Name: 对污水处理工艺的疗效评估利用化学和生态毒理学方法的电池，以消除雌激素潜能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 了解利用化学分析与生态毒理学方法评估污水处理工艺对雌激素类内分泌干扰物的去除效果。该技术可检测低浓度污染物，为环境工程中选择最佳处理工艺提供依据，有效保护水生生态系统。

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本文介绍的项目由塞文特伦特水务公司和伦敦布鲁内尔大学资助。作者感谢艾伦·亨肖和约翰·丘奇利提供野外和实验室协助。T.J.C. 感谢海因兹基金会的支持。M.R.M. 感谢斯坦布伦纳研究所提供的斯坦布伦纳博士奖学金以及卡内基梅隆大学提供的校长奖学金。

<ol><li>Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-science+of+endocrine+disrupting+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals.</a> Toxicol. Lett. 211, (2012).</li>
<li>Rodgers-Gray, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+juvenile+roach+%28Rutilus+rutilus%29+to+treated+sewage+effluent+induces+dose-dependent+and+persistent+disruption+in+gonadal+duct+development%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development.</a> Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).</li>
<li>Jobling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sexual+maturation+and+gamete+production+in+wild+roach+%28Rutilus+rutilus%29+living+in+rivers+that+receive+treated+sewage+effluents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+reprod%22%5BJournal%5D)">Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents.</a> Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).</li>
<li>Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+vitellogenin%2C+a+biomarker+for+exposure+to+oestrogenic+chemicals%2C+in+a+wide+variety+of+cyprinid+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%2C+Biochem.+Syst.+Environ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish.</a> J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).</li>
<li>Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+sexual+disruption+in+wild+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Widespread sexual disruption in wild fish.</a> Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).</li>
<li>Jobling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted+exposures+to+steroid+estrogens+in+U.K.+rivers+correlate+with+widespread+sexual+disruption+in+wild+fish+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations.</a> Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).</li>
<li>Baynes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+treatment+of+wastewater+reduces+endocrine+disruption+in+wild+fish+-+a+comparative+study+of+tertiary+and+advanced+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).</li>
<li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+surfactants+and+some+of+their+degradation+products+assessed+using+a+recombinant+yeast+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).</li>
<li>Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disrupting+activities+in+sewage+effluent+and+river+water+determined+by+chemical+analysis+and+in+vitro+assay+in+the+context+of+granular+activated+carbon+upgrade%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade.</a> Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+determination+of+steroid+oestrogens+in+waters+using+chromatography+and+mass+spectrometry+%282008%29+Methods+for+the+Examination+of+Waters+and+Associated+Materials%22">The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials</a>. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).</li>
<li>Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+in+vitro%2Fin+vivo+estrogenic+potencies+of+17beta-estradiol%2C+estrone%2C+17alpha-ethynylestradiol+and+of+17beta-estradiol%2C+estrone%2C+17alpha-ethynylestradiol+and+nonylphenol%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol.</a> Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).</li>
<li>Mills, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+ecotoxicity+of+17%CE%B1-ethinylestradiol+using+TAML%2Fperoxide+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment.</a> Sci. Rep. 5, 10511(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+14962%3A2006+Water+quality+-+Guidance+on+the+scope+and+selection+of+fish+sampling+methods%22">EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods</a>. , British Standards Institute. London, UK. (2006).</li>
<li>Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+tropical+fish+food+can+alter+baseline+vitellogenin+concentrations+in+male+fathead+minnow+%28Pimephales+promelas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas).</a> Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).</li>
<li>Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histological+description+of+intersexuality+in+the+roach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">A histological description of intersexuality in the roach.</a> J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).</li>
<li>Dascenzo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+natural+estrogen+conjugates+in+municipal+sewage+transport+and+treatment+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities.</a> Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).</li>
<li>Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+natural+and+synthetic+steroid+estrogens+and+their+conjugates+in+aqueous+matrices+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).</li>
<li>Metcalfe, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+potency+of+chemicals+detected+in+sewage+treatment+plant+effluents+as+determined+by+in+vivo+assays+with+Japanese+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes).</a> Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).</li>
<li>Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozonation+and+activated+carbon+treatment+of+sewage+effluents%3A+Removal+of+endocrine+activity+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity.</a> Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).</li>
<li>Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted-no-effect+concentrations+for+the+steroid+estrogens+estrone%2C+17%CE%B2-estradiol%2C+estriol%2C+and+17%CE%B1-ethinylestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).</li>
<li>Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+hazardous+chemicals+in+wastewater+treatment+works+effluents%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents.</a> Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).</li>
<li>Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+advanced+treatments+of+wastewater+effluents+on+estrogenic+and+reproductive+health+impacts+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).</li>
<li>Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+effluent+toxicity+assessment+at+a+wastewater+treatment+plant+upgraded+with+a+full-scale+post-ozonation+using+aquatic+key+species%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species.</a> Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAML+oxidant+activators%3A+a+new+approach+to+the+activation+of+hydrogen+peroxide+for+environmentally+significant+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems.</a> Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+Ligands+for+Oxidizing+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Designing Ligands for Oxidizing Complexes.</a> Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).</li>
<li>Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Assays+as+Developmental+Toxicity+Indicators+in+The+Design+of+TAML+Oxidation+Catalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts.</a> Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).</li>
<li>Murk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+estrogenic+potency+in+wastewater+and+surface+water+with+three+in+vitro+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays.</a> Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).</li>
<li>Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>Kolle, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+house+validation+of+recombinant+yeast+estrogen+and+androgen+receptor+agonist+and+antagonist+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays.</a> Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).</li>
<li>Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transient+expression+assay+for+detecting+environmental+oestrogens+in+zebrafish+and+medaka+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos.</a> BMC Biotechnology. 12, 32(2012).</li>
<li>Brian, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+prediction+of+the+response+of+freshwater+fish+to+a+mixture+of+estrogenic+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals.</a> Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).</li>
<li>Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

