Name: 高分辨率成像定时，并在活体人脐静脉内皮细胞微管动力学自动分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学习使用活细胞延时成像技术在人脐静脉内皮细胞中分析微管动力学和细胞迁移的方法。该方案有助于研究细胞骨架动态和血管生成过程中的细胞行为。

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特别感谢 Clare M. Waterman 博士在指导和讨论方面的帮助，感谢 Michelle Baird 和 Mike Davidson 提供了本研究中使用的多种荧光 cDNA 载体，感谢 Kathryn Applegate 和 Gaudenz Danuser 开发了用于微管分析的 plusTipTracker 软件。本工作部分由美国国家心肺血液研究所（NHLBI）和美国国立卫生研究院（NIH）向 K.A.M 提供的资助支持（资助号：4K22HL113069）。

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在形态学与迁移实验中使用 HUVEC。 
为了测量和评估微管生长及 HUVEC 形态的变化，并将这些变化归因于细胞外基质（ECM）信号刺激，对表达 EB3 标记微管的 HUVEC 进行活细胞成像时，需要具备适当且可重复的细胞培养条件。HUVEC 是研究细胞形状与运动性的理想模型。它们易于转染荧光标记的 cDNA，对可溶性及物理性信号刺激均表现出显著的形态变化，并且在适当的细胞培养条件下能够自我组织形成血管样管状结构65-70。原代细胞培养物（如 HUVEC）需要谨慎操作，并密切监测细胞传代次数，以确保细胞处于健康状态，并在实验过程中表现正常。例如，在开展研究细胞骨架和/或细胞形态的实验时，HUVEC 的传代次数不应超过第十代，因为通常在第十二至十五代时，HUVEC 开始出现形态不均一的现象。
细胞密度也是调节 HUVEC 健康和增殖的关键因素。在 HUVEC 分支研究（见上述方案 10.1-10.4）中，采用相对较低的细胞密度培养，以提供细胞足够的物理空间，使其能够与细胞外基质（ECM）相互作用并延伸出分支状突起。相比之下，在伤口边缘迁移研究（见方案 10.5-10.8）中，HUVEC 在划痕前以单层形式培养。因此，伤口边缘的 HUVEC 呈现相对非分支的形态，伸出前缘突起，并在迁移进入伤口区域时与其相邻细胞发生细胞-细胞相互作用。
在活体 HUVEC 中追踪微管动态的注意事项与优势。 
转盘共聚焦显微镜是一种理想的方法，适用于需要在高时间分辨率下获得共聚焦图像清晰度的实验假设验证。配合适当的相机和激光模块，该显微技术对低强度荧光发射具有高灵敏度，相较于其他类型的荧光显微镜，有助于减少光漂白。尤为重要的是，该方法同样适用于中等到高时间分辨率的成像，这对于利用 EB3 标记方法在多种不同细胞类型中全面测量微管生长动态至关重要。
尽管利用EB3标记微管（MT）生长正端的方法相较于其他荧光标记MT的方法具有明显优势，但也存在独特的局限性。例如，在任何给定时间，部分MT阵列并不处于活跃生长状态，其中包括正在解聚的MT群体以及稳定、非动态的MT群体71-74。EB3无法标记这两类MT群体，因此它们在实验数据分析中所起的作用将不会被纳入。评估完整MT阵列的替代方法主要依赖于表达荧光标记的微管蛋白（tubulin），该蛋白可掺入所有类型的MT中，从而能够识别出正在生长、缩短或保持稳定的MT。然而，由于细胞中心区域及邻近微管组织中心（MTOC）处MT阵列的密度相对较高，对整个MT阵列进行标记会使得对远离细胞周边区域的MT末端进行图像分析变得困难75-77。在活细胞中采用荧光微管蛋白与荧光EB3双色共标记的实验已定性表明，绝大多数被微管蛋白标记的MT同时也被EB3标记78。此外，目前尚无高效的方法可对用荧光微管蛋白标记的MT进行自动追踪。这意味着在表达荧光微管蛋白的细胞中，收集MT动态数据和测量结果需要人工逐个追踪单个MT，这一过程既容易出错又十分繁琐。因此，对EB3标记的MT进行自动化计算分析已成为测量MT动态的首选方法，因其可广泛应用于多种细胞类型及不同实验条件下的MT动态研究35,79。
将微管生长动态与 HUVEC 形态及迁移相联系。 
