Name: 结合活体荧光显微镜 (IVFM) 和遗传模型研究造血细胞对骨髓生态位的植入动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学习活体荧光显微镜结合遗传模型研究造血细胞归巢与植入骨髓生态位的动态过程。该技术可实时可视化细胞行为，揭示骨髓微环境在造血再生中的关键作用。

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成像工作在印第安纳大学的印第安纳生物显微中心完成，该中心由肯·邓恩博士（Dr. Ken Dunn）负责。立体定位装置是由威尔斯儿科研究中心的马克·孙帕（Mark Soonpaa）设计和制造的原型设备。本研究得到以下资助：NIH/R01DK097837-09（NC）、NIH/R01HL068256-05（NC）、NIH/NIDDK1U54DK106846-01（NC）、MPN研究基金会（NC）以及印第安纳大学医学院/圣母大学临床与转化科学研究所（CTSI）合作项目（NC）。

涉及动物使用的全部操作均须经印第安纳大学医学院动物护理与使用委员会批准后方可进行。务必遵守开展工作的国家有关动物实验的法律法规。
1. Mx1CreRBPJ-/- 受体小鼠的制备
<ol>
	<li>将 Mx1-Cre+ 小鼠与 RBPJlox/lox 小鼠10 杂交，以获得 Mx1-Cre 阳性 RBPJlox/lox 小鼠12 及 Mx1-Cre 阴性 RBPJlox/lox 同窝小鼠作为对照。通过 PCR 验证基因型10。</li>
	<li>使用 6–8 周龄的 Mx1Cre+/RBPJlox/lox 和 Mx1Cre-/RBPJlox/lox 小鼠进行 polyI:C 诱导。</li>
	<li>在 Cre+ 和 Cre- 小鼠中腹腔注射 200 µg polyI:C。第一周每隔一天注射一次，共三次；第二周在上次注射后 7 天再注射一次（总计四次注射）。
	<ol>
		<li>在最后一次 polyI:C 注射后 3 周，使用 RBPJ 基因敲除（诱导型 Mx1Cre+/RBPJlox/lox）和 RBPJ 野生型（诱导型 Mx1Cre-/RBPJlox/lox）小鼠作为受体。 
		注：建议在 pI:pC 诱导后 3 周使用小鼠。polyI:C 触发的干扰素 α（IFNα）反应会引起骨髓（BM）显著变化，导致造血干细胞（HSC）免疫表型扩增，并减少成熟前体细胞向外周血的输出16,17。注射后 3 周，造血细胞亚群的比例恢复正常，此时可使用小鼠而避免炎症带来的干扰效应。该诱导方案已针对 RBPJ 基因优化。若敲除其他基因，诱导方案可能因构建体不同而有所差异，且必须验证敲除效率。我们在总共四次 polyI:C 注射后，通过 RT-PCR 验证了 loxP 位点间 RBPJ 区域的敲除效率约为 100%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 移植用Lys-EGFP供体骨髓细胞的制备
<ol>
	<li>在移植前1至2小时，处死一只Lys-EGFP小鼠（先使用二氧化碳，随后进行颈椎脱位）。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒动物体表。</li>
	<li>使用手术剪在双侧后肢踝部周围做皮肤切口，并用手术镊将皮肤和毛发一同剥离，以暴露干净的肌肉组织。</li>
	<li>使用手术剪尽可能去除腿部肌肉。用剪刀在膝关节和踝关节处剪断骨骼，并用纱布擦拭股骨和胫骨上残留的肌肉组织。将骨骼（两根股骨和两根胫骨）放入含有DMEM加10% FBS的6孔板中。</li>
	<li>在研钵中加入10 mL冰冷的2 mM EDTA PBS，将骨骼研碎，并用移液器吹打以使骨髓细胞成为单细胞悬液。或者，也可使用1 mL注射器从每根骨骼两端各冲洗3次，每次用2 mM EDTA PBS。</li>
	<li>使用70 µm滤膜将骨髓细胞过滤至15 mL离心管中。用2–3 mL PBS冲洗滤膜。以460 × g离心10分钟，弃上清，将细胞重悬于10 mL新鲜DMEM加10% FBS中。</li>
	<li>用血细胞计数板计数骨髓细胞，并将细胞浓度调整为1.5 × 107 个细胞/mL（使用无血清IMDM）。每只动物注射3 × 106 个细胞，体积为200 µL。骨髓细胞中约有1/3为髓系GFP+细胞。将细胞置于冰上保存，待注射时使用。取0.5 × 105 个细胞用于流式细胞术（FACS9）检测GFP表达水平。</li>
</ol>
3. 将 Lys-GFP 细胞移植到 RBPJKO 小鼠中的骨髓移植
<ol>
	<li>将受体小鼠固定于圆孔笼中。使用铯-137辐照仪以致死剂量（1,200 Rad）的γ射线照射小鼠。采用分次剂量方案：傍晚给予900 rads，次日上午给予300 rads（间隔16小时）。</li>
	<li>在第二次照射辐射后5-6小时，将致死剂量辐照的RBPJWT和RBPJKO受体小鼠进行移植。注射从Lys-EGFP小鼠中收获的骨髓细胞，浓度为3 x 10⁶6 每只动物的细胞数 通过 尾静脉注射（参见第2节中关于细胞收获的详细步骤）。</li>
	<li>在不同时间点（24 h以及第2、4、6周）对移植小鼠进行IVFM成像，获取独立的影像队列，具体步骤如下（见第4节） &amp;#38; 5 对于 体内 成像步骤</li>
</ol>
4. 活体成像的手术准备
<ol>
	<li>对手术器械进行灭菌处理，包括两把精细镊子（一把直头，一把弯头）、一把精细剪刀和一把持针器。准备好手术区域，并备齐手术所需的所有用品。</li>
	<li>使用26-28 G针头注射器，通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮混合麻醉剂（赛拉嗪 2.5-5 mg/kg + 乙酰丙嗪 1.0-2.5 mg/kg + 氯胺酮 90-100 mg/kg）。 &#160;手术过程中每15分钟监测动物一次，必要时追加¼原剂量的麻醉剂。</li>