污水处理厂是内分泌干扰物（EDC）进入地表水环境的主要途径。评估常规、高级或新兴处理工艺对内分泌活性去除效果的有效性，需要采用多种化学和生物检测方法。利用非靶向和靶向分析进行化学分析，可提供针对单个组分去除效果的定性或定量数据，从而能够根据环境质量标准或所分析化合物及其混合物的预测无效应浓度进行评估。
物质经处理后因矿化不完全而产生转化产物，以及废水中存在未知的生物活性组分，这些因素限制了单纯化学检测的适用性。体内和体外生物测定方法结合分析化学筛查，为评估新兴废水处理工艺对内分泌干扰物（EDC）去除效果提供了一套有效的工具。当这些检测与传统的水质参数以及其他毒理学和微生物学终点指标结合进行时，可对现有及新兴的废水处理技术进行关键性评价。
需要注意的是，基于酵母的雌激素检测方法（例如，YES）并非唯一用于测定化学品和废水中雌激素活性的体外检测手段。目前已开发出多种稳定转染的哺乳动物细胞检测方法，例如分别使用人乳腺癌细胞或宫颈肿瘤细胞的ER-CALUX27和hERα-HeLa-990328。YES已与类似的基于哺乳动物细胞的检测方法进行了比较，结果表明其在重复性、真正阳性及真正阴性雌激素识别率方面均具有相当高的水平29，尽管有时被认为灵敏度略低27。基于酵母的报告基因检测方法的一个优势在于，对于缺乏哺乳动物细胞培养丰富经验的实验室而言，YES更容易被采用，因其对生物安全控制措施和无菌操作技术的要求较低（如有需要，YES可在实验台面上进行）。而基于人源细胞的检测则需要CO2培养箱和化学发光检测仪，相比之下，YES仅需使用常规培养箱和微孔板读数仪。目前，两种基于酵母的雌激素报告基因检测方法（YES，Saccharomyces cerevisiae；A-YES，Arxula adeninivorans）正在开展多实验室联合验证试验，以支持ISO 19040标准&#34;水质—水和废水中雌激素潜力的测定&#34;的制定，这凸显了工业界对这些技术的关注。
所述方法存在若干局限性，包括采样、样品储存和分析过程中可能受到来自野外或实验室环境中的雌激素类物质污染，或人为污染（例如，增塑剂、表面活性剂、个人护理产品）。此类污染在酵母雌激素筛查（YES）实验（或其他基于细胞的报告基因实验）中会提高背景信号，影响实验的准确性。储存于塑料瓶中的水样或溶剂极易导致假阳性结果。假阴性结果同样值得关注，因为液相色谱-串联质谱法（LCMS/MS）和YES实验均需通过固相萃取（SPE）将雌激素浓缩至可检测水平。基质成分、SPE吸附剂的选择以及洗脱溶剂均会影响萃取效率及洗脱化合物的种类。采用本方案所述条件使用C18固相萃取小柱进行萃取时，可能会产生负偏差，因为高极性或碱性化合物在该吸附剂上的保留能力较弱。此外，本方案要求在氮气下将甲醇洗脱液完全蒸发后再用乙醇重新溶解，此过程会导致挥发性化合物的损失，从而可能低估待测样品的雌激素活性。当使用YES实验时，这些局限性尤为重要，因为未知或未预期的化合物可能因未被有效萃取或在蒸发过程中损失而被遗漏。此外，LCMS/MS技术可通过使用标记的内标校正回收率，而该方法无法应用于YES实验。
显著局限性 在 活体测试排放物相较于其他方法具有成本高、评估耗时长的特点 体外 方法。目前，利用鱼类胚胎检测雌激素活性的应用仍有限。然而，已有成功案例报道，通过构建对雌激素响应的转基因发光鱼类胚胎来实现检测30，具有潜在的应用前景。本方案所用的肥头鲦鱼是常见的实验室物种，雄性鱼类中卵黄原蛋白（VTG）的诱导是雌激素暴露的明确生物标志物，也是衡量废水中雌激素活性的可量化指标。22 或其他雌激素类化合物或混合物31经济合作与发展组织（OECD）内分泌干扰物测试指南已采用成年黑头软口鲦鱼、日本青鳉和斑马鱼进行验证32,33，其中VTG是这三种物种中雌激素暴露的敏感生物标志物。然而，VTG的诱导并不能直接反映繁殖功能受损，因此无法准确体现废水暴露所导致的生态后果，如在严重发生性反转的雅罗鱼中所观察到的情况3另一方面，由于罗非鱼体型较大、世代周期较长（2-3年才能达到性成熟）、繁殖方式为每年一次的群体产卵，以及在非产卵季节难以区分雌雄个体，因此并非生态毒理学研究中的经典“模式实验室物种”。然而，该物种在英国已得到广泛研究，原因是在雌激素类废水排放口下游，研究人员发现雄性鱼类的内分泌系统出现了紊乱例如，血液中存在雌性特异性卵黄原蛋白）以及组织病理学检查（卵睾体——睾丸中发育中的卵子和/或雌性生殖道）5,6因此，作为这些方案的未来应用，拟鲤（或类似物种）可作为一种有用的野生指示物种，用于检测接受深度处理出水的河流中是否真正改善了废水水质（并降低了雌激素活性）。它们还可用于末端管道系统，以监测中试规模处理设施经技术改进后的出水情况。7在考虑使用哪种物种时 体内 废水评估中，使用实验室物种进行相对较快且受控的测试，与使用本地物种进行耗时较长但环境相关性更高的实地测试之间存在权衡。然而，此类 体内 评估成本较高，应仅在化学分析评估之后作为最终测试手段来考虑 体外 检测方法
在所述方案中的关键步骤包括样品和玻璃器皿（即 瓶子和采样设备应预先使用适当的表面活性清洁剂处理）的制备与操作，以避免环境污染物对样品造成污染，包括尽量减少样品与塑料及其他可能产生假阳性结果的材料的接触。在设计和构建水族箱及鱼类暴露系统时，这一点同样重要。理想情况下，用于饲养种群和暴露实验的水族箱应采用吸附性低32、污染风险最小的材料制造。不锈钢可用于排放液或储水罐；而玻璃材质的水箱则更适合作为鱼类养殖箱（同时也便于观察鱼类）。应避免使用低等级的塑料管道或管路32，若必须使用聚氯乙烯（PVC）34 或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS），则需“充分预处理”，即 在使用前用流动的稀释水浸泡至少12小时，以充分沥滤出可能存在的污染物。在本机构中，医用级硅胶管已成功用于蠕动泵向水箱输送化学物质以及废水/稀释水。除了需考虑水生系统的构建和运行过程中可能引入的雌激素类污染外，还必须关注鱼类的饲料问题；许多市售鱼类饲料已被发现具有雌激素活性。因此，在此类研究中使用任何饲料之前，必须先检测其活性（例如，通过酵母雌激素筛查法，参见 Beresford et al.14）。
若在分析过程中同时检测质量保证样品，包括多个运输空白、实验室空白和溶剂空白，以及阳性对照和实际样品，则可简化对所述化学分析或YES检测方案的故障排查，从而消除假阳性与假阴性结果。阳性（例如，EE2）以及阴性对照（仅稀释水）也应始终使用于实验中 体内 用于确认预期生物标志物或终点指标敏感性的检测方法（即，VTG 或组织病理学），并能够检测到任何意外的污染（例如， 从实验设置、饮食或稀释用水等方面进行的任何修改，在开展任何研究之前都应经过验证。
随着对通过污水处理厂出水进入环境的雌激素类化合物实施更严格的监管，有必要开发更高效的城市污水处理技术。本论文所述的这一系列测试方法可作为对污水处理厂出水常规开展的生态毒理学和化学评估测试的补充。因此，未来应用此类综合性测试体系将有助于污水处理技术研发人员和运营人员采用生态上最安全的设计方案，以有效去除特定的受监管雌激素类化学物质以及整体生物活性。