从细胞骨架研究者的角度来看，plu sTipTracker 自动追踪分析的一个极为有用的改进是能够测量和评估整个细胞以及特定区域的微管生长动态变化。细胞极化是实现定向迁移的基本前提条件。因此，极化信号通路长期以来被认为是驱动细胞定向迁移的关键因素30,31,51,54,56,80,81。例如，可溶性信号分子如 VEGF 可诱导内皮细胞中肌动蛋白聚合以及微管向 VEGF 信号源方向的生长2,82-87。此外，在响应与细胞外基质（ECM）的物理相互作用（例如对基质顺应性及维度的机械感知）时，HUVEC 通过局部调控微管相关蛋白（MAPs）来促进在延伸的分支状突起内微管的生长，从而引导 HUVEC 沿信号方向迁移5,31,88。因此，细胞对外部信号刺激产生的极化现象凸显了实验上评估细胞骨架动态局部变化的必要性。
同时对微管（MT）生长动态（使用EB3方法）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移进行活细胞成像极为困难，因为微管的生长发生在秒级时间尺度上，而细胞形态变化和定向迁移则发生在小时级时间尺度上。然而，这两个过程密切相关。此外，在秒级时间尺度上对荧光标记的EB3进行连续快速成像会导致EB3信号发生光漂白。尽管通过每30分钟进行一次短时成像序列（1-2分钟采集）的方法已成功缓解这一问题，但该方法仅能在少数EB3表达水平理想且对重复激光照射无不良反应的内皮细胞（ECs）中实现5。
一种可用于解析微管（MT）生长动态如何影响细胞形态变化和迁移的替代方法是plusTipTracker感兴趣区域（ROI）工具35（见方案6.6）。该方法可将整个细胞内的微管生长轨迹按用户自定义区域进行划分，从而提取并分析特定区域内的微管生长轨迹。例如，对细胞内&#34;分支&#34;区域与&#34;非分支&#34;区域的比较发现，与非分支的细胞周边区域相比，微管在分支区域中的生长速度更慢但持续性更强5。在极化的伤口边缘HUVEC细胞中，对前缘和后缘微管生长动态的比较表明，MCAK介导的微管解聚作用特异性地在前缘受到抑制，而在后缘则不受抑制。进一步对表达Rac1和/或MCAK磷酸化突变体的HUVEC细胞前缘与后缘微管生长动态进行区域性分析发现，Rac1激活的Aurora-A激酶能够特异性且局部地抑制前缘的MCAK活性，从而促进HUVEC的极化和定向迁移31。因此，结合自动追踪微管生长动态与对伤口边缘HUVEC细胞分支突起和/或前缘区域内微管生长动态的区域性评估，使我们能够将微管生长动态与HUVEC的形态和迁移行为联系起来。
本文所述方案旨在为HUVEC的培养和实验研究提供一种通常简便且高度可重复的方法。然而，许多方案细节较为复杂且耗时，因此在实施实验方法时可能出现错误或困难。尽管在方案中已尽量指出了可能遇到的问题，但本文进一步提供了对那些较少见或在方法步骤中仅以简要注释形式提及的问题的详细故障排除建议。
与使用聚丙烯酰胺基质包被盖玻片（方案 2.2）相关的一个常见问题是，该过程涉及多个复杂步骤，包括活化玻璃盖玻片、将聚丙烯酰胺偶联至玻璃表面、活化聚丙烯酰胺，以及随后将细胞外基质（ECM）偶联至聚丙烯酰胺。其中一个特别困难且可能存在风险的步骤是在聚丙烯酰胺包被的盖玻片经 2 mM sulfo-SANPAH 处理后（如上文步骤 2.2.2.6），将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种至纤连蛋白/聚丙烯酰胺凝胶上。在细胞外基质偶联完成后，必须彻底清除实验体系中的 sulfo-SANPAH，这对 HUVECs 在这些基质上的成功培养至关重要。最有效的方法是使用 ddH2O 洗涤，并将盖玻片置于 ddH2O 中在摇床上孵育过夜。如果在聚丙烯酰胺-细胞外基质上培养的细胞无法存活，或细胞活力低于预期，建议在纤连蛋白偶联后（步骤 2.2.2.9）增加并重复 sulfo-SANPAH 的洗涤步骤，以期缓解此问题。
与方案3（cDNA转染及在盖玻片上培养HUVEC）相关，电穿孔实验成功的关键因素之一是在胰蛋白酶消化细胞以从塑料培养瓶中脱离细胞时，以及电穿孔完成后（上述步骤3.3–3.4）对HUVEC的处理。在胰蛋白酶处理过程中必须密切监测HUVEC，避免超过细胞脱离所需的最短时间 &#34;汇总&#34; 在培养瓶表面（通常为1-2分钟）。胰蛋白酶处理时间过长是导致HUVEC死亡的主要原因，这种情况通常在细胞接种至纤连蛋白包被的盖玻片（步骤3.4）后无法贴附于基质时才被发现。
同样重要的是，HUVECs（以及大多数原代细胞类型）在电穿孔缓冲液中长时间悬浮时状态不佳。在较大规模的实验中，例如当实验者需要对五个或更多条件进行电穿孔时，最好将细胞分别离心收集于独立的离心管中（每管对应一次转染），并在电穿孔前逐个将细胞与电穿孔缓冲液混合。这种方法可最大限度地缩短细胞在电穿孔缓冲液中的孵育时间，提高HUVECs的存活率。此外，电穿孔后立即用完全培养基进行复苏也至关重要。电穿孔后若延迟一分钟或更长时间才进行复苏，可能导致HUVECs几乎完全死亡，因此应避免此类延迟。
