Name: 体外转录测定及其在药物研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习体外转录测定技术，用于研究细菌转录调控机制及抗菌药物抑制作用。该方法通过RNA测序凝胶直接可视化转录产物，为分子生物学和新型抗菌药物筛选提供可靠平台。

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本工作得到了纽卡斯尔大学教师职业早期资助（CM）的支持。

注意：实验涉及放射性同位素 32P 的使用，必须在满足所有适当的安全条件后方可开展任何操作。通常要求实验人员在使用放射性试剂前参加安全培训课程并接受监督下的实践训练。进行反应时，请穿戴个人防护装备（热释光剂量计、护目镜、手套、放射性实验室专用外套、长裤、封闭式鞋头的鞋子）。
1. 检测材料的准备
<ol>
	<li>获取转录实验所需的蛋白质。
	<ol>
		<li>在此实验中，过量表达并纯化 E. coli 实验室中所描述的RNAP11，或从商业来源获取（材料清单）。 
		注意：两种方法结果相似。也可采用其他方法纯化天然型或亲和标记的RNAP12,13σ/NusA 因子的获取方法可参见之前的研究工作14,15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理水的制备 
	注意：也可从商业渠道获取无RNase的水（材料列表）。
	<ol>
		<li>向1 L纯化水中加入1 ml焦碳酸二乙酯（DEPC）（0.1% v/v），混匀后过夜。</li>
		<li>将DEPC水和枪头高压灭菌两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA模板制备
	<ol>
		<li>纯化质粒pSG115416 和/或 pIA22617 使用质粒纯化试剂盒（材料清单），按照制造商说明书进行操作。</li>
		<li>扩增用于加尾转录实验的模板（一个包含360 bp片段的区域） P木糖 启动子区域），在冰上配制PCR反应体系，包含25 μl 2x PCR混合液（材料列表）、各2 μl引物（5 µM）：5′-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3′（正向）和5′-CCCATTAACATCACCATC-3′（反向）、1 μl pSG1154质粒样品（250 µM）以及20 μl纯水。
		<ol>
			<li>或者，对于单轮转录实验，扩增一个包含λ的447 bp片段 PR pIA226的启动子区域17在冰上配制PCR反应体系，包含25 μl 2x PCR混合液、各2 μl引物（5 µM）：5′-GTGCTCATACGTTAAATCT-3′（正向）和5′-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3′（反向），以及1 μl pIA22617 质粒制备（250 µM）和20 μl纯化水。 
			注意：该模板在 +26 nt 位置之前缺少胞嘧啶，+26 nt 位置是第 26th 转录起始位点下游的核苷酸。因此，当反应体系中仅存在ATP、UTP和GTP时，以此模板进行转录可实现转录起始、启动子逃逸，并在+26 nt位置停滞，形成稳定的转录延伸复合物（EC）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置PCR反应条件：95 °C 预变性30秒，50 °C 退火30秒，72 °C 延伸30秒，共循环30次。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒（见材料清单），按照制造商说明书纯化产物，并用100 μl转录缓冲液洗脱，用于转录实验。</li>
		<li>使用荧光分光光度计（见材料清单）测定模板DNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NTP 制备 
	注意：NTPs 可从不同商业来源获得（材料列表）。
	<ol>
		<li>将NTPs（纯度≥99%）溶解于经DEPC处理的水中，配制成1 M储存液，分装1 ml该溶液至1.5 ml离心管中（每管50 μl），于-20 °C保存。</li>
		<li>α-顺序32P UTP（3,000 Ci/mmol）在实验前 32P 的半衰期较短，为 14.29 天。 
		注意：使用α标记的UTP可避免比较不同长度条带的强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA分子量标准物制备
	<ol>
		<li>在室温下配制以下反应体系：0.5 μg RNA模板混合物（材料列表）、80 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）、12 mM MgCl₂、1 mM each of ATP、CTP、GTP和UTP、10 mM DTT、40 U RNase抑制剂、20 U T7 RNA聚合酶。2，10 mM NaCl，10 mM DTT，2 mM ATP/CTP/GTP，0.5 mM UTP，2 μl α-32P UTP，0.5 μl T7 RNAP（材料列表），DEPC处理水补至20 μl。</li>
		<li>37 °C 反应 1 小时。立即使用或于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNA测序凝胶的制备
<ol>
	<li>凝胶制备
	<ol>
		<li>用70%乙醇和纯化水将测序凝胶装置（材料列表）的玻璃板清洗两次，并用梳子和两个垫片组装成凝胶槽。 
		注意：可在其中一块玻璃板上涂覆硅化试剂（材料列表），以便在步骤4.2中更容易取出凝胶。</li>
		<li>使用磁力搅拌器将33.6 g尿素溶解于22 ml水和16.4 ml 5×Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液（1 L水中含54 g三（羟甲基）氨基甲烷；27.5 g硼酸；10 ml 1 M乙二胺四乙酸（EDTA），pH 7.4）中。</li>
		<li>向尿素溶液中加入16 ml 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19:1），并通过0.45 µm滤膜过滤。</li>
		<li>向滤过的溶液中加入514 µl 10%（w/v）新配制的过硫酸铵水溶液，随后加入51.4 µl N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）。</li>
		<li>轻轻倒置混合液以避免过度起泡，并立即从水平放置的预装测序槽底部的加样孔平缓注入。注胶时应注意避免产生气泡。</li>
		<li>室温静置1–1.5小时，待凝胶完全聚合后即可用于转录实验。若用浸湿的纸巾覆盖测序槽顶部后密封，凝胶可在室温下保存两至三天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 转录反应
<ol>
	<li>转录延伸暂停实验
	<ol>
		<li>转录延伸复合物的形成
		<ol>
			<li>向一个1.5 ml离心管中加入1 µl RNAP核心酶（转录缓冲液中1 µM储存液）。</li>
			<li>向RNAP中加入1 µl纯化的σ-70因子（σ70；转录缓冲液中3 µM储存液），冰上孵育10分钟，以形成RNAP全酶。</li>