	<li>将小鼠置于合适的热源上（37 °C加热垫，动物需避免与加热垫直接接触），并观察其呼吸频率。</li>
	<li>使用脚趾夹捏反应检查反射。在开始任何手术操作前，确保动物已完全处于麻醉状态。</li>
	<li>使用26-28号针头注射器，向小鼠尾静脉注射荧光血管标记物（Dextran，100 μL，20 mg/mL溶液）。</li>
	<li>对两只眼睛涂抹兽用眼膏。使用小型电推剪修剪动物头部背侧的毛发。涂抹脱毛膏，持续5分钟。用纱布擦去脱毛膏，随后用生理盐水冲洗。使用棉签以70%酒精对清洁后的头皮进行消毒。</li>
	<li>使用精细镊子和剪刀在头皮正中线处做一个小切口（10–20 mm），以暴露下方的颅骨背侧表面。用5-0外科缝线在切口两侧的皮肤上各缝两针固定线，形成皮瓣以暴露颅骨，便于成像。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定，并将其暴露的头皮浸入装有显微镜油的玻璃底培养皿中。将动物转移至多光子成像室。</li>
	<li>将动物放置在显微镜载物台上，使颅骨位于物镜上方的玻璃皿中，然后覆盖37 °C 加热垫（需防止动物直接接触热源）。</li>
</ol>
5. 活体 小鼠颅骨的高分辨率成像
<ol>
	<li>使用经过改造用于多光子成像的倒置共聚焦系统（参见 材料 表格按照制造商说明，将双光子激光器调至830 nm，将20倍水浸、数值孔径0.95的物镜安装至显微镜物镜转盘，并检查激光光束的准直性。 
	注意：此类研究最常使用直立式显微镜系统，但也可采用倒置多光子系统。本研究使用了一种定制设计的无创立体定位装置。尽管目前市场上已有多种适用于直立式显微镜系统的立体定位装置，但尚无专为倒置显微镜系统设计并用于固定小鼠颅骨的商业化立体定位装置。除定制立体定位装置外，也可使用胶带或胶水等不同固定方法将颅骨稳定于物镜上方位置。</li>
	<li>打开图像采集软件。在 &#34;采集设置&#34; 检查面板是否已选择单向扫描模式。将扫描速度设置为 4 μs/像素，帧率为 512 × 512 像素，放大倍数设为 1.5。从可用物镜列表中选择 20X W Na 0.95 物镜，以匹配物镜转换器上的实际物镜。</li>
	<li>访问 &#34;染料列表&#34; 来自 &#34;图像采集控制&#34; 面板并选择 &#34;双光子&#34;. 打开 &#34;光路 &amp;染料&#34; 窗口中选择DM690-980激发二向色镜。通过勾选激光单元2中的复选框，打开双光子激光快门。在 &#34; 显微镜控制器&#34; 窗口，选择 RDM690 镜。</li>
	<li>选择 &#34; EPI LAMP&#34;，选择B/G荧光滤光片组，将物镜聚焦于样本，以中央静脉分叉处（a）和冠状缝（b）为参考，观察血管血流及颅骨骨髓微环境图2A).</li>
	<li>使用非扫描模式采集图像。选择三个外部探测器：PMT 探测器1用于收集胶原的SHG信号（发射滤光片：430/100 nm），GaAsP 探测器2用于收集GFP信号（发射滤光片：525/50），GaAsP 探测器3用于收集TRITC-葡聚糖信号（发射滤光片：605/90 nm）。
	<ol>
		<li>以4 μs/像素的扫描速率进行成像，不进行信号累加，以最小化光毒性。在恒定激光功率下采集图像，调节探测器增益，以充分利用探测器的全动态范围，同时避免明显饱和。</li>
		<li>从颅骨骨髓的6个区域采集组织全层的连续切片（60个1 μm的Z轴堆栈图像）。采用1 μm的步进尺寸、1.5倍放大倍数以及512 × 512像素的帧尺寸（423 µm × 423 µm）。 
		注：对一只小鼠完成成像所需的总时间为1-1.5小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 定量分析
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用专用的 3D/4D 图像定量与可视化软件进行图像定量分析和三维重建（参见材料表）。利用最大强度投影（MIP）、alpha 混合或阴影投射体积渲染算法，对 Z 轴层叠图像进行三维交互式可视化。</li>
	<li>使用&#34;点状对象分割模块&#34;对 GFP 标记的细胞进行分割。应用图像栈算术处理（通道相减）以消除 GFP 细胞的假阳性计数（此步骤可消除在绿色和红色通道中均显示强荧光的骨细胞信号）。</li>
	<li>使用表面分割模块对血管系统和骨表面进行分割。如有需要，可通过调用名为&#34;点至表面距离&#34;的 X-tension 算法，计算细胞与上述任一表面之间的距离。</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种优化的实验设计，用于通过活体荧光显微镜研究造血细胞植入的动力学过程。在本研究中，通过骨髓移植（BMT）后追踪Lys-GFP阳性髓系细胞在RBPJWT或RBPJKO受体小鼠颅骨骨髓中的情况，观察髓系祖细胞在野生型（WT）骨髓或Notch信号缺陷型骨髓中的扩增过程。该方法可作为一种模型，用于解答类似科学问题，例如：i）利用携带谱系特异性启动子驱动GFP或Tomato-red表达的造血细胞作为供体细胞，确定淋巴系、红系或巨核细胞系等其他谱系细胞在骨髓微环境中的扩增及定位；ii）通过使用其他特定基因敲除（KO）或转基因小鼠作为受体，评估不同微环境因素对造血细胞行为的影响。
该颅骨成像方案的优势在于，用于选择骨髓区域的解剖标志——中央静脉分叉处和冠状缝——在所有小鼠中均具有较好的保守性，因此可在不同个体实验之间保持一致性，同时无需使用自动载物台。此外，利用GFP模型追踪造血细胞被证明非常有效，因为GFP在非理想条件下（如照射后）仍能提供稳定的信号。最后，所描述的成像系统采用倒置显微镜和定制的立体定位装置，使小鼠处于仰卧位，可极大程度地减少呼吸伪影。
<p class=...

