采用化学与生态毒理学多方法联用评估废水处理工艺去除雌激素活性效能

本系列测试方法的总体目标是评估新兴和新型废水处理技术去除雌激素类污染物的有效性，其中包含分析化学以及体外和体内检测方法。这些方法有助于解答环境工程领域的关键问题，例如，在废水雌激素活性不断变化的情况下，如何选择最有效的废水处理工艺。这些技术的主要优势在于其对活性化合物的极低浓度具有高度敏感性，从而能够识别出对保护水生生物最为有效的技术。

演示实验操作的人员包括博士后研究员 Chris Green 博士、研究生 Angela Pinzon、研究学者 Alice Baynes 博士以及高级研究技术员 Nicola Beresford。固相萃取（SPE）过程必须严格保持清洁和有序，以防止样品污染。使用甲醇预先清洗所有试管、旋塞和烧结滤头。

在运行样品之前，将传输管路连接至提取歧管，并用去离子水冲洗整个系统。运行样品时，首先安装一次性阀衬管，然后安装苯乙烯-二乙烯基苯固相萃取柱。接下来，用移液器向每个储液槽中加入5毫升乙酸乙酯，以润洗萃取柱。

此步骤中，确保固相萃取装置已密封。然后开启真空泵，调节流速为 10 毫米每分钟。在萃取柱干燥之前，先加入 5 毫升甲醇，随后加入 5 毫升水。

固相萃取柱绝不能干燥。当水大部分流过之后，关闭泵，并用去离子水重新加满每个萃取柱的储液室。然后，使用1/8英寸的PTFE管将萃取柱储液室与玻璃样品瓶连接起来。

现在，将真空压力调节至流速低于10毫升每分钟，并使整个样品完全通过萃取柱。接着，彻底干燥固相萃取柱，直至柱内填料颜色发生变化。可使用真空或气流进行干燥。

现在，将洁净、干燥的10毫升玻璃收集瓶放入支架中，并将支架置于萃取装置内。检查每个衬管是否位于收集瓶上方。向样品储液器中加入两份4毫升、共8毫升的二氯甲烷，开启真空泵，使液体通过固相萃取柱流入收集瓶中。

然后，使用浓缩器将所有收集管中的体积减少至1毫升。将每个样品转移至自动进样瓶中，并使用氮气吹扫设备进一步浓缩至100微升。接下来的步骤是使用凝胶渗透色谱法（GPC）去除大分子干扰物。

首先，将95 µL的洗脱样品提取物注入配备凝胶渗透色谱（GPC）的高效液相色谱仪（HPLC）中。使用浓缩装置和氮气吹扫装置将GPC洗脱液浓缩至200 µL，然后用正己烷定容至2 mL。接着，将一次性阀衬管、氨基紫 cartridge 和 cartridge 储液管安装至固相萃取（SPE）装置，并连接10 mL玻璃收集管。

现在，向每个柱中加入 2 毫升正己烷，以润洗柱子，然后弃去溶剂。接下来，将 GPC 样品提取物加入储液池中，并抽吸使其通过柱体。将提取物收集液暂置一旁，并更换接样架中的试管以收集洗涤液。

接下来，将2毫升体积分数为30%的乙酸乙酯与正己烷混合液通过萃取柱。然后，再加入2毫升乙酸乙酯与正己烷混合液，弃去洗涤液收集液，并将10毫升收集瓶放回支架中。现在，向储液池中加入2毫升体积分数为50%的乙酸乙酯与丙酮混合液，并以低于2毫升/分钟的低流速启动泵。

液体流穿后，向储液池中再加入2毫升50%的乙酸乙酯。接着，使用浓缩仪将提取液体积浓缩至1毫升。然后，将样品转移至较小的玻璃小瓶中，使用氮吹设备将提取液蒸发至近干。加入100微升甲醇，充分混匀样品，再转移至带有0.3毫升内插管的自动进样瓶中。

然后，对提取物进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。在开始检测的前一天，制备新鲜的培养基，并接种所用HER菌株的tenax冻存物。次日，进行检测前准备，用乙醇对受试化学品或出水提取物进行100微升系列稀释，并制备E2标准曲线。

现在，将10 µL等分试样转移至标记好的无菌96孔板中。然后，将板子敞开放置以挥发乙醇。接着，准备50 mL生长培养基，并加入0.5 mL CPRG溶液。

从24小时的酵母培养物中，于620纳米处测定浊度以估算细胞密度。然后，将4000万个酵母细胞加入50毫升的检测培养基中。将接种后的检测培养基转移至无菌槽中，并使用多通道移液器将每孔200微升的培养基加入检测板的各个孔中。

更换检测板盖子，用胶带密封边缘，然后使用板式振荡器剧烈振荡检测板两分钟。随后，将检测板置于32 °C的自然通风加热柜中孵育。孵育三天后，再次进行振荡，然后静置约一小时使酵母沉淀。

最后，在540和620纳米波长下测定样品的光吸收值。采用负离子电喷雾液相色谱-质谱联用法（LCMS）分析来自常规污水处理厂的水样，以激活其污泥处理过程，结果显示乙炔雌二醇浓度高于预测无效应水平。采用粒状活性炭（GAC）等高级水处理技术，可显著降低乙炔雌二醇的含量。

所有废水提取物均采用同位素标记的内标（红色峰）进行分析，以实现定量。酵母雌激素筛选实验对标准雌二醇具有明显响应，但对乙醇无响应，后者实质上为空白对照。酵母筛选细胞对活性污泥工艺出水有明显响应，而经颗粒活性炭（GAC）处理的出水响应减弱，但仍比空白对照具有更高的生物活性。

利用这种新型废水处理技术，经双氧水与TAML联合处理后，乙醇雌二醇浓度（蓝色表示）和雌激素活性（绿色表示）均显著降低。污水处理厂是地表水中雌激素类物质污染的主要来源。为改进出水水质，需要对水处理工艺进行新的探索，并深入检测其雌激素活性。

观看本视频后，您应充分了解为测定水样中雌激素活性所需的一系列化学与生态毒理学检测方法。在样品及提取物的处理过程中，必须谨慎操作，以最大限度地减少污染。例如，一些常用的塑料制品含有具有雌激素活性的化合物，因此必须设置阴性对照，以检测是否存在化学污染；同时设置阳性对照，以验证提取方法的有效性，并确认添加的雌激素能够被有效回收。