Name: 巨噬细胞集落刺激因子分化的人单核细胞衍生的巨噬细胞的培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 了解利用M-CSF诱导人单核细胞分化为巨噬细胞的培养方法。该技术通过白细胞分离术和连续逆流离心洗脱法富集单核细胞，经冷冻保存实现稳定均一的巨噬细胞培养，减少供体依赖性并提高实验可重复性。

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美国国立卫生研究院临床中心输血医学科提供了经离心分离的单核细胞。本工作由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所院内研究计划资助。

白细胞单采术是在美国国立卫生研究院机构审查委员会批准的人类受试者研究方案下进行的。
1. 单核细胞的分离与冷冻保存
<ol>
	<li>通过白细胞单采术获取人供体的单个核细胞，并按照参考文献所述，采用连续逆流离心淘析法从单个核细胞中富集单核细胞 7,8. 获取约 100 x 106 使用制造商指定的elutriation缓冲液收集洗脱细胞（约80–90%为单核细胞）。用血细胞计数板计数细胞。</li>
	<li>在15 ml聚丙烯管中以300 x g离心单核细胞 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>移去上清液，将细胞轻轻重悬于胎牛血清（FBS）中，随后加入二甲基亚砜，使终浓度为90% FBS/10%二甲基亚砜，并含有50 × 106 细胞/毫升</li>
	<li>将每毫升细胞悬液加入到一个独立的冻存管中。</li>
	<li>将冻存管放入细胞冻存盒中，于-80 °C冰箱中放置24小时，随后转移至液氮冻存管储存罐中进行长期保存。</li>
</ol>
2. 单核细胞向巨噬细胞的分化
<ol>
	<li>将冻存细胞的冻存管迅速转移至37 °C水浴中解冻，当细胞悬液约70%融化时立即取出。</li>
	<li>室温下完全解冻后，立即将1 ml冻存管内容物转移至50 ml预热至37 °C的含2 mM L-谷氨酰胺、50 ng/ml M-CSF、25 ng/ml 白细胞介素-10（IL-10）和10%胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（完全培养基）中。</li>
	<li>将25 ml单核细胞悬液分别加入两个75 cm2的塑料细胞培养瓶中。</li>
	<li>将培养物置于37 °C、5% CO2 / 95%空气的细胞培养箱中孵育48小时。</li>
	<li>用10 ml预热至37 °C的RPMI 1640培养基轻轻冲洗培养物3次，每次小心移除培养基，避免冲走松散贴壁的细胞。</li>
	<li>冲洗后，加入新鲜的完全培养基，每2天更换一次培养基，直至单核细胞充分分化并增殖形成融合单层。此过程通常需要约一周的培养时间。</li>
</ol>
3. 收集巨噬细胞以启动实验
<ol>
	<li>用 10 ml 预热至 37 °C 的不含 Ca²⁺ 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液，将培养瓶中的分化巨噬细胞冲洗 3 次2+ 和 Mg2+ 在加入 10 ml 之前&#160;预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液</li>
	<li>将培养瓶置于细胞培养箱中孵育10–15分钟，此时约90%的巨噬细胞应已变圆并脱落。通过显微镜观察培养瓶以确认该状态。</li>
	<li>加入10 ml含10% FBS的RMPI 1640培养基以终止消化。</li>
	<li>将巨噬细胞悬液从培养瓶转移至50 ml聚丙烯管中，300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>轻轻将巨噬细胞重悬于1 ml完全培养基中。</li>
	<li>将10 µl巨噬细胞悬液与10 µl台盼蓝溶液混合，测定巨噬细胞数量和活力（通常 &#62; 95%）使用血细胞计数板进行计数。</li>
	<li>根据细胞计数（通常约为 15 - 18 x 105 巨噬细胞），加入额外的完全培养基以达到所需的接种细胞密度。注意：1 x 105 在12孔板中，每孔加入1.5 ml培养基培养巨噬细胞，可获得接近汇合的细胞培养状态。</li>
	<li>接种后，将巨噬细胞在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育过夜2 / 95% 空气条件下培养，以促进细胞贴壁。随后，开始进行所需的实验。</li>
</ol>