活体多光子荧光显微镜（IVFM）是一种强大的成像技术，可在高达1 mm的深度范围内实现组织的高分辨率、实时成像，具体深度取决于组织类型。当应用于小鼠颅骨时，该技术能够以非侵入方式观察骨髓（BM）内造血细胞的行为，成像深度可达60–100 μm11。本研究利用该方法测定正常髓系前体细胞在缺乏经典Notch信号通路的RBPJ基因敲除小鼠骨髓中植入的动力学过程。
我们课题组近期的研究表明，骨髓微环境中经典的Notch信号通路功能缺陷会导致类似骨髓增殖性疾病的表型12。本研究通过使用Mx1-Cre介导的重组技术，条件性地删除RBPJ的DNA结合结构域，从而阻断经典的Notch信号通路，其中RBPJ是经典Notch信号通路下游的关键转录因子10。本研究采用了Mx1-Cre/RBPJlox/lox小鼠模型。条件性删除RBPJ的DNA结合基序会导致所有Notch受体信号的丧失。在Mx1-Cre模型中，Cre的表达由Mx1启动子驱动，该启动子在给予聚肌胞苷酸（polyI:C）后被激活，从而在血液细胞以及包括骨髓、脾脏和肝脏在内的多个器官的基质成分中诱导靶基因的删除。
经polyI:C诱导的Mx1-Cre+/RBPJlox/lox和Mx1-Cre-/RBPJlox/lox小鼠（此后分别称为RBPJKO和RBPJWT）接受致死性照射后，移植了正常的野生型造血细胞。自移植后第4周起，RBPJKO受体小鼠出现显著的白细胞增多，随后发生脾肿大。尽管在移植后第8周及更晚时间点，RBPJKO小鼠骨髓中髓系祖细胞的比例升高，但在移植后第4周和第6周对骨髓的分析并未显示其髓系细胞含量与对照组RBPJWT受体小鼠相比有显著差异。该观察结果，结合Mx1-Cre在不同造血器官中均有表达的事实，引发了关于骨髓微环境是否对髓系增殖表型的起始具有直接影响的疑问。
为了确定骨髓（BM）是否为疾病发展的关键初始部位，采用小鼠颅骨活体荧光显微成像（IVFM）结合骨髓移植（BMT）、RBPJ基因敲除模型以及细胞谱系示踪系统进行研究。使用在特异性溶菌酶启动子控制下表达EGFP的转基因小鼠（Lys-GFP）9 获取供体细胞，以便在BMT后通过骨髓成像进行可视化观察。溶菌酶的表达特异性地存在于髓系细胞中，Lys-GFP可标记从共同髓系祖细胞（CMP）到成熟粒细胞的各个阶段细胞13。
在不同时间点对骨髓进行IVFM分析显示，Lys-GFP细胞向RBPJWT和RBPJKO受体骨髓的归巢情况相似，但在RBPJKO受体骨髓中的扩增和植入速度更快。这种差异在较早的时间点（第2周）尤为显著，随后随时间推移而减小（第4周和第6周）。然而，在这些较晚的时间点，对同一受体造血区室的评估显示，RBPJKO小鼠外周血中循环及脾脏中定位的髓系细胞数量持续增加，表明骨髓向循环系统输出细胞的能力增强。对移植小鼠在第6周时骨髓中Lys-GFP细胞定位的分析显示，在RBPJKO微环境中，髓系细胞位于较对照组更远离血管的位置。
综合来看，体内荧光显微成像技术（IVFM）与这些特定动物模型的结合，为研究髓系细胞在RBPJ基因敲除骨髓微环境中的植入动态提供了深入见解。本文所述的实验设计与定量分析方法可作为一种范式，用于解答类似科学问题。例如，采用其他细胞谱系特异性的示踪模型，如RAG1-GFP14或Gata1-GFP15小鼠，可分别用于追踪淋巴系或红系前体细胞在骨髓中的行为。

