Name: 肾毒素显微注射斑马鱼到模型急性肾损伤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解利用斑马鱼显微注射肾毒素建立急性肾损伤模型的方法。该技术可实现细胞损伤与再生的实时成像，为研究肾脏毒性机制和开发肾保护策略提供重要工具。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 DP2OD008470 的支持。此外，RAM 还部分获得了圣母大学研究生院提供资金的支持。我们感谢圣母大学生物科学系、斑马鱼研究中心以及干细胞与再生医学中心工作人员的支持。我们特别感谢实验室成员就肾脏生物学问题进行的富有启发性的讨论，以及对本工作提供的有益反馈。

本方案中所述的斑马鱼胚胎操作程序已获得圣母大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>通过混合73.0 g NaCl、3.15 g KCl、9.15 g CaCl₂·2H₂O和4.85 g MgSO₄·7H₂O，用去离子水定容至1 L，配制E3胚胎培养基的50倍浓缩母液2，以及 9.95 g MgSO₄4 在5 L蒸馏水中溶解，并于室温保存。</li>
	<li>为培养斑马鱼胚胎，将50倍浓缩的E3胚胎培养基原液用蒸馏水稀释至1倍工作浓度，然后每1 L 1倍E3培养基中加入200 μl 0.05%亚甲蓝以发挥抑菌作用，室温保存。</li>
	<li>将40 ml的50倍浓缩E3培养基与0.06 mg 1-苯基-2-硫脲（PTU）混合，配制含0.003% PTU的E3胚胎培养基色素抑制溶液，再用蒸馏水定容至总体积2 L。</li>
	<li>在室温下将 E3/PTU 搅拌过夜，使 PTU 粉末充分溶解。随后将 E3/PTU 储存于室温条件下。 
	注意：E3/PTU 溶液的有效期约为一周，过期溶液在抑制斑马鱼幼鱼色素发育方面的效果会降低。</li>
	<li>将1 g Tricaine加入500 ml蒸馏水中，配制0.2%的Tricaine（MS-222）麻醉溶液，并用1 M Tris（pH 9.5）调节pH至7.2。</li>
	<li>准备制备用于成像的2%甲基纤维素溶液：取1x E3溶液（不含亚甲蓝），并加入1/10体积的溶液th 0.2% 三卡因溶液体积，在 4 °C 下加入。 
	注意：甲基纤维素溶液是一种浓稠的透明溶液，用于在显微观察时温和地固定活体胚胎。操作完成后，可通过在1x E3溶液中洗涤胚胎以溶解甲基纤维素，从而避免对胚胎造成损伤，并允许对同一标本在后续发育阶段继续进行显微观察。</li>
	<li>冷却至 4 °C 后，将 1x E3/Tricaine 溶液置于搅拌器上剧烈搅拌，同时逐渐加入适量的甲基纤维素粉末，并持续剧烈搅拌。应逐步将粉末加入溶液中，以防止形成不溶性的甲基纤维素聚集体。</li>
	<li>将所有粉末混入2%甲基纤维素/E3/三卡因溶液后，在4 °C冷藏室中搅拌复合溶液过夜。 
	注意：低温最有利于粉末完全溶解。若经过一个晚上后溶液仍未澄清，可继续搅拌一个工作日和/或再过夜一次。</li>
	<li>为去除2%甲基纤维素/E3/三卡因溶液中的气泡，将混合液分装至1.5 ml离心管中，在4 °C以高速（12,000 × g）离心30分钟至2小时。</li>
	<li>将2%甲基纤维素/E3/Tricaine溶液置于4 °C下长期保存。 
	注意：使用前，应将分装样品预热至室温，以便用于斑马鱼样本操作。</li>
</ol>
2. 工具的准备
<ol>
	<li>通过在5&#34;直头解剖针末端安装一个加样枪头，并用胶带或超级胶水固定，制备用于在显微注射过程中定位胚胎的胚胎操作工具。</li>
	<li>使用拉针仪制备显微注射针：首先将一根经火焰抛光的10 cm带 filament 的硼硅酸盐玻璃毛细管放入仪器中，并通过拧紧手柄固定玻璃管。</li>
	<li>拉制硼硅酸盐玻璃管以形成细锥形的注射针。使用以下参数：加热温度540，拉力245，速度200，时间125。</li>
	<li>将制好的注射针置于培养皿内，将其悬置于一条雕塑粘土条上以保护针尖，并保持培养皿加盖，防止灰尘积聚。</li>
	<li>为完成显微注射针的制备，使用剃须刀片或精细镊子的边缘切割拉制后的针端，形成尖锐且具一定角度的注射尖端，其直径约为0.05–0.1 mm。</li>