关于内分泌干扰物对野生动物生殖健康的不良影响的担忧，已促使欧盟根据《水框架指令》（WFD）将两种雌激素物质（雌二醇和乙炔雌二醇）列入&#34;监测清单&#34;。内分泌干扰物涵盖多种化学类别，包括天然和合成类固醇雌激素、药物、农药、工业化学品以及消费品中的成分，这些物质已被证实对野生动物具有不良影响。其中一些化合物可能对人类健康产生潜在影响1。
研究表明，污水处理厂（WWTP）的出水对鱼类具有雌激素活性2，因此许多受纳水体也对鱼类表现出雌激素效应3。这一现象最早通过英国全国性调查得以证实，调查发现野生雄性鱼类血液中卵黄原蛋白浓度升高（一种雌性特异的卵黄蛋白前体4），并且在正常情况下为雌雄异体的鱼类物种中，普遍存在间性现象（即雄性鱼类的睾丸中出现卵子发育和/或雌性生殖导管）5,6。
传统的污水处理通常是一个三阶段过程，包括初步筛滤，随后进行一级和二级处理，以去除溶解性和悬浮性有机物。对每种内分泌干扰物（EDC）的去除效果取决于物质的理化性质以及所采用处理工艺的有效性。对于许多内分泌干扰物而言，通过吸附和生物降解可实现显著但不完全的去除。三级处理（如砂滤）可有效提高内分泌干扰物的去除率7，而采用高级氧化技术（例如臭氧）或活性炭的深度处理则可实现接近完全的去除7。
评估任何用于废水处理的新技术时，都需要确定该工艺在去除内分泌干扰物（EDC）方面的有效性。一系列测试包括目标化学分析以及利用生态毒理学测试 体内 和 体外 生物测定法为此目的提供了全面的数据。尽管靶向化学分析在监管方面非常有用，但仅能提供有关被监测化合物（及特定代谢物）的数据。生物测定法还可额外允许 &#34;检测&#34; 代谢物及治疗过程中产生的废水中转化副产物的不良影响，若不加以检测则可能被忽视8,9本文描述了采用一系列化学和生态毒性实验室检测方法，评估多种先进及新兴污水处理工艺在去除原污水、处理后污水及受纳水体中雌激素活性效力方面的效果。