			<li>向RNAP全酶中加入3 µl纯化的模板DNA（500 nM，转录缓冲液中，来自pIA226 PCR产物的λ PR启动子），37 ºC孵育5分钟，以形成开放复合物。</li>
			<li>在另一个1.5 ml离心管中配制反应组分混合液：加入5 µl 10×转录缓冲液（材料清单：400 mM Tris-HCl、1.6 M KCl、100 mM MgCl2、10 mM DTT、50%甘油，DEPC处理水中配制，pH 7.9），2 µl每种250 µM GTP和UTP，1 µl 1 mM ATP，以及1 µl α-32P UTP（3,000 Ci/mmol）。用DEPC处理水补至41 µl。 
			注意：可使用RNase抑制剂（材料清单）以尽量减少RNase污染。</li>
			<li>将上述混合液转移至含有开放复合物的离心管中，37 ºC孵育15分钟，以形成停滞在+26 nt位置的转录延伸复合物。</li>
			<li>将反应体系转移至室温（约21 °C），加入1 µl 2.5 mg/ml利福平，终浓度为50 µg/ml。</li>
			<li>向反应体系中加入1 µl 0.1 mM纯化的NusA蛋白，室温孵育5分钟。</li>
			<li>向反应体系中加入2 µl 250 µM CTP，使终体积为50 µl，并使用计时器记录反应时间。</li>
			<li>在30、60、120、240、480和1,200秒时，分别取5 µl反应液加入2 µl RNA上样缓冲液（95%甲酰胺、0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯蓝）中以终止反应。</li>
			<li>将使用过的含32P UTP的枪头和离心管丢弃至放射性废物容器中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转录起始实验
	<ol>
		<li>开放复合物的形成&#160;
		<ol>
			<li>将纯化的σ70稀释至0.5 µM。</li>
			<li>使用0.5 µM（而非3 µM）的纯化σ70以及DNA模板（来自pSG1154 PCR产物的Pxyl启动子区域），重复步骤3.1.1.1至3.1.1.3。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转录起始抑制实验
		<ol>
			<li>在加入σ70之前（即步骤3.1.1.1之后），将设计用于阻止RNAP全酶形成的抑制剂加入RNAP核心酶中，随后进行步骤3.1.1.2和3.1.1.3，以检测该抑制剂是否能够破坏全酶的形成。</li>
			<li>或者，在步骤3.1.1.2之后加入抑制剂，以检测其是否能够竞争性抑制σ70与RNAP的结合。</li>
			<li>在对照反应中，使用与抑制剂储存液等体积的DMSO（抑制剂溶剂）代替抑制剂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>反应的完成
		<ol>
			<li>将肝素溶于水中，配制成1 mg/ml的储存液，并于-20 °C保存。 
			注意：肝素是一种DNA竞争性分子，可结合未形成开放复合物的RNAP。一旦开放复合物形成，肝素无法进入RNAP的DNA结合位点，因此不能抑制已形成的开放复合物的转录。因此，肝素仅用于单轮转录实验；多轮转录实验中无需使用。</li>
			<li>配制反应混合液：加入5 µl 10×转录缓冲液（材料清单）、1 µl 1 mg/ml肝素溶液、1 µl每种10 mM ATP、GTP和CTP、2.5 mM UTP，以及1 µl α-32P UTP（3,000 Ci/mmol）。用DEPC处理水补至45 µl。</li>
			<li>将反应混合液与转录开放复合物混合，短暂离心后于37 °C孵育20分钟。</li>
			<li>取10 µl反应液加入5 µl RNA上样缓冲液（95%甲酰胺、0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯蓝）中以终止反应。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. RNA 凝胶电泳与显影
<ol>
	<li>运行变性聚丙烯酰胺凝胶
	<ol>
		<li>在50 ºC和50 W条件下，使用1x TBE缓冲液运行凝胶约1.5小时，直至凝胶和缓冲液的温度稳定在50 ºC。</li>
		<li>将样品在90 ºC加热30秒，然后立即置于冰上，再上样至凝胶。</li>
		<li>将样品加载到凝胶顶部的加样孔中，同时设置一泳道加入2 µl RNA分子量标记物（1:100稀释）。</li>
		<li>在50 W和50 ºC条件下，使用1x TBE缓冲液继续电泳，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶约2/3处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶处理
	<ol>
		<li>缓慢而小心地打开测序装置，将上层玻璃板与下层分离。操作时需格外注意，避免凝胶破裂。</li>
		<li>将层析滤纸（见材料列表）裁剪至与凝胶大小一致，从凝胶顶部至溴酚蓝染料位置。使用盖革计数器确认放射性标记RNA转录本的大致位置。</li>
		<li>小心地将滤纸覆盖在凝胶表面，并用力按压，使凝胶牢固粘附于滤纸上。将凝胶底部切下并作为放射性废物丢弃，因为未掺入的NTP会迁移至凝胶底部，可能具有高放射性。</li>
		<li>将一块大小相似的滤纸放置在真空干燥仪的加热板上，然后小心地将带有凝胶的一面朝上平铺于其上。</li>
		<li>用塑料膜覆盖凝胶表面，在60 °C下干燥1.5小时。</li>
		<li>将带有凝胶的滤纸另一面也用塑料膜包裹，然后放入成像盒中的光激发荧光成像板上，根据反应效率选择适当的曝光时间，通常为1小时至过夜。</li>
		<li>按照制造商说明，使用成像仪扫描荧光成像板，并依据软件手册使用ImageJ软件分析条带相对强度。</li>
		<li>使用盖革计数器检测工作区域是否存在放射性污染，对可疑物品和区域用纸巾和清洁剂擦拭，并将纸巾丢弃至指定废物容器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在所有生物体中，转录是一个受到严密调控的过程。In vitro 转录实验已被开发出来，用于测试转录因子、小分子以及转录抑制剂的作用效果。本文介绍了一种通用的细菌转录实验方法。将转录实验与转录产物的测序凝胶电泳相结合，对于机制研究具有重要意义，因为它能够沿时间线可视化所有转录产物。因此，该方法能够识别反应条件中微小变化所产生的影响，并揭示可能的作用机制。此外，针对作用机制未知的转录因子，设计特定的转录实验也成为可能。
本文还描述了一种用于验证RNAP全酶形成抑制剂作用机制的方法。此处所述方法能够展示每种RNA转录本随时间的变化，经过适当修改后，还可用于针对转录各阶段测试抗菌剂的作用效果。多轮转录实验可作为相对简便的筛选方法，用于发现新的靶向转录过程的抑制剂；而单轮转录实验则可用于研究抑制剂的作用机制，例如判断其为竞争性或非竞争性抑制。需要注意的是，在药物发现过程中，小分子聚集可能导致假阳性结果，表现为非竞争性抑制剂，而单轮实验的机制研究可为从苗头化合物到先导化合物的评估提供全面的分析手段。因此，该受控的转录体系能够精确揭示抑制剂对转录过程的影响，有助于合理化 <em...