<ol><li>Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front. Immunol. 5, 683(2014).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).</li>
<li>Akagawa, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).</li>
<li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).</li>
<li>Strasser, E. F., Eckstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+leukocyte+collection+and+monocyte+isolation+for+dendritic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture.</a> Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapheresis+products+by+using+the+Elutra+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator.</a> Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Anzinger, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+low-density+lipoprotein+uptake+by+macrophage+colony-stimulating+factor-differentiated+human+macrophages+is+mediated+by+macropinocytosis+and+micropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+receptor-independent+low+density+lipoprotein+uptake+and+cholesterol+accumulation+by+macrophages+differentiated+from+human+monocytes+with+macrophage-colony-stimulating+factor+%28M-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF).</a> J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).</li>
<li>Freeman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG1-mediated+generation+of+extracellular+cholesterol+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains.</a> J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).</li>
<li>Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent+fluid-phase+pinocytosis+mechanisms+for+induction+of+foam+cell+formation+with+native+low-density+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles.</a> Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA1+contributes+to+macrophage+deposition+of+extracellular+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol.</a> J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).</li>
<li>Ong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cholesterol-rich+microdomains+generated+by+human+macrophages+and+their+potential+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport.</a> J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-dependent+human+monocyte+survival+at+the+early+stage+of+the+culture+and+inhibits+the+generation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages.</a> J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).</li>
<li>Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+monocytes+from+whole+blood+by+density+gradient+centrifugation+and+counter-current+elutriation+followed+by+cryopreservation%3A+six+years%27+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).</li>
<li>Weiner, R. S., Normann, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integrity+of+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Functional integrity of cryopreserved human monocytes.</a> J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).</li>
<li>Hansen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+phagocytic+functions+in+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).</li>
<li>Seager Danciger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination+of+apolipoprotein+A-I%3A+effect+on+macrophage+proliferation--a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale.</a> Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

获得特定类型的巨噬细胞有助于阐明研究巨噬细胞生物学时因实验条件不同而导致的研究人员之间结果不一致的问题。使用不同的培养条件和分化因子来诱导生成原代人巨噬细胞，可能产生截然不同的巨噬细胞类型，而研究人员可能并未充分认识到这一点。例如，人单核细胞有时在无血清、仅含人血清、人血清添加M-CSF、仅含FBS，或含M-CSF或GM-CSF的FBS条件下分化为巨噬细胞。如先前报道及我们所观察到的，单核细胞在无血清或仅含FBS但未添加分化因子的条件下培养一周后无法维持存活3。如上所述，使用仅含人血清或添加M-CSF的人血清培养的单核细胞所生成的巨噬细胞，呈现出与在FBS加GM-CSF条件下分化的单核细胞特征性的“煎蛋状”形态相似的形态&#34;。因此，即使在添加M-CSF的情况下，只要存在人血清，也无法获得具有更长梭形形态的M-CSF型巨噬细胞&#34;。
有趣的是，我们观察到，使用含有M-CSF和GM-CSF的FBS对单核细胞进行分化，可同时产生M-CSF诱导的细长形细胞和GM-CSF &#34;煎蛋&#34; 同一培养物中出现不同的形态学表型。这表明不同的单核细胞亚群可...

培养的巨噬细胞是研究这些细胞在动脉粥样硬化斑块等炎症过程中功能的有用模型。当研究重点涉及人类巨噬细胞相关疾病时，使用原代人巨噬细胞而非非人来源的巨噬细胞有助于避免种属差异。此外，与使用巨噬细胞系相比，采用原代巨噬细胞可避免细胞转化所带来的影响。为此，可通过从人血液中分离单核细胞并将其分化为巨噬细胞，以此获得原代人巨噬细胞。
组织巨噬细胞可能为驻留于组织内的巨噬细胞，也可能来源于迁移至组织并分化为巨噬细胞的单核细胞1。目前已定义出两种人类单核细胞来源的巨噬细胞，它们不仅在形态学上存在差异，而且在基因表达和细胞功能上也有所不同2。这两种巨噬细胞分别由在M-CSF加胎牛血清（FBS）存在下分化为巨噬细胞的单核细胞，以及在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）加FBS存在下分化为巨噬细胞的单核细胞获得2-6。根据我们的经验（未发表观察），使用人血清替代FBS时，无论分化培养基中添加M-CSF还是GM-CSF，均会生成GM-CSF型巨噬细胞。M-CSF型巨噬细胞通常比GM-CSF型巨噬细胞更为细长，而后者在形态上类似煎蛋。研究者应认识到，人类M-CSF和GM-CSF来源的单核细胞衍生巨噬细胞并不等同于所谓的小鼠M1和M2型骨髓来源巨噬细胞6。
在使用人单核细胞来源的M-CSF分化巨噬细胞进行研究时，我们遇到了因单核细胞获取困难而难以启动实验的问题，以及在单核细胞向巨噬细胞分化过程中获得的巨噬细胞密度存在差异的问题。为解决这些问题，我们开发了以下实验方案：将单核细胞冻存以备后续使用，并大规模地将单核细胞分化为巨噬细胞，随后从培养瓶中收集这些巨噬细胞，并以目标细胞密度接种，从而在不同实验间获得更为均一的细胞培养结果。