	<li>制备显微注射用培养皿时，先在100 ml锥形瓶中配制1.5%琼脂糖/E3溶液，将E3溶液在微波炉中加热至沸腾以溶解琼脂糖，随后于室温冷却约10分钟。</li>
	<li>将冷却后的琼脂糖/E3溶液倒入培养皿中，形成厚度约为0.5 cm的底层；待其凝固后，再倒入第二层，厚度约为0.3 cm，插入预制的胚胎孔模具，并在室温下静置使其完全凝固。 
	注意：将模具插入上层琼脂糖/E3时，应以倾斜角度放入，以减少气泡产生。</li>
	<li>当整个显微注射培养皿完全凝固后，使用刮勺缓慢而小心地将预制的胚胎孔模具取出，然后向培养皿中加入E3溶液，并于4 °C保存。</li>
</ol>
3. 胚胎制备
<ol>
	<li>通过在交配室中放置隔板并加入系统用水，设置斑马鱼交配缸。</li>
	<li>在隔板两侧各放置一条鱼，使每个交配室包含一条雌鱼和一条雄鱼，并盖上交配室盖子。</li>
	<li>次日早晨，移除隔板以允许产卵。</li>
	<li>约30分钟后检查鱼类，将成鱼返回水族箱后，通过细金属网筛工具过滤交配缸中的水来收集胚胎。</li>
	<li>将筛子倒置在培养皿上方，用E3培养基冲洗以收集胚胎。</li>
	<li>在28.5 °C条件下过夜孵育胚胎。</li>
	<li>当胚胎发育至24–26体节期26时，倾去大部分E3培养基，然后向每皿胚胎中加入100 µl浓度为50 mg/ml的蛋白酶（pronase），在室温（23 °C）孵育约15分钟以去除卵膜。 
	注：若按照上述方法收集胚胎并在28.5 °C过夜孵育，则从受精开始约需24–25小时胚胎方可达到24–26体节期。</li>
	<li>向培养皿中加入E3培养基，轻轻旋转以使卵膜从胚胎上脱落。</li>
	<li>倾去E3/蛋白酶溶液，用25 ml新鲜E3培养基冲洗培养皿。重复冲洗步骤以彻底去除所有蛋白酶。</li>
	<li>为抑制色素发育，当胚胎达到受精后24小时时，倾去E3培养基，并更换为25 ml新鲜E3/PTU培养基。 
	注：对于持续数天的实验，应每天更换一次E3/PTU溶液，使用新鲜培养基以保持培养皿清洁。</li>
</ol>
4. 肾毒素溶液的显微注射
<ol>
	<li>注射当天，配制所需肾毒素溶液及相应的溶剂对照。</li>
	<li>涡旋或轻轻混匀，确保药物完全溶解，检查管壁及水柱顶部是否有未溶解物。 
	注意：肾毒素溶液中可加入微量荧光标记的葡聚糖，用于监测显微注射效率，并在后续时间点评估肾脏清除能力20,28。</li>
	<li>使用剪裁过的显微注射针，通过将细小的凝胶上样枪头插入针尾，吸入约 2–3 µl 肾毒素溶液，并用胶带将针垂直固定，使溶液在重力作用下充满针尖。</li>
	<li>待针尖充满后，将装有溶液的注射针固定于显微操作仪上。</li>
	<li>在微米尺载玻片上滴加一滴矿物油，进行试注射以评估液滴大小，从而校准注射体积。500 pl 的注射液滴直径为 0.1 mm。</li>
	<li>从培养箱中取出胚胎培养皿，加入约 5 ml 的 0.2% 三卡因（Tricaine）对胚胎进行麻醉。</li>
	<li>为确认麻醉完全，可用胚胎操作工具轻触胚胎，若无运动反应，则表明麻醉充分。</li>
	<li>成功麻醉后，用移液器将胚胎转移至注射模具中。</li>
	<li>将每个胚胎调整至模具的不同孔中，使头部位于孔的最深处，躯干沿凹槽平放，尾部则伸出凹槽之外。</li>
	<li>将装有溶液的注射针插入显微操作仪，并将针尖移至胚胎旁。</li>
	<li>向前推动操纵杆，将针轻轻插入尾部血管，同时踩下脚踏开关完成显微注射。 
	注意：可通过观察液体进入循环系统来判断注射是否成功。此外，在肾毒性物质中共同注射荧光标记的葡聚糖，可使研究人员在操作后验证注射是否成功。</li>
	<li>轻轻向后拉动操纵杆，将针从胚胎中退出。</li>
	<li>注射完成后，将胚胎转移至洁净培养皿中，用新鲜 E3/PTU 溶液冲洗以去除三卡因。</li>
	<li>将胚胎继续培养至所需时间点，以评估形态学变化。形态学结果可通过甲基纤维素封片介质中拍照记录，或根据需要进行后续实验分析。 
	注意：应评估胚胎的恢复情况，统计出现水肿的个体比例，水肿通常提示存在肾脏损伤。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

