一种简单的流式细胞术方法用于检测全血中单核细胞亚群的葡萄糖摄取及葡萄糖转运蛋白表达

本方法学的总体目标是测量不同单核细胞亚群对葡萄糖及其转运蛋白的摄取。该方法可用于解答免疫学领域中的关键问题，例如免疫细胞代谢在疾病转归中的重要性如何？这些技术的主要优势在于操作快速、简便，无需使用反应性材料，且仅需少量血液样本。

采集血液样本后一小时内，将含有枸橼酸ACD-B抗凝剂的样本管放入生物安全柜中。随后，从每个样本中吸取100微升血液加入单独的聚丙烯管中，并在冰上加入2毫升1倍浓度的裂解液，轻轻吹打混匀。15分钟后，离心细胞，随后再用洗涤缓冲液洗涤两次。

第二次洗涤后，使用移液器小心吸除尽可能多的上清液，并将沉淀物重悬于100 µL预冷的洗涤缓冲液中，置于冰上。为鉴定特定的单核细胞亚群，每100 µL细胞悬液中加入5 µL相应的抗体进行染色，在冰上避光孵育30分钟。孵育结束后，用洗涤液将样本洗涤两次，然后加入200 µL含0.5%甲醛的PBS溶液固定细胞。

然后，在24小时内使用能够检测四种颜色的流式细胞仪分析细胞。为评估单核细胞亚群的葡萄糖摄取情况，将每个样本中的90微升血液转移至单独的聚丙烯管中，并向血液中加入10微升目标荧光标记葡萄糖类似物。轻轻弹动试管以混匀，并用铝箔包裹样品。

然后，将细胞置于37摄氏度下15至30分钟，随后立即转移至冰上。接着，向各管中加入4毫升FACS裂解液，并离心细胞。随后，在洗涤缓冲液中进行第二次离心。

弃去上清液，在4摄氏度避光条件下，用适量的目标抗体对细胞染色30分钟。随后，用4毫升冰预冷的洗涤缓冲液洗涤样本，将细胞沉淀重悬于200至300微升冰预冷的PBS中，并在10分钟内完成上机分析。进行流式细胞术分析时，应首先使用未染色及单染对照样本设置补偿。

接下来，在合适的单细胞分析软件中，在前向散射光与侧向散射光散点图中打开第一个样本，并如图所示圈选单核细胞。然后，双击已圈选的单核细胞群体，圈选CD3阴性细胞群。接着双击CD3阴性细胞群，将x轴设置为显示CD14染色，y轴设置为显示CD16染色。

接下来，为了测量特定单核细胞亚群对葡萄糖或其转运蛋白的摄取情况，需生成相应的直方图。然后，在已定义细胞群的情况下，使用对照 FITC IgG 样品设门，以确定各样本中 CD14 阳性单核细胞的总百分比。此处展示了通过细胞散射特性进行单核细胞分离以及通过设门于 CD3 阴性群体来排除 T 细胞的初始设门策略。

然后对单核细胞进行CD14表达的设门，或联合CD16以鉴定总单核细胞或单核细胞亚群。可观察到CD14阳性且葡萄糖转运蛋白Glut-1阳性的不同单核细胞群体，这一现象在来自HIV阳性个体的循环白细胞中尤为显著。在HIV阴性个体的特定单核细胞亚群中也可观察到CD14阳性且Glut-1阳性的细胞，但此类细胞群体在HIV阳性患者中更为明显。

根据葡萄糖转运蛋白的表达数据，可以预期葡萄糖类似物 2-NBDG 在 HIV 阳性个体来源的细胞中也会被更大量地摄取。若操作得当，掌握该技术后可在一个半小时内完成实验。在进行该操作时，重要的是要避免所有区域暴露于光照下。

在检测葡萄糖类似物摄取后，可使用细胞表面抗体对细胞进行染色，以鉴定您感兴趣的特定免疫细胞亚群。该方法建立后，可用于研究HIV如何影响免疫细胞的代谢，也可被其他领域的研究人员应用于免疫学、病毒学和癌症研究等不同领域。观看本视频后，您应能够充分掌握如何检测免疫细胞中葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter one）及葡萄糖摄取的方法。

请注意，在处理传染性病原体时，应遵循标准的安全操作规程。