<table><tbody><tr><td>Wellwash Versa 洗板机</td><td>Thermo Scientific</td><td>5165010</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 340PC</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert</td><td>INB 400</td><td>鲤鱼检测需在 37 &amp;#176;C 下孵育</td></tr><tr><td>Fisherbrand 漩涡混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>13214789</td><td></td></tr><tr><td>制冰机</td><td>Scotsman</td><td>AF80</td><td></td></tr><tr><td>12 通道 F1 数字多通道移液器</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>4661070</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 试剂盒</td><td>Biosense Laboratories</td><td>V01018401-096（黑头呆鱼）&lt;br/&gt; V01003402-096（鲤鱼）</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，0.5 ml</td><td>Alpha labs</td><td>LW2372</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 ml</td><td>Alpha labs</td><td>LW2375</td><td></td></tr><tr><td>硫酸，95-98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织处理机</td><td>Leica Biosystems</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>石蜡分配器</td><td>Thermo Scientific Raymond Lamb</td><td>E66HC</td><td></td></tr><tr><td>金属包埋模具</td><td>Leica Biosystems</td><td>各种规格</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Thermo Scientific Shandon</td><td>3120063</td><td></td></tr><tr><td>冷台（EG1150 C）</td><td>Leica Biosystems</td><td>14038838037</td><td></td></tr><tr><td>加热镊子（EG F）</td><td>Leica Biosystems</td><td>14038835824</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片漂浮浴&amp;nbsp;</td><td>Electrothermal</td><td>MH8517</td><td></td></tr><tr><td>载玻片干燥台</td><td>Electrothermal</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Stainmate 自动染色机</td><td>Thermo Scientific Shandon</td><td>E103/S10L</td><td></td></tr><tr><td>包埋盒，Histosette II，活检用</td><td>Simport</td><td>M493</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Thermo Scientific Raymond Lamb</td><td>W1</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-202</td><td></td></tr><tr><td>工业甲基化酒精（乙醇混合物），IDA99</td><td>Tennants</td><td>ID440</td><td></td></tr><tr><td>Polysine 黏附载玻片</td><td>Thermo Scientific Gerhard Menzel</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，22×50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>Histomount 封片剂</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-103</td><td></td></tr><tr><td>苏木精 Harris GURR</td><td>VWR</td><td>351945S</td><td></td></tr><tr><td>伊红，1%，水溶液</td><td>Pyramid Inovation</td><td>S20007-E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 载玻片盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>11701486</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片，MB35</td><td>Thermo Scientific Shandon</td><td>3050835</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酵母筛选&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Labcaire Systems Ltd</td><td>SC12R</td><td></td></tr><tr><td>冷却培养箱</td><td>LMS Cooled Incubator</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert</td><td>INB 400</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>Grant</td><td>PSU-10i</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 漩涡混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>13214789</td><td></td></tr><tr><td>板式摇床</td><td>Heidolph Titramax 100</td><td>544-11200-00</td><td></td></tr><tr><td>12 通道 F1 数字多通道移液器</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>4661070</td><td></td></tr><tr><td>12 通道电子移液器</td><td>Sartorius</td><td>735441</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底微孔板</td><td>MP Biomedicals&lt;br/&gt; Thermo Scientific Nunc&lt;br/&gt; Sarstedt</td><td>76-232-05&lt;br/&gt; 260860&lt;br/&gt; 82.1581.001</td><td>我们发现这些多孔板均能产生较低的背景信号</td></tr><tr><td>高效液相色谱级水</td><td>Rathburn</td><td>RH1020</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Hayman Kimia</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5655</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2939</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾，颗粒状</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1767</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铁(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307718</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8912</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-6034</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2786</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6969</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5308</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8566</td><td></td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-7403</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8662</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5482</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8415</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0513</td><td></td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td></td></tr><tr><td>硫胺素盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>吡哆醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5669</td><td></td></tr><tr><td>D-泛酸，半钙盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5155</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>无水 D-(+)-葡萄糖；混合异头物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4534</td><td></td></tr><tr><td>L-苏氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8441</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸铜(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1297</td><td></td></tr><tr><td>氯酚红-&amp;#946;-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2025</td><td></td></tr><tr><td>17 &amp;beta;-雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-8875</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;类固醇&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨水溶液</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸铜(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-17&amp;#946;-雌二醇</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-雌酮</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-17&amp;#945;-乙炔基雌二醇</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17&amp;#946;-雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>雌酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17&amp;#945;-乙炔基雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯乙烯-二乙烯基苯固相萃取小柱（Isolute ENV+）（200 mg/6 ml）</td><td>Biotage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolute 氨丙基固相萃取小柱（500 mg/6 ml）</td><td>Biotage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;鱼类研究&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>橙白硅胶管，内径 0.63 mm，6 根/包</td><td>Watson Marlow</td><td>982.0063.000</td><td></td></tr><tr><td>直通接头，适用于内径 0.5/0.8 mm，20 个/包</td><td>Watson Marlow</td><td>999.2008.000</td><td></td></tr><tr><td>pumsil 硅胶管，内径 0.8 mm，15 m</td><td>Watson Marlow</td><td>913.A008.016</td><td></td></tr><tr><td>200 系列多通道蠕动泵</td><td>Watson Marlow</td><td>205CA</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管 × 15 m（用于加药罐）</td><td>VWR</td><td>SFM1-3250</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管 × 15 m（大口径，用于进/出液）</td><td>VWR</td><td>SFM1-5450</td><td></td></tr><tr><td>2.5 L 玻璃广口瓶，4 个/包</td><td>Fisher Scientific</td><td>BTF-505-050B</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子，51 × 8 mm，10 个/包</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55595&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>三氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS222）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>17&amp;alpha;-乙炔基雌二醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4876-100MG</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Hayman Kimia</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;固相萃取（SPE）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/8 英寸 PTFE 管，“吸管”，彩色编码，4 根/包</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57276</td><td></td></tr><tr><td>一次性层析柱架衬垫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57059</td><td></td></tr><tr><td>无烧结滤片的过滤管，6 ml，30 根/包</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57242</td><td></td></tr><tr><td>储液瓶适配器，12 个/包</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57020-U</td><td></td></tr><tr><td>层析柱架不锈钢配重，4 个/包</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57278</td><td></td></tr><tr><td>阳鲁尔接头，用于层析柱架，12 个/包</td><td>Sigma Aldrich</td><td>504351</td><td></td></tr><tr><td>SPE 真空层析柱架</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57265</td><td></td></tr><tr><td>萃取层析柱架用旋塞阀（Supelco），12 个/包</td><td>Waters</td><td>WAT054806</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Plus C18 小柱，50&amp;nbsp;</td><td>Waters</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱级甲醇，2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>7 ml 玻璃小瓶及瓶盖（58 × 17 mm），399 个/包</td><td>Fisher Scientific</td><td>TUL-520-031K</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Hayman Kimia</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>真空泵，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，VP 系列真空泵</td><td>Camlab</td><td>1136915</td><td></td></tr></tbody></table>