<table><tbody><tr><td>Cellbind 12孔培养板</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR，T-75培养瓶，组织培养处理</td><td>Greiner Bio-One 北美公司</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>预热至 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&amp;nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>冻存管&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;的 DPBS</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>改进型内波尔计数板（亮视野血细胞计数器）</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>CoolCell LX 细胞冻存容器</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>其他冻存容器也应适用于此步骤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>液氮储存系统，CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>7400</td><td>任何液氮罐均应适用</td></tr></tbody></table>

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导人单核细胞来源的巨噬细胞进行细胞培养的实验方案。实验开始时，将新鲜或冻存的单核细胞在含有M-CSF的培养瓶中培养1周，以诱导其分化为巨噬细胞。随后，可收获这些巨噬细胞，并以所需的细胞密度接种至培养板中以开展后续实验。相较于使用固定数量的单核细胞起始培养，采用确定数量的巨噬细胞进行实验起始，能够更稳定地达到目标细胞密度。使用冻存单核细胞可减少对供体来源的依赖性，并获得更为均一的巨噬细胞培养体系。

新鲜或冻存单核细胞的活力通过台盼蓝染色法测定，高于95% 9. 图 1 和 图2 分别在较低和较高放大倍数下比较新鲜样本与冷冻保存样本的进展情况（即，冷冻）单核细胞向巨噬细胞的分化。需要注意的是，与冻存单核细胞相比，新鲜单核细胞中存在一个正在分化的单核细胞亚群，这些细胞未发生铺展，仍保持圆形。在上述两种条件下，单核细胞来源的巨噬细胞中均出现透亮的空泡，这些空泡为大胞饮体，是此前已报道的M-CSF型巨噬细胞的特征性结构 10,11.
从单核细胞分化所用培养瓶中收获巨噬细胞后进行冻存，未能成功建立巨噬细胞培养体系（图3）。此类培养物中细胞贴壁极为稀疏，可能源于冻存后细胞活力低下。
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。