<table><tbody><tr><td>氯胺酮混合液</td><td>IU 医学院</td><td></td><td>氯胺酮 90-100 mg/kg，赛拉嗪 2.5-5.0 mg/kg，乙酰丙嗪 1.0-2.5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC 葡聚糖</td><td>Tdb 咨询公司</td><td>TD150-100mg</td><td>可使用其他颜色的葡聚糖。</td></tr><tr><td>安德斯修毛器</td><td>布雷因特里科学公司</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>纱布海绵</td><td>Med Vet 国际公司</td><td>PK224</td><td>四层，2 英寸 × 2 英寸</td></tr><tr><td>Nair 脱毛膏</td><td>商业商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Med Vet 国际公司</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0.9% 氯化钠塑料瓶装</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>14-826-79</td><td>28 号针头，1/2 cc 容量</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>直头镊子，弯头镊子</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>精细科学工具公司</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线</td><td>菲舍尔科技公司</td><td>MV-682</td><td>可使用其他非吸收性缝合线</td></tr><tr><td>WillCo- 玻璃底培养皿</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜油</td><td>徕卡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>立体定位支架插件&amp;nbsp;</td><td>IU 医学院</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000 共聚焦显微镜系统&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 物镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型加热垫</td><td>商业商店</td><td></td><td>Zoo Med 爬行动物加热垫</td></tr><tr><td>Imaris 8.1 成像软件</td><td>Bitplane</td><td></td><td>三维/四维图像可视化与分析软件</td></tr></tbody></table>