采用化学与生态毒理学多方法联用评估废水处理工艺去除雌激素活性效能

Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

内分泌干扰物对水生环境构成重大风险。乙炔雌二醇（EE2）和雌酮（E1）最近已被列入欧洲水框架指令的环境污染物监测清单。市政污水处理厂是地表水中雌激素活性的主要来源。污水处理厂（WWTP）出水中大部分的雌激素活性可归因于类固醇雌激素（包括雌二醇（E2）、EE2 和 E1）的排放，这是由于处理过程中对这些物质的去除不完全所致。评估污水处理工艺的有效性需要对各单一物质进行定量测定，通常采用化学分析方法完成。最常用的方法包括使用多反应监测（MRM）的气相色谱-质谱联用（GCMS/MS）或液相色谱-质谱联用（LCMS/MS）。尽管这些方法在监管方面非常有用，但靶向化学分析仅能提供所监测化合物（及特定代谢物）的数据。生态毒理学方法则可进一步通过测量其生物活性，评估处理过程中产生的副产物或存在的未知雌激素类化合物。多种 体外 包括酵母雌激素筛查（YES）在内的生物测定法可用于测量废水样品的雌激素活性。化学分析与 体内 和 体外 生物测定法为评估废水处理工艺在去除雌激素类内分泌干扰物方面的有效性和适用性提供了有用的工具箱。本文采用一系列化学和生态毒理学测试方法，在实验室和现场研究中对常规、先进及新兴的废水处理工艺进行评估。