多种治疗药物均与急性肾损伤（AKI）相关29。目前在理解许多单一化合物所诱导的肾损伤方面已取得显著研究进展，例如氨基糖苷类抗生素庆大霉素30以及广泛使用的化疗药物顺铂31,32。然而，这些疾病过程中涉及的一些病理变化仍处于持续研究之中。当前一个新兴的挑战在于理解多种药物如何对患者产生不利影响，尤其是重症监护环境中的患者和老年人等高风险人群29。因此，能够进一步开展基于细胞的药物诱导AKI效应研究的模型，在提高该疾病检出率以及深入认识药物间动态相互作用方面具有重要作用。
利用小鼠和大鼠等哺乳动物模型在建立急性肾损伤（AKI）后肾脏细胞变化的研究中发挥了重要作用，但这些模型存在一个局限性：由于肾脏结构复杂且位于体内深处，难以进行直接的实时观察。简而言之，肾脏无法直接被观察，因此必须通过处死实验个体来分析肾脏。这一限制可通过使用斑马鱼胚胎加以克服，斑马鱼可形成由两个肾单位组成的简单肾脏，其肾单位具有与其他脊椎动物（包括人类）保守的节段结构33。斑马鱼的发育在体外（ex u...

急性肾损伤（AKI）是一种肾功能突然丧失的疾病，可能导致严重的健康后果1。由于其在住院患者中的发病率高达约20%，在重症监护和老年患者中更达到30-50%，且死亡率高达50-70%，AKI已成为全球范围内重要的医疗健康问题1-3。不幸的是，AKI的患病率正在不断上升，预计在未来十年内将进一步加剧，部分原因在于可诱发AKI的因素多种多样，包括术后应激、缺血以及接触抗生素和化疗药物等肾毒性物质4。
急性肾损伤（AKI）涉及肾脏内突然发生的细胞损伤，通常发生在肾单位中，肾单位是肾脏的基本功能单位，由一个血液滤过器和一段分节的肾小管组成，后者将尿液引流至中央集合管1。当AKI期间大量肾单位受损时，立即产生的效应包括血液循环中废物清除受阻，以及由于死亡和濒死细胞造成的阻塞，导致流经肾单位的液体减少或完全中断1。随着时间推移，肾小管阻塞可导致整个肾单位退化，从而永久性地降低肾功能1。AKI后肾脏的生理改变还涉及复杂的炎症反应，可能引发慢性瘢痕形成1。
尽管存在这些结果，肾单位在急性肾损伤（AKI）后仍具备一定的再生能力，可重建肾小管上皮5,6。尽管人们对肾单位再生的分子机制的理解日益深入，但在许多方面其机制仍不明确，需要进一步研究7。急性肾损伤导致永久性肾损害的程度也尚不清楚。目前的研究表明，肾脏的再生潜能于较轻度的AKI后最高，而更严重或反复发作的AKI则会导致慢性肾脏病（CKD），并最终发展为需要进行挽救生命的移植或透析治疗的终末期肾病（ESRD）8,9。此外，已患有慢性肾脏病（CKD）的个体发生严重AKI的风险更高8,9。综上所述，持续开展基础和临床研究对于理解、治疗和预防急性肾损伤（AKI）至关重要。
利用动物模型开展的研究对于认识急性肾损伤（AKI）过程中局部和环境变化的进展具有重要作用10。为了进一步加深这一理解并开发新的治疗方法，斑马鱼动物模型已被广泛应用于多种研究中11,12。斑马鱼肾脏中的肾单位，无论是在胚胎期还是成体阶段，均与哺乳动物具有高度的保守性13-16。此外，斑马鱼肾单位上皮细胞的损伤过程与高等脊椎动物相似，即肾小管细胞的局部破坏之后，伴随发生管腔内细胞增殖并重建肾单位结构17-19。然而，在胚胎期，由顺铂等肾毒性物质引起的严重小管损伤常导致死亡20,21。相比之下，成体斑马鱼在经历急性肾损伤后能够存活，并在肾脏中表现出显著的再生能力。例如，在暴露于氨基糖苷类抗生素庆大霉素后，斑马鱼不仅能够修复肾小管上皮损伤，还能生成新的肾单位22-24。尽管这些由庆大霉素诱导的急性肾损伤研究提供了宝贵的信息，但理解不同肾毒性物质引起的肾脏损伤仍至关重要，以全面认识不同类型损伤的影响及其应答机制25。