结合活体荧光显微镜（ivfm）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

越来越多的证据表明，正常的造血过程受到骨髓（BM）中不同微环境信号的调控，这些信号包括能够调节造血干细胞（HSC）关键功能的特化细胞生态位1,2事实上，现在正逐步揭示出造血微环境更为详细的图景，其中骨内膜微环境和血管内皮微环境共同构成调控正常造血干细胞（HSC）及其子代细胞的功能性单位。3,4,5新研究揭示了血管周围细胞、脂肪细胞和神经元细胞在维持和调控造血干细胞功能中的重要作用6,7,8此外，有证据表明，来自不同谱系的细胞 即 髓系和淋巴系细胞在骨髓微环境中特定的生态位中定居并长期存在。然而，对骨髓微环境及其所含细胞的全面图谱绘制仍在进行中。
现已提供表达谱系特异性荧光标记的转基因小鼠品系，或经基因工程改造、在骨髓微环境特定细胞中缺失选定分子的小鼠。结合移植技术，基因敲除与谱系示踪模型为深入解析特定分子在骨髓微环境中的功能提供了有力工具 &#34;生态位&#34; 用于定义造血细胞群体（如造血干细胞、B细胞、T细胞、髓系细胞和红系细胞）的分析。通过结合颅骨的双光子显微镜成像，该策略可进一步增强。 体内 高分辨率成像与BM颅骨的三维重建，使我们能够精确定位特定造血细胞亚群在骨髓中的归巢位置，并评估其随时间扩增的动力学特征。此处使用Lys-GFP转基因小鼠（标记髓系细胞）9 以及RBPJ基因敲除小鼠（缺乏经典Notch信号通路）10 与IVFM联用，以确定髓系细胞在Notch缺陷型骨髓微环境中的植入情况。

在不同时间点（移植BM Lys-GFP细胞后24小时以及2、4和6周）对2只RBPJKO和2只RBPJWT受体小鼠组成的队列，在单独的成像实验中进行成像（流程见图1A）。
在每只小鼠中，图像均采集自颅骨骨髓的6个标准区域，这些区域根据其中央静脉分叉处的位置来确定图2A, a）和冠状缝合线（图2A，b）。成像前注射Dextran Texas-Red可识别这些标志点，并从中选择6个区域（图2A左上、中上、右上（UL、UM、UR），左下、中下、右下（LL、LM、LR）。60 × 1 μm 从每个区域采集z轴层叠图像，并重建成三维最大强度投影（MIP），图2B）；三维阴影投影，包含由二次谐波生成（SHG）显微技术探测胶原组织所产生的骨成分（灰色）<strong...

