结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

本实验的总体目标是可视化并测量移植血液细胞在受体骨髓微环境中的体内植入情况。该技术的主要优势在于能够观察移植后供体造血细胞的归巢、扩增以及向不同骨髓微环境定位等细胞过程。结合基因工程动物模型使用时，该方法有助于阐明造血细胞再生所依赖的关键分子通路。

与组织学或其他成像技术不同，活体显微镜技术能够在活体动物中以细胞水平实时捕捉细胞间的相互作用。我们决定采用该方法来确定骨髓微环境是否为Notch信号通路缺失所导致的骨髓增殖性疾病的最初发病部位。对于初次使用该技术的研究人员而言，面临的挑战包括尽量减少呼吸伪影、最佳地定位和固定头部，以及避免图像饱和。

移植前一到两个小时，用70%乙醇喷洒一只裂解的EGFP小鼠。接着，使用手术剪在每条腿踝部周围的皮肤上做切口，并用手术镊子将皮肤和毛发一起去除，以暴露干净的肌肉组织。尽可能多地去除腿部的肌肉。

然后在膝关节和踝关节处切断骨骼，并使用纱布海绵去除股骨和胫骨上残留的任何肌肉组织。将清理后的骨骼放入含有添加了10% FBS的DMEM的六孔板中冲洗。随后将四根后肢骨转移至装有10毫升PBS中配制的冷EDTA的研钵中，并用研杵碾碎骨骼。

将骨髓细胞吹打重悬以获得单细胞悬液，并通过70微米滤膜过滤至15毫升离心管中。用2至3毫升PBS冲洗滤膜。随后离心细胞，并将沉淀重悬于10毫升含10%FBS的新鲜DMEM培养基中。

注射时，先将细胞悬液离心，计数后用无血清的IMDM培养基调整细胞浓度至每毫升1.5 × 10⁷个细胞。将细胞置于冰上。在第二次照射辐射后5至6小时，向每只受照受体动物的尾静脉注射3 × 10⁶个骨髓细胞。

加入相应移植后时间点。将麻醉后的受体小鼠置于37摄氏度加热垫上，并确认其对脚趾夹捏无反应。在动物眼睛上涂抹眼膏，并通过尾静脉注射100 µL相应荧光标记物。

接下来，使用小型电动剪毛器去除动物头部背侧的毛发，然后涂抹脱毛膏。五分钟后，用纱布海绵擦去脱毛膏，并用生理盐水冲洗残留的溶液。用浸有70%乙醇的棉签对头皮进行消毒。

然后使用精细镊子和剪刀在头皮上做一条10至20毫米的正中皮肤切口，以暴露下方的颅骨背侧表面。使用5-0外科缝线，在切口两侧各放置两根固定缝线，形成皮瓣以暴露颅骨用于成像。在暴露的颅骨上滴加一滴油。

将小鼠置于仰卧位，把暴露的头皮浸入装满显微镜油的玻璃底培养皿中。然后将动物放置于多光子成像台上，使颅骨位于物镜上方，并用37摄氏度的加热垫覆盖动物。在进行多光子图像采集过程中，必须确保头部保持在正确位置并稳定不动。

根据需要使用立体定位仪或胶带固定小鼠。使用经过改造用于双光子成像的倒置共聚焦系统，将双光子激光器调谐至830纳米。接着，打开相应的图像采集软件。

在采集设置菜单下，确认已选择单向扫描模式，并将扫描速度设置为每像素 4 微秒，帧速率为 512×512 像素，放大倍数设置为 1.5。选择 20X 水镜，数值孔径为 0.95。打开染料列表窗口并选择双光子。

然后在显微镜控制器窗口中选择 RDM690 反射镜。在光路和转盘窗口中，选中激光单元二复选框，以检查双光子激光快门是否已打开。选择 EPI 灯，并选择蓝/绿荧光（B/G EPI）滤光片组。

然后，以中央静脉的分叉处和冠状缝作为参考点，将物镜聚焦于样本上，以观察颅骨骨髓微环境中血管的血流情况。使用非扫描模式，选择三个外部探测器，并以每像素4微秒的扫描速度对样本进行成像，不进行平均处理，同时保持激光功率和探测器增益恒定，以充分利用探测器的全动态范围并尽量减少信号饱和。在采集完贯穿组织深度的一系列光学切片后，打开相应的专用3至4维图像定量与可视化软件。

根据制造商的说明，使用适当的3D渲染算法对Z轴堆栈进行交互式可视化。然后使用点状对象分割模块对GFP细胞进行分割，并应用堆栈算术处理以消除绿色和红色通道中的假阳性GFP细胞。最后，使用表面分割模块重新构建血管和骨表面的分割，并根据需要应用点到表面的X轴张力距离算法，计算细胞到任意远端表面的距离。

在此实验中，从颅骨骨髓六个标准区域采集的Z轴堆栈图像被分别重建为三维最大强度投影、包含骨成分的三维阴影投影以及三维分割图像，从而实现了对细胞的定量分析，并可测量细胞与骨及血管之间的距离。体内成像结果显示，在Notch信号缺陷的骨髓微环境中，供体来源的裂解型GFP标记髓系细胞在移植后24小时于野生型受体与基因敲除受体中的归巢效率相似，但在后续时间点表现出不同的植入情况。对髓系前体细胞扩增动态的分析表明，在移植后两周，适应性骨髓移植的细胞在基因敲除受体中的扩增速度更快，数量更多。

在野生型受体中，供体骨髓细胞的扩增时间较晚，但在移植后四周时其数量比敲除型受体中的供体细胞高出两倍；此时，敲除型骨髓中的供体细胞数量已减少，因其迅速进入循环系统。而在六周时，两种受体骨髓中供体细胞数量的差异趋于一致。此外，在骨髓移植六周后，对敲除型与野生型颅骨下中部区域进行三维分割分析表明，裂解的GFP细胞在两种受体动物中距离骨表面的距离相同，但有趣的是，在敲除型小鼠中，这些细胞距离血管系统更远。

熟练掌握后，若操作得当，每只小鼠的活体骨髓成像可在1小时30分钟内完成。采用此方法时，需注意每只小鼠应采集颅骨骨髓的多个区域，并且每次实验至少分析三只小鼠，以消除样本内和样本间的变异。观看本视频后，您应能够充分理解如何结合骨髓移植与活体成像技术，以确定特定血液亚群定植于骨髓微环境的动力学过程。