斑马鱼胚胎因其体型小、通体透明且遗传操作简便，在肾毒性研究中具有诸多优势25，其中常采用显微注射方法20,21来递送待研究的分子。肾单位在受精后24小时（hpf）内形成，并于约48 hpf时开始过滤血液26,27。因此，胚胎肾脏的快速发育和功能建立为实验分析提供了便利。然而，显微注射过程存在一定的技术难点，掌握该技术可能需要较陡峭的学习曲线。在本视频文章中，我们介绍如何进行显微注射操作，并提供故障排除建议，以提高注射成功率。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-苯基硫脲（PTU）</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>乙基-3-氨基苯甲酸酯（Tricaine）</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 一次性培养皿，无菌，Corning：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm × 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;（显微注射托盘）150 mm × 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>低温培养箱</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖镊</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>千分尺</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼肾毒素显微注射建立急性肾损伤模型

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

肾脏易受到其从血液中过滤的化学物质的损害，这可能导致器官损伤，伴随肾功能迅速下降，并引发称为急性肾损伤（AKI）的临床综合征。用于治疗从细菌感染到癌症等多种疾病的药物，无论单独使用或与其他药物联用，均可能诱发AKI。斑马鱼是研究化学物质对肾功能影响的有用动物模型。 体内，因为它们会形成由肾单位功能单元组成的胚胎肾脏，这些结构在包括人类在内的高等脊椎动物中具有保守性。此外，斑马鱼可用于开展遗传学和化学筛选，有助于揭示急性肾损伤（AKI）的细胞与分子机制，并推动治疗策略的开发，例如鉴定具有肾保护作用的分子。本文中，我们展示了如何将显微注射技术应用于斑马鱼胚胎，作为研究肾毒素作用的范式。

显微注射工作站的设置包括体视显微镜、显微操作器和压力调节器图1A）。建议在操作过程中使用透射照明观察注射板上的样本（图1B）。注射针的制备包括拉制合适的硼硅酸盐玻璃毛细管，随后通过切割处理针尖，并最终进行后装填。理想情况下，针尖应为斜面，而非平头。图1C一种在切割过程中通过将切割器械（如精细镊子）的边缘以锐角倾斜而形成的切口 (图1D）。这个斜面边缘非常关键，会极大影响将针头轻柔插入斑马鱼的能力。
注射当天，使用坚固且柔韧的胚胎操作工具对胚胎进行定位（图1E）。进行注射时，应移动胚胎，使其躯干沿注射托盘侧边放置，以便为后续注射步骤提供支点（图1F）。注射过程中，应将观察平面聚焦于胚胎躯干，以看清针头插入的血管目标位置，...