介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。用于起始培养……

本实验的总体目标是提高单核细胞的可获得性，并尽量减少在M-CSF诱导人血单核细胞向巨噬细胞分化过程中所获得细胞密度的差异。该方法有助于回答有关人巨噬细胞生物学的关键问题。该策略的主要优势在于，可更稳定地获得人单核细胞来源的巨噬细胞培养物，从而降低对供体来源的依赖性。此外，可稳定获得理想的巨噬细胞密度和均一的培养物。开始该实验前，从人类供体通过白细胞单采术获取单个核细胞，然后通过单个核细胞的连续逆流离心淘析法富集单核细胞。随后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。接下来，将单核细胞置于15毫升聚丙烯管中，在室温下离心5分钟。然后弃去上清液，并用胎牛血清（FBS）轻轻重悬细胞，再加入二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide），使终浓度为90% FBS、10% 二甲基亚砜，细胞浓度为50 × 10⁶ 个细胞/毫升。随后，将1毫升细胞悬液加入单个冻存管中。将冻存管放入细胞冻存盒中，转移至-80摄氏度冰箱中保存24小时。24小时后，将冻存盒转移至液氮冻存罐中进行长期保存。在此步骤中，将一管冻存细胞置于37摄氏度水浴中短暂解冻。当细胞悬液解冻约70%时，立即从水浴中取出并转移至室温。待细胞悬液完全解冻后，取1毫升冻存液内容物加入50毫升含2毫摩尔/升L-谷氨酰胺、50纳克/毫升M-CSF、25纳克/毫升IL-10和10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，置于37°C环境中。随后，将25毫升单核细胞悬液分装至两个75平方厘米的塑料细胞培养瓶中。将培养物在37摄氏度下孵育48小时。注意：在48小时内不要更换培养基，否则细胞将无法良好贴壁并会被冲洗掉。48小时后，用10毫升预热的RPMI 1640培养基将培养物冲洗三次。轻轻移除培养基，避免去除任何松散贴壁的细胞。随后加入完全培养基，继续培养细胞一周，每两天更换一次培养基，直至单核细胞有效分化并增殖形成融合单层。现在，用 10 毫升 37 摄氏度、不含钙和镁的 DPBS 将烧瓶中的分化巨噬细胞冲洗三次。随后，加入 10 毫升 37 摄氏度的 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液。接着，将烧瓶放入细胞培养箱中孵育 10 至 15 分钟。此后，约90%的巨噬细胞应已变圆并脱落。然后加入10毫升含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基以终止消化。如有必要，可使用细胞刮刀彻底收集细胞。在此步骤中，有时会有大量巨噬细胞仍保持附着。可通过在胰蛋白酶消化后用细胞刮铲轻轻刮过培养瓶表面来去除这些巨噬细胞。随后，将巨噬细胞悬液从培养瓶转移至一个15毫升聚丙烯管中。在室温下离心五分钟，弃去上清液。然后用一毫升完全培养基轻轻重悬巨噬细胞。根据细胞计数，加入适量的完全培养基，以达到所需的接种细胞密度。然后，将巨噬细胞以每孔1.5毫升培养基接种于12孔板中。每孔接种1×10⁵个细胞，通常可获得接近汇合的培养状态。接种后，在

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

巨噬细胞集落刺激因子分化的人单核细胞衍生的巨噬细胞的培养

本视频展示了将原代单核细胞诱导分化为巨噬细胞的过程。可通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）将原代人单核细胞分离并诱导为类似M1型的促炎表型，或通过巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导为类似M2型的抗炎表型。...

原代单核细胞体外培养及向巨噬细胞的分化

在本视频中，我们演示了一种诱导外周血来源的单核细胞分化并极化为M1或M2型巨噬细胞的方法。使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脂多糖和干扰素-γ孵育可获得促炎性的M1型巨噬细胞，而使用巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4孵育则可诱导产生抗炎性的M2型巨噬细胞。...

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单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。本文介绍了一种易于使用的 体外...

一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养的骨髓细胞可形成包含巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的异质性细胞群。本方法重点利用主要组织相容性复合物II类分子（MHCII）和透明质酸（HA）结合能力来区分GM-CSF培养体系中的巨噬细胞与树突状细胞。该培养体系中的巨噬细胞在诸多特性上与肺泡巨噬细胞相似。...

小鼠骨髓来源的GM-CSF诱导类肺泡巨噬细胞和树突状细胞的生成与鉴定

本文介绍了一种优化的实验方案，用于从HIV感染者和健康对照个体中分离、培养、转染并诱导人原代单核细胞分化。...

原代人单核细胞的分离、转染与培养

本文介绍了一种利用显微镜和荧光染色在活细胞培养中检测巨噬细胞胞外诱捕网（MET）生成的实验方案。该方案可进一步扩展，通过免疫荧光染色来检测特定的MET蛋白标志物。...

体外刺激与可视化分化人单核细胞来源巨噬细胞的胞外诱捕网释放

M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤进展及癌症患者的不良预后相关。本方案提供了一份详细指南，可在14天内可重复地将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞。该模型为研究肿瘤微环境中TAM的抗炎作用奠定了基础。...

利用人单核样THP-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为M2样表型

本实验方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源巨噬细胞的方法。...

从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外...

人源单核细胞来源巨噬细胞的重编程模型 体外 检测方法

了解利用M-CSF诱导人单核细胞分化为巨噬细胞的培养方法。该技术通过白细胞分离术和连续逆流离心洗脱法富集单核细胞，经冷冻保存实现稳定均一的巨噬细胞培养，减少供体依赖性并提高实验可重复性。

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

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