转录是以特定DNA序列为模板合成RNA的过程。在真核细胞中存在三种不同的RNA聚合酶（RNAP）：RNAP I负责转录rRNA前体，RNAP II负责mRNA及某些小核RNA的合成，而RNAP III则负责5S rRNA和tRNA的合成。在细菌中，仅有一种RNA聚合酶负责所有类型RNA的转录。转录过程包括三个阶段：起始、延伸和终止。转录是细胞内受到高度调控的重要过程之一。 转录循环中的每个阶段均为基因表达调控的关键检查点1。在起始阶段，RNA聚合酶必须与σ因子结合形成全酶，该全酶可引导酶识别并结合到特定的启动子区域，形成开放的启动子复合物2。随后，在延伸和终止阶段，大量转录因子参与调控RNA聚合酶的活性。本文所研究的转录因子是高度保守且必需的蛋白质NusA，其参与调控转录暂停与终止过程，并在rRNA合成过程中发挥抗终止作用3-5。
体外 转录分析实验已被开发为研究转录过程中复杂调控步骤的有力工具6通常需要包含启动子区域的线性DNA片段作为转录的模板。该DNA模板通常通过PCR扩增或质粒线性化获得。随后加入纯化的蛋白质和核糖核苷三磷酸（NTPs，其中一种为放射性标记的NTP用于检测），经一定时间孵育后分析产物。通过使用适当的模板和反应条件，该方法已被用于研究转录的所有阶段，使过去半个世纪以来对转录过程的分子机制实现了深入的表征。7结合RNAP的三维结构信息，还能够探究抗生素及其先导化合物对转录抑制的分子机制，并利用这些信息开发新型且更有效的药物8-10.
在本研究中，我们提供了利用转录实验确定转录延伸/终止因子NusA调控机制的示例，并展示了如何确定一种新型转录起始抑制剂先导化合物的作用机制。

