骤中，我们使用外切核酸酶消化残留的线性DNA。一种依赖ATP的外切核酸酶可特异性地降解线性双链和单链DNA，而不会消化环状DNA。

外切酶对线性DNA的特异性通过DNase处理29小时后的凝胶电泳得到证实。结果显示，基因组DNA被降解，而质粒DNA保持完整，如红箭头所示。酵母含有16条染色体，长度可达1,500千碱基。

为了促进外切核酸酶消化，使用一种切割位点稀有的限制性内切酶，以获得更多的可及DNA末端。若使用基于Ate的限制性内切酶NotI，每条染色体最多可被切割七次，如图所示。将柱纯化的DNA在37摄氏度的加热块中用NotI处理过夜。

按照生产商的方案，在56 °C下热失活NotI酶后，将已切割的DNA在37 °C下用外切核酸酶处理。外切核酸酶处理后，于70 °C加热失活酶30分钟。为确保所有线性染色体DNA被完全消化，可额外添加ATP和外切核酸酶，该消化过程可能需要数天时间。通过PCR或qPCR方法使用内参基因（如ACTI）对样品进行分析，以确认所有线性DNA均已彻底降解。

第四部分，DNA 扩增。在此步骤中，我们使用 phi-29 聚合酶，通过随机六聚体寡核苷酸在 30 摄氏度下对环状 DNA 进行富集和扩增。

该聚合酶具有高保真性和校对活性，可确保无偏倚的DNA扩增。通过滚环复制，每个聚合酶可合成长达100 kb的DNA。该聚合酶还具有高度的持续合成能力，可将DNA扩增至原始量的10⁹倍。

第五部分，测序。按照高通量下一代测序平台的操作流程，将 DNA 超声打断至平均长度为 300 个碱基对，并进行 141 个核苷酸的单端测序。使用 Galaxy 免费数据库，将测序得到的读段比对至酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）参考基因组。

测序数据上传至Galaxy平台后，使用允许部分读段比对的短读段比对工具Bowtie2进行读段比对。第六部分，代表性结果。完成测序并比对至酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）参考基因组后，可在Galaxy软件的基因组浏览器中可视化读段。

例如，环状来源的DNA可被计为包含长度超过一千碱基连续读段的区域，如屏幕上所示。在四号染色体上存在一个这样的区域，其包含跨越超过一千碱基的连续读段，该区域含有己糖转运蛋白基因6和7。当在酵母细胞群体中使用此方法时，该位点常能检测到比对上的读段，且读段覆盖度明确提示在旁系同源的己糖转运蛋白基因之间形成了DNA环状结构。

由于己糖转运蛋白基因之间具有高度的序列同源性，我们推测非法同源重组导致了该DNA的环化。环状DNA突变的模型发生在DNA修复过程不完全时。例如，如果在重复元件中发生双链断裂，则同一染色单体上的同源序列可作为同源重组介导的DNA修复的模板。

在切除、链侵入、DNA合成以及所有中间结构解析完成后，DNA环可从基因组上环出，从而导致染色体上的DNA片段缺失。通过使用碘化丙啶染色，可以观察用外切核酸酶和phi-29 DNA聚合酶处理DNA后的效应。基因组DNA的染色对照如左图所示，而质粒DNA则如右图所示。

经过外切酶处理基因组 DNA 29 小时后，400 纳克的 DNA 大部分已被消化，如左侧图像所示。右侧凝胶图像中的琼脂糖凝胶电泳结果证实了这一现象。经过 72 小时外切酶处理后，再由 phi-29 聚合酶进行扩增合成，仍可检测到数百万拷贝的 DNA。

同样，在对400纳克基因组DNA以及额外添加的100纳克质粒DNA进行29小时的外切酶处理后，大部分基因组DNA被消化。然而，凝胶图像显示质粒DNA未被消化。在对经72小时外切酶处理的样品进行phi-29 DNA聚合酶处理后，扩增出的DNA大部分呈现为染色后的质粒条带。

因此，我们首先对环状DNA的基因进行了筛选，结果惊讶地发现了数百种不同类型的DNA样本。的确，DNA环在酵母群体中如此普遍，令人十分意外，我们相信该方法可应用于多种类型的研究。显然，其中之一便是对人体组织进行分析。

我们知道基因可以在环状结构元件上发生扩增，这在酵母中很常见，甚至在肿瘤细胞中也是如此。我认为，总体而言，研究体细胞并探究其中存在的环状DNA类型及其可能产生的影响将具有重要意义。在衰老细胞中，会随着年龄增长而积累环状DNA分子，我们预期将发现更多位于环状DNA上的基因。

此外，我们还希望研究DNA环化的分子机制，一个显而易见的方向是利用酵母进行研究，因为我们拥有在同源重组方面存在缺陷的突变体，以及非同源末端连接相关的突变体。通过研究这些突变体，我们预期不同突变体的DNA环化特征会有所不同，而通过酵母研究，我们有望更深入地了解DNA环化的机制。因此，与其他方法相比，该方法的灵敏度要高得多，实际上可能能够在约每10,000个细胞中检测到一个DNA环。

据我所知，来自长期开展的试验研究结果表明，突变等位基因通常必须达到群体中1%至10%的比例才能被检测到。而通过本技术，无需事先了解所形成的DNA环的具体信息，与那些必须对DNA环进行一定程度富集才能通过测序或染色体染色检测其扩增的技术不同。

是的，我认为主要优势确实在于其灵敏度，我希望我们能够利用这一方法开展许多有趣的研究。