为了评估废水处理工艺改进的影响，或确定在现有污水处理厂加装三级处理设备时最合适的技术，以有效去除排放出水中内分泌干扰活性，不仅需要测量进入处理系统的各种关键化学组分，还必须分析可能同样具有内分泌干扰活性的降解产物。在生活污水出水中，雌激素活性最强的物质主要是类固醇激素，即雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）和17α-乙炔基雌二醇（EE2）5,8。类固醇雌激素主要以无活性的结合态混合物形式从人体排出16,17。这些结合型雌激素在下水道系统中通过细菌作用被大量去结合，随后在污水处理厂中进一步降解。去结合后的类固醇通过吸附至污泥或在二级处理过程中被生物降解而从废水中去除，此过程首先生成转化产物，最终可实现初始活性组分的完全矿化。对出水水流中所有单个化合物进行化学分析将十分困难、耗时且成本高昂，且无法涵盖样品中未知的活性组分。此外，各组分雌激素贡献的总和仅能反映所分析化合物样本的累积雌激素效价，若转化过程产生未知的雌激素物质，或进水来源于工业废水，则存在评估风险。将化学分析与in vivo和in vitro生态毒理学生物测定相结合，可有效解决诸如经处理污水等混合物中未知雌激素组分的检出问题。in vitro测定方法，如酵母雌激素筛查法（YES），已被广泛用于测定污水出水的雌激素活性，并帮助识别处理样品中的活性组分8,18,19。然而，in vivo与in vitro测试结果之间可能存在显著差异11，因此，针对内分泌干扰效价的处理效果对新工艺进行全面评估时，需要综合采用一系列化学分析与生态毒理学测试方法。
确定单个污水处理厂或处理工艺能否从废水中去除活性化合物，可通过化学分析实现，该过程通常在样品提取、浓缩及提取物净化后进行，多数采用液相色谱-质谱法（LCMS/MS）或气相色谱-质谱法（GCMS/MS）进行分析。化学分析所得数据可用于评估是否符合各自的预测无效应浓度（PNEC）20 或环境质量标准（EQS）21 特定化合物的分析至关重要，因此这类方法对于满足监管合规性数据要求具有重要意义。此外，与仅提供总体响应的生物方法相比，靶向或非靶向化学分析方法能够实现对单个化合物或异构体的鉴定与定量。因此，化学分析方法可对特定化合物进行评估，从而针对各个污水处理厂的具体情况，应对这些污水处理挑战。研究表明，传统污水处理（例如， 活性污泥处理厂在去除天然类固醇激素方面可具有高效性，但对合成激素EE2的去除效果通常较差。利用臭氧、颗粒活性炭（GAC）和膜技术等先进处理手段的实地研究表明，尽管成本较高，这些方法可作为末端处理方案，将EE2去除至低于预测效应水平乃至检测限以下。 图3 展示了在市政污水处理厂中试规模下采用颗粒活性炭（GAC）去除雌二醇（EE2）的效果。在市政污水处理厂开展的中试规模研究中，采用末端GAC处理工艺，结合酵母雌激素检测法（Yeast Estrogen Screen, YES）测定，同样观察到GAC处理后雌激素活性显著降低。 图4.
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig3.jpg" /> 
图3. 高级三级处理后乙炔雌二醇去除效果的现场数据示例。 （A）按照样品保存的操作步骤，在污水处理厂（活性污泥法处理厂）完成常规处理后采集样品。（B）采用固相萃取法提取样品，并通过正相固相萃取和凝胶渗透色谱法净化，以去除干扰物质。（C）将净化并浓缩后的提取物进一步浓缩至较小体积，采用负离子电喷雾LCMS/MS在多反应监测（MRM）模式下进行分析。使用同位素标记的内标物通过内标法计算结果。在本示例中，最终活性污泥法出水中乙炔雌二醇（EE2）浓度高于预测无效应浓度（PNEC，0.1 ng/L），通过颗粒活性炭（GAC）和臭氧（O3）处理将其降至对环境安全的浓度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig4.jpg" /> 
图4. 酵母雌激素筛查（YES）试验板照片（A），显示样品因雌激素活性引起的颜色由黄色变为红色。根据YES试验板数据绘制的图表，显示了雌二醇标准品（B）、活性污泥工艺出水（ASP）和颗粒活性炭（GAC）处理后的废水出水样品（C）在540 nm处的校正吸光度。 每个样品均设两个重复。ASP和GAC出水样品采用第1节所述固相萃取（SPE）方法进行提取和浓缩。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