<table><tbody><tr><td>获得转录实验所需的蛋白质</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>DEPC处理水的制备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion 无核酸酶水</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA模板的制备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>向导&amp;nbsp;加&amp;nbsp;SV Minipreps DNA 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 荧光分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP 制备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>高纯度rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>放射性化合物</td></tr><tr><td>RNA分子量标准物制备&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>凝胶制备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT 核酸测序胶板系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>尿素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>硼酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N',N&#039;&lt;/em&gt;四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>转录实验</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>利福平&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>肝素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>转录缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>沃特曼&amp;nbsp;3MM Chr 层析纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>放射性去污剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>去污</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>凝胶处理</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ 成像仪</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 转录实验及其在药物发现中的应用

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

体外转录实验已开发并广泛应用多年，用于研究转录过程中涉及的分子机制。该过程需要多亚基的依赖DNA的RNA聚合酶（RNAP）以及一系列转录因子，这些因子通过调节RNAP在基因表达过程中的活性发挥作用。对放射性标记的转录产物进行测序凝胶电泳，可提供关于转录如何进行以及哪些参数能够影响转录的详细机制信息。本文中，我们描述了一种研究必需的延伸因子NusA如何调控转录暂停的实验方案，以及一种通过抑制RNAP全酶形成来鉴定靶向转录起始的抗菌剂的方法。这些方法可作为平台，用于开发更多研究手段，以探索作用机制尚不明确的转录因子的功能，以及开发靶向转录过程的新抗菌药物——这一靶点在抗生素研发领域尚未得到充分利用。

通过测量不同时间点条带中的放射性水平，可以确定转录效率。用于检测 NusA 因子功能的暂停实验能够可视化暂停、终止和通读产物（图 1A）。在存在 NusA 的 N 端结构域（NusA NTD；氨基酸残基 1-137）时，与缺乏 NusA 的对照实验相比，RNA 产物的出现显著延迟。当 NusA 片段中缺失氨基酸残基 104-137（螺旋 3），或一系列氨基酸残基（K36、K37、R104、Q108、K111、Q112、Q116 和 R119）被突变为丙氨酸时，NusA 的暂停活性完全丧失。螺旋 3 中的残基 R104 和 K111 被证明对 NusA NTD 的暂停活性至关重要，且 R104A 和 K111A 突变体产生的暂停半衰期值与未添加 NusA NTD 的对照组相似（图 1B）。值得注意的是，缺失螺旋 3 或突变这两个氨基酸残基对 NusA 与 RNAP 的结合无影响15。该结果表明，R104 和 K111 是调控 NusA 暂停活性所必需的关键氨基酸残基。
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在本文中，我们描述了一种用于功能性检测转录过程以及针对细菌转录的抗菌剂抑制活性的实验方案。