通过颅骨的活体荧光显微镜（IVFM）结合遗传性动物模型，用于研究造血细胞归巢并植入骨髓（BM）微环境的过程。

结合活体荧光显微镜（IVFM）与遗传模型研究造血细胞向骨髓微环境植入的动态过程

越来越多的证据表明，骨髓中正常的造血作用受到特定微环境信号的调控，这些信号包括特化的细胞……

本实验的总体目标是可视化并测量移植血液细胞在受体骨髓微环境中的体内植入情况。该技术的主要优势在于能够观察移植后供体造血细胞的归巢、扩增以及向不同骨髓微环境定位等细胞过程。结合基因工程动物模型使用时，该方法有助于阐明造血细胞再生所依赖的关键分子通路。与组织学或其他成像技术不同，活体显微镜技术能够在活体动物中以细胞水平实时捕捉细胞间的相互作用。我们决定采用该方法来确定骨髓微环境是否为Notch信号通路缺失所导致的骨髓增殖性疾病的最初发病部位。对于初次使用该技术的研究人员而言，面临的挑战包括尽量减少呼吸伪影、最佳地定位和固定头部，以及避免图像饱和。移植前一到两个小时，用70%乙醇喷洒一只裂解的EGFP小鼠。接着，使用手术剪在每条腿踝部周围的皮肤上做切口，并用手术镊子将皮肤和毛发一起去除，以暴露干净的肌肉组织。尽可能多地去除腿部的肌肉。然后在膝关节和踝关节处切断骨骼，并使用纱布海绵去除股骨和胫骨上残留的任何肌肉组织。将清理后的骨骼放入含有添加了10% FBS的DMEM的六孔板中冲洗。随后将四根后肢骨转移至装有10毫升PBS中配制的冷EDTA的研钵中，并用研杵碾碎骨骼。将骨髓细胞吹打重悬以获得单细胞悬液，并通过70微米滤膜过滤至15毫升离心管中。用2至3毫升PBS冲洗滤膜。随后离心细胞，并将沉淀重悬于10毫升含10%FBS的新鲜DMEM培养基中。注射时，先将细胞悬液离心，计数后用无血清的IMDM培养基调整细胞浓度至每毫升1.5 × 10⁷个细胞。将细胞置于冰上。在第二次照射辐射后5至6小时，向每只受照受体动物的尾静脉注射3 × 10⁶个骨髓细胞。加入相应移植后时间点。将麻醉后的受体小鼠置于37摄氏度加热垫上，并确认其对脚趾夹捏无反应。在动物眼睛上涂抹眼膏，并通过尾静脉注射100 µL相应荧光标记物。接下来，使用小型电动剪毛器去除动物头部背侧的毛发，然后涂抹脱毛膏。五分钟后，用纱布海绵擦去脱毛膏，并用生理盐水冲洗残留的溶液。用浸有70%乙醇的棉签对头皮进行消毒。然后使用精细镊子和剪刀在头皮上做一条10至20毫米的正中皮肤切口，以暴露下方的颅骨背侧表面。使用5-0外科缝线，在切口两侧各放置两根固定缝线，形成皮瓣以暴露颅骨用于成像。在暴露的颅骨上滴加一滴油。将小鼠置于仰卧位，把暴露的头皮浸入装满显微镜油的玻璃底培养皿中。然后将动物放置于多光子成像台上，使颅骨位于物镜上方，并用37摄氏度的加热垫覆盖动物。在进行多光子图像采集过程中，必须确保头部保持在正确位置并稳定不动。根据需要使用立体定位仪或胶带固定小鼠。使用经过改造用于双光子成像的倒置共聚焦系统，将双光子激光器调谐至830纳米。接着，打开相应的图像采集软件。在采集设置菜单下，确认已选择单向扫描模式，并将扫描速度设置为每像素 4 微秒，帧速率为 512×512 像素，放大倍数设置为 1.5。选择 20X 水镜，数值孔径为 0

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

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人源化骨髓微环境的小鼠生物工程构建及其活体成像可视化

本方案描述了在小鼠异种移植模型中向股骨内注射少量造血干细胞或白血病干细胞（包括基因编辑细胞）的方法，该方法不仅能够实现细胞的快速安全移植，还可进行骨髓的系列分析。...

利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

股骨内注射可将少量造血干细胞和祖细胞（HSPCs）直接植入骨髓腔，从而实现细胞的移植。本文介绍了一种将人HSPCs通过股骨内注射移植到免疫缺陷小鼠体内的实验方案。...

向免疫缺陷小鼠股骨内注射人造血干细胞和祖细胞

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颅骨骨髓血管动态的活体纵向成像

学习活体荧光显微镜结合遗传模型研究造血细胞归巢与植入骨髓生态位的动态过程。该技术可实时可视化细胞行为，揭示骨髓微环境在造血再生中的关键作用。

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