臭氧氧化在去除经传统工艺处理的污水处理厂出水中的类固醇雌激素及雌激素活性方面也具有高效性。臭氧能够氧化废水样品中多种有机污染物和溶解性有机物，并具备消毒特性。臭氧氧化的效果取决于水体特性，如pH值、有机物含量以及臭氧投加剂量。对于传统处理工艺难以去除的雌激素，采用0.8至2 mg O₃/L的臭氧剂量即可从废水中有效去除。3毫克/升 DOC。臭氧是一种选择性氧化剂，可与富电子位点（如不饱和碳-碳键、芳香族化合物，包括芳香醇）发生反应，因此可用于降解多种内分泌干扰物（EDC）。然而，单一化合物的去除并不一定意味着原始化合物的完全矿化。臭氧处理后的有机物可能转化为中间产物或氧化转化副产物，包括一系列低分子量、极性化合物，如醛类、酮类、羧酸、酮酸以及溴代化合物。典型例子包括溴酸盐、甲醛、乙醛和羧酸。使用 体内 和 体外 生物测定结果表明，尽管臭氧仅部分氧化某些化学物质，但其主要转化产物的雌激素活性显著降低，因此在适当剂量下应用臭氧可高效去除雌激素活性。
对废水进行深度处理的主要益处之一，是减少受纳水体中雄性鱼类的雌性化现象；这种不良效应可能导致鱼类生育力下降3。利用鱼类（例如，雅罗鱼或黑头软口鱼）暴露于废水的体内研究显示，雄性鱼的精巢中出现雌性生殖细胞或卵母细胞（例如，如图5所示）。在经过活性炭颗粒（GAC）7或臭氧22等高级处理后，鱼类中几乎检测不到或显著减少了间性个体或雄性鱼体内卵黄原蛋白（VTG）的表达。这些研究表明，臭氧氧化过程中产生的转化产物不具有雌激素活性，但这并未涉及出水毒性的评估。该问题已在其他研究中得到关注，例如Magdeburg 等23的一项研究显示，臭氧氧化副产物对虹鳟鱼具有毒性，但该毒性可通过臭氧处理后的下游砂滤工艺予以去除。
<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig5.jpg" /> 
图5. 在野外评估中暴露于废水中成年雅罗鱼（Rutilus rutilus）的正常雄性（A）和雌雄同体（B, C）性腺的显微照片。 显微照片A显示了正常雄性精巢的组织切片。显微照片B和C显示了一条暴露于活性污泥工艺废水排放物六个月的雌雄同体雄鱼的组织切片。箭头指示存在于精巢组织中的卵母细胞。每张显微照片中的比例尺代表100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
使用臭氧、颗粒活性炭（GAC）或膜技术进行末端处理的成本较高，因此亟需开发成本更低、可持续的替代方法以去除内分泌干扰物（EDC）。此外，吸附与分离方法仅将EDC从一相转移至另一相，而无法通过降解实现彻底消除。TAML活化剂已被开发用于催化过氧化氢氧化废水中的有机微污染物。12,24-26. 具有 H 的 TAML 激活剂2O2 有效降解纯实验室用水、市政污水处理厂出水以及加标尿液样品中的雌酮（EE2）及其他类固醇雌激素12实验室研究表明，TAML/H2O2 处理可高效去除类固醇雌激素，包括去除EE2，并显著降低测得的雌激素活性 体外 利用YES生物测定法并显著减轻鱼类雌性化 体内 使用VTG生物测定法测定（图1 和 图6).
<img alt="图6" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig6.jpg" /> 
图6. 处理与未处理水箱水体中乙炔雌二醇（EE2）的平均浓度及雌激素活性（A），以及基线与暴露雄鱼血浆中卵黄原蛋白含量（B）。 A) 通过LCMS/MS测定EE2浓度（ng/L，深蓝色柱状图），通过 体外 酵母雌激素筛选（YES）。 B血浆卵黄原蛋白（ng/ml，浅蓝色柱状图）浓度通过定量酶联免疫吸附测定法（ELISA）在雄性黑头软口鲦鱼中进行检测。EE2化学分析结果报告为 &#60; 0.03 ng/L EE2（即， 低于检测限（LOD）的值被视为等于一半 LOD（即， 0.015 ng/L EE2），用于计算平均值、标准误和统计分析。EE2浓度和雌激素活性为21天暴露期间采集样品的平均实测浓度。血浆VTG在暴露前（基线）和暴露21天后分别进行测定。处理方案包括：阴性对照组（仅稀释用水）、EE2+H2O2+TAML，EE2+H2O2，以及仅使用EE2的处理组。图A中的误差线表示平均值的标准误差，图B中的误差线表示标准差。图B柱状图上方的字母表示统计学上的相似性。该图已根据Mills的研究修改 等12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