体外转录实验已发展并广泛应用多年，用于研究转录过程中涉及的分子机制。该过程……

本体外转录实验的总体目标是提供一个研究转录过程中复杂调控步骤的平台，可用于检测转录因子、小分子以及转录抑制剂的作用效果。该方法有助于解答分子生物学领域的一些关键问题，例如与转录调控相关的精确机制、机制未知的转录因子的功能，以及常规转录抑制剂的作用效果。该技术的主要优势在于，可通过单次RNA测序凝胶电泳，直接可视化展示随时间变化产生的全部转录产物。开始该实验步骤时，先用70%乙醇和纯化水将测序凝胶装置的玻璃板清洗两次。使用梳子和两个垫片组装电泳槽。在磁力搅拌器上，将33.6克尿素溶解于22毫升水和16.4毫升5倍浓度的TBE缓冲液中。加入16毫升40%丙烯酰胺溶液至尿素溶液中，并通过0.45微米滤膜过滤。向滤后的溶液中加入514微升新配制的10%过硫酸铵溶液，随后加入51.4微升TEMED。轻轻翻转凝胶溶液以避免过度充气，并立即从水平放置的预装测序池底部注入口平稳注入。注意注入过程中避免产生气泡。注入后静置1至1.5小时，待凝胶完全凝固后方可使用。开始转录延伸复合物的制备时，向一个1.5微升离心管中加入1微升RNA聚合酶核心酶。向其中加入1微升纯化的σ⁷⁰因子，并在冰上孵育10分钟，以形成RNA聚合酶全酶。随后向RNA聚合酶全酶中加入3微升含有500 nmol/L纯化模板DNA的转录缓冲液，于37°C孵育5分钟，以形成开放复合物。接下来，通过将以下试剂加入一个1.5毫升离心管中，配制反应组分的混合液：5微升10倍转录缓冲液、2微升250微摩尔GTP、2微升250微摩尔UTP、1微升1毫摩尔ATP以及1微升α-P³²标记的UTP。用DEPC处理水将混合液体积补至41微升。将混合物转移至含有开放复合物的离心管中，37摄氏度孵育15分钟，以形成在正26个核苷酸处停止的转录延伸复合物。15分钟后，将反应体系转移至室温，加入1微升浓度为2.4毫克/毫升的利福平，使其终浓度为50微克/毫升。向反应体系中加入1微升0.1毫摩尔的纯化NusA转录因子，室温孵育5分钟。向反应混合物中加入 2 微升 250 微摩尔的 CTP，使最终体积为 50 微升，并使用计时器测量反应时间。在每个时间点，将 5 微升反应溶液转移至 2 微升 RNA 凝胶加样缓冲液中以终止反应。在进行样品电泳前，使用 1×TBE 缓冲液在 50 摄氏度、50 瓦条件下预电泳约 1.5 小时，直至凝胶和缓冲液的温度稳定在 50 摄氏度。预运行结束后，将样品在90摄氏度下加热30秒，然后转移至冰上。在凝胶顶部的第一个加样孔中加入2微升RNA分子量标记物，随后将样品与标记物并列加入加样孔中。在1×TBE缓冲液中，以50瓦特功率和50摄氏度条件电泳约1.5小时，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶约2/3处。当电泳结束后，缓慢打开两块凝胶板，小心地将上层板从测序装置中分离，注意避免损坏凝胶。将层析滤纸剪裁至与凝胶大小一致，从凝胶顶

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

体外转录测定及其在药物研究中的应用

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一个 体外 通过酶法测定镓(III)和氢对转录抑制作用的实验方案3 5,10,15-三(五氟苯基)corrole

此处，结合实时监测肿瘤细胞代谢， 体内 用于评估新型抗癌靶点或药物能否增强肿瘤细胞对DNA损伤类化疗药物敏感性的转移模型，包括鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型。...

评估癌症药物增敏效果 体外 和 体内

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靶向治疗药物耐药现象普遍存在，因此在临床出现耐药前后识别其潜在机制，对于指导替代性的临床管理策略至关重要。本文介绍了一种联合建立耐药细胞系的实验方案 体外...

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我们介绍一种利用体外转录RNA为基础的荧光素酶报告基因检测方法，用于研究痘病毒感​​染细胞中mRNA翻译的调控。该检测方法可用于研究mRNA的顺式作用元件（cis-elements）对翻译的调控，包括5’-非翻译区（UTR）和3’-UTR。此外，该方法也可用于分析不同的翻译起始模式。...

基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测法研究痘病毒感染细胞中的翻译调控

在此，我们提出一种用于 体外...

体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

基于转录组学的低成本药物筛选

学习体外转录测定技术，用于研究细菌转录调控机制及抗菌药物抑制作用。该方法通过RNA测序凝胶直接可视化转录产物，为分子生物学和新型抗菌药物筛选提供可靠平台。

体外转录实验及其在药物发现中的应用

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