由肾毒性物质（包括从抗生素到化疗药物等多种药物）引起的肾脏损伤可导致复杂的疾病，其发病机制尚未完全阐明。本方案展示了如何利用斑马鱼对这些疾病进行建模，进而用于筛选和鉴定具有肾保护作用的干预措施。

肾脏易受到其从血液中过滤的化学物质的损害，这可能导致与快速……相关的器官损伤

本实验方案的总体目标是利用斑马鱼观察肾毒性物质（如庆大霉素或顺铂）对急性肾损伤的建模效果。该技术的主要优势在于，斑马鱼模型能够实现对急性肾损伤后细胞损伤及再生过程的实时成像。开始操作前，需准备胚胎操作工具：将凝胶上样枪头连接至5英寸直型解剖针末端，并用胶带或超级胶水固定，用于在显微注射过程中定位胚胎。接下来，使用移液管拉制仪拉制含丝硼硅酸盐玻璃毛细管，制备若干细长锥形的显微注射针。然后，用剃刀刀片或精细镊子的边缘切割针尖，以形成尖锐有角度的注射尖端。随后，将注射针放置在培养皿中的一条建模黏土上，以保护针尖。制备显微注射托盘时，取100毫升锥形瓶，加入E3溶液配制1.5%琼脂糖溶液，并用微波炉溶解琼脂糖。随后，将混合液在室温下冷却约十分钟。将冷却后的琼脂糖E3溶液倒入培养皿中，制成厚度约为0.5厘米的基底。凝固后，倒入第二层琼脂糖E3溶液。然后以一定角度将预先制备的胚胎孔模具插入琼脂中，以避免产生气泡，并在室温下让琼脂糖完全凝固。待整个显微注射托盘成型后，缓慢而小心地取出预先制备的胚胎孔模具，随后向培养皿中加入E3溶液，并在4摄氏度下保存。在此步骤中，通过将隔离板放入交配室并加入系统用水，设置斑马鱼交配装置。随后，在隔离板两侧各放入一条鱼，使每个交配室中包含一条雌鱼和一条雄鱼，并覆盖两个交配室。次日清晨，移除隔离板以允许产卵。大约30分钟后，检查鱼缸底部是否有胚胎。然后将鱼放回水族箱，并通过细金属网筛工具过滤交配缸中的水来收集胚胎。接着，将筛子倒置在培养皿上方，用E3溶液冲洗筛子以收集胚胎。随后，将胚胎在28.5摄氏度下孵育过夜。当胚胎发育至24到26体节期时，倒掉大部分E3培养基。然后进行脱膜处理：向每皿胚胎中加入E3培养基和100 µL浓度为50 mg/mL的蛋白酶，于28摄氏度孵育15分钟。孵育15分钟后，加入E3培养基，轻轻摇晃以使胚胎脱去卵膜。随后倒掉含蛋白酶的E3培养基，并用25毫升新鲜E3培养基冲洗培养皿。为了抑制色素发育，在受精后24小时用25毫升含苯硫脲（PTU）的新鲜E3培养基替换原有E3培养基。对于持续数天的实验，每天更换一次E3 PTU培养基，以保持培养皿清洁。注射当天，使用适当的载体对照液配制所需浓度的肾毒素溶液，涡旋或轻轻混匀。随后检查管壁及水柱表面，确保药物已完全溶解于溶液中。将微量注射针的针尖剪短后，通过将细小的凝胶上样枪头插入针尾，装入两到三微升肾毒素溶液，并用胶带将针垂直悬挂，使溶液在重力作用下充满剪短的针尖。待针尖充满后，将装有溶液的注射针固定至显微操作仪上。通过在微米尺载玻片上滴加一滴矿物油，并向油滴中注射液体以评估液滴大小，从而检测微量注射体积。接下来，将培养皿中的胚胎从培养箱中取出，并通过向胚胎培养皿中加入 5 毫升 0.2% 三卡因（tricaine）对胚胎进行麻醉。随后，用移液器将胚胎转移至注射模具中。将每个胚胎

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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成年斑马鱼肾脏肾单位组成与功能分析

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通过庆大霉素诱导损伤实现成年斑马鱼的肾脏再生

本研究提出了一种利用肾脏GFP转基因斑马鱼建立的新型体内节段性肾损伤模型。该模型可诱导靶向性肾上皮细胞消融，用于展示肾单位损伤与修复的细胞机制。...

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顺铂诱导的成年斑马鱼急性肾损伤模型

本文中，我们展示了一种在成年斑马鱼中进行造血干细胞移植（HCT）的方法。...

成年斑马鱼全肾髓移植

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斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

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显微注射斑马鱼胚胎以分析基因功能

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