内分泌干扰物（EDC）对水生环境构成重大风险。市政污水处理厂是地表水中雌激素活性的主要来源。本文提供的方法可用于评估污水处理工艺在去除内分泌干扰物方面的有效性和适用性。

内分泌干扰物对水生环境构成重大风险。近期，乙炔雌二醇（EE2）和雌酮（E1）已被列入……

本系列测试方法的总体目标是评估新兴和新型废水处理技术去除雌激素类污染物的有效性，其中包含分析化学以及体外和体内检测方法。这些方法有助于解答环境工程领域的关键问题，例如，在废水雌激素活性不断变化的情况下，如何选择最有效的废水处理工艺。这些技术的主要优势在于其对活性化合物的极低浓度具有高度敏感性，从而能够识别出对保护水生生物最为有效的技术。演示实验操作的人员包括博士后研究员 Chris Green 博士、研究生 Angela Pinzon、研究学者 Alice Baynes 博士以及高级研究技术员 Nicola Beresford。固相萃取（SPE）过程必须严格保持清洁和有序，以防止样品污染。使用甲醇预先清洗所有试管、旋塞和烧结滤头。在运行样品之前，将传输管路连接至提取歧管，并用去离子水冲洗整个系统。运行样品时，首先安装一次性阀衬管，然后安装苯乙烯-二乙烯基苯固相萃取柱。接下来，用移液器向每个储液槽中加入5毫升乙酸乙酯，以润洗萃取柱。此步骤中，确保固相萃取装置已密封。然后开启真空泵，调节流速为 10 毫米每分钟。在萃取柱干燥之前，先加入 5 毫升甲醇，随后加入 5 毫升水。固相萃取柱绝不能干燥。当水大部分流过之后，关闭泵，并用去离子水重新加满每个萃取柱的储液室。然后，使用1/8英寸的PTFE管将萃取柱储液室与玻璃样品瓶连接起来。现在，将真空压力调节至流速低于10毫升每分钟，并使整个样品完全通过萃取柱。接着，彻底干燥固相萃取柱，直至柱内填料颜色发生变化。可使用真空或气流进行干燥。现在，将洁净、干燥的10毫升玻璃收集瓶放入支架中，并将支架置于萃取装置内。检查每个衬管是否位于收集瓶上方。向样品储液器中加入两份4毫升、共8毫升的二氯甲烷，开启真空泵，使液体通过固相萃取柱流入收集瓶中。然后，使用浓缩器将所有收集管中的体积减少至1毫升。将每个样品转移至自动进样瓶中，并使用氮气吹扫设备进一步浓缩至100微升。接下来的步骤是使用凝胶渗透色谱法（GPC）去除大分子干扰物。首先，将95 µL的洗脱样品提取物注入配备凝胶渗透色谱（GPC）的高效液相色谱仪（HPLC）中。使用浓缩装置和氮气吹扫装置将GPC洗脱液浓缩至200 µL，然后用正己烷定容至2 mL。接着，将一次性阀衬管、氨基紫 cartridge 和 cartridge 储液管安装至固相萃取（SPE）装置，并连接10 mL玻璃收集管。现在，向每个柱中加入 2 毫升正己烷，以润洗柱子，然后弃去溶剂。接下来，将 GPC 样品提取物加入储液池中，并抽吸使其通过柱体。将提取物收集液暂置一旁，并更换接样架中的试管以收集洗涤液。接下来，将2毫升体积分数为30%的乙酸乙酯与正己烷混合液通过萃取柱。然后，再加入2毫升乙酸乙酯与正己烷混合液，弃去洗涤液收集液，并将10毫升收集瓶放回支架中。现在，向储液池中加入2毫升体积分数为50%的乙酸乙酯与丙酮混合液，并以低于2毫升/分钟的低流速启动泵。液体流穿后，向储液池中再加入2毫升50%的乙酸乙酯。接着，使用浓缩仪将提取液体积浓缩至1毫升。然后，将样品转移至较小的玻璃小瓶中，使用氮吹设备将提取液蒸发至近干。加入100微升甲醇，充分混匀样品，再转移至带有0.3毫升内插管的自动进样瓶中。然后，对提取物进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。在开始检测的前一天，制备新鲜的培养基，并接种所用HER菌株的tenax冻存物。次日，进行检测前准备，用乙醇对受试化学品或出水提取物进行100微升系列稀释，并制备E2标准曲线。现在，将10 µL等分试样转移至标记好的无菌96孔板中。然后，将板子敞开放置以挥发乙醇。接着，准备50 mL生长培养基，并加入0.5 mL CPRG溶液。从24小时的酵母培养物中，于620纳米处测定浊度以估算细胞密度。然后，将4000万个酵母细胞加入50毫升的检测培养基中。将接种后的检测培养基转移至无菌槽中，并使用多通道移液器将每孔200微升的培养基加入检测板的各个孔中。更换检测板盖子，用胶带密封边缘，然后使用板式振荡器剧烈振荡检测板两分钟。随后，将检测板置于32 °C的自然通风加热柜中孵育。孵育三天后，再次进行振荡，然后静置约一小时使酵母沉淀。最后，在540和620纳米波长下测定样品的光吸收值。采用负离子电喷雾液相色谱-质谱联用法（LCMS）分析来自常规污水处理厂的水样，以激活其污泥处理过程，结果显示乙炔雌二醇浓度高于预测无效应水平。采用粒状活性炭（GAC）等高级水处理技术，可显著降低乙炔雌二醇的含量。所有废水提取物均采用同位素标记的内标（红色峰）进行分析，以实现定量。酵母雌激素筛选实验对标准雌二醇具有明显响应，但对乙醇无响应，后者实质上为空白对照。酵母筛选细胞对活性污泥工艺出水有明显响应，而经颗粒活性炭（GAC）处理的出水响应减弱，但仍比空白对照具有更高的生物活性。利用这种新型废水处理技术，经双氧水与TAML联合处理后，乙醇雌二醇浓度（蓝色表示）和雌激素活性（绿色表示）均显著降低。污水处理厂是地表水中雌激素类物质污染的主要来源。为改进出水水质，需要对水处理工艺进行新的探索，并深入检测其雌激素活性。观看本视频后，您应充分了解为测定水样中雌激素活性所需的一系列化学与生态毒理学检测方法。在样品及提取物的处理过程中，必须谨慎操作，以最大限度地减少污染。例如，一些常用的塑料制品含有具有雌激素活性的化合物，因此必须设置阴性对照，以检测是否存在化学污染；同时设置阳性对照，以验证提取方法的有效性，并确认添加的雌激素能够被有效回收。

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环境

对污水处理工艺的疗效评估利用化学和生态毒理学方法的电池，以消除雌激素潜能

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本文提供了一种利用斑马鱼胚胎Tg(vtg1:...

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