相关的细胞迁移实验（方案9）中，将HUVECs以极高密度培养的技术依赖于对传统HUVECs细胞培养方法（见方案3）的一项关键改进（见步骤9.2），该改进要求将包被纤维连接蛋白的盖玻片彻底干燥，以便使HUVECs仅在盖玻片的极小区域内生长。通常情况下，如果盖玻片未完全干燥，或先前包被纤维连接蛋白的步骤（步骤2.1或2.2）效率不足，则加在盖玻片上的含细胞培养基会失去表面张力并扩散至盖玻片边缘，从而降低盖玻片上细胞的密度。解决这一潜在问题的方法之一是吸除盖玻片上的培养基，然后将盖玻片（仍置于35 mm培养皿中）放置于生物安全柜后部，静置5–10分钟，利用安全柜内的气流辅助干燥。若风干后盖玻片表面仍可见液体残留，应吸除液滴，并再次于生物安全柜中风干5–10分钟。需要注意的是，目前尚无方法可完全避免该问题的发生，但随着对实验方案的反复操作，该问题会逐渐减少。此外，建议在准备细胞迁移实验（或一般性实验）所用盖玻片时，额外准备若干盖玻片及备用HUVECs，以应对实验过程中可能出现的问题。
在考虑这些故障排除要点的同时，还应强调所讨论方案的实用性及其对未来细胞生物学研究的意义。聚丙烯酰胺方法的应用范围广泛，不仅包括细胞-细胞外基质（ECM）相互作用的二维研究（如上所述），还包括三维研究5。该应用对于增进我们理解人脐静脉内皮细胞（HUVECs）如何在生理环境中调控细胞形态和迁移至关重要，并应为研究人员提供形态学变化如何与细胞骨架变化相协调的基本认识。尽管本文所述方案主要聚焦于微管（MT）生长动态的测量，但其中大多数方案均可并应被调整用于测量细胞-ECM相互作用中其他多种可通过显微镜观测的方面。就微管动态而言，存在大量微管相关蛋白（MAPs），包括至少14个驱动蛋白家族89，它们均可能在HUVEC极性建立和定向迁移中发挥作用，而所有这些均可利用本文提供的方案进行研究。
未来的研究还应关注正常状态与疾病状态下细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用。本文所述的 HUVEC 实验方案适用于正常血管稳态过程的研究，也适用于包括心脏病、视网膜病变、肿瘤生长与转移等多种疾病状态的研究。将光学透明的细胞外基质与力学性能适宜的聚丙烯酰胺基底结合显微成像技术，可实现对细胞-ECM 相互作用的研究，从而以高空间和时间分辨率监测内皮细胞的血管生成过程。此类实验方法已开始揭示内皮细胞在形态、极性、迁移方面的关键差异，以及调控这些过程的蛋白质所发挥的作用5,31,90。未来的研究应致力于阐明 ECM 的力学顺应性与维度性机械感知如何协同作用，局部调控靶向并调节细胞骨架动态的蛋白质。

血管生成由细胞外信号刺激触发，这些信号促进内皮细胞（ECs）发生极化，以特定方向迁移，并在需要血液供应的组织中形成新的血管系统。被认为驱动血管生成的因素包括来自细胞外基质（ECM）的信号。响应物理信号，ECs 以特定方向延伸出新的分支，从而引导血管网络形成过程中的定向运动1,2。ECs 的形态结构和分支模式由微管（MT）细胞骨架的局部调控所决定，并与肌动蛋白-肌球蛋白收缩性的调控相协调3。为了形成 EC 分支，肌球蛋白-II 必须在局部下调，从而导致局部细胞膜突起4。与此同时，在细胞的相同区域，微管的生长动态发生改变，表现为缓慢而持续的微管生长，以促进分支的延伸和稳定性5。这种协调的细胞骨架调控使 ECs 能够建立形态极性，从而促进其定向迁移。
极化细胞形态的形成需要微管（MT）的极性组装6。在迁移的上皮细胞中，微管在细胞前缘特异性地缓慢而持续地生长7-9；而在神经元中，轴突或树突的起始与延伸不仅需要微管的存在，还要求微管持续进行动态的组装与解聚过程10-15。因此，微管生长动态的局部调控决定了细胞的结构，并使内皮细胞在穿越其细胞外基质（ECM）时能够快速重塑细胞形态。
微管（MT）的生长动态受到分子马达蛋白家族和非马达蛋白的调控，后者被称为微管相关蛋白或微管相互作用蛋白（下文统称为MAPs）。MAPs可在局部被激活或失活，通常由细胞-细胞外基质（ECM）界面启动的信号级联反应所介导16,17。一旦被激活，MAPs通过结合微管并改变其组装与去组装的动力学，从而在局部调控微管动态，以促进细胞形态和极性的建立18-20。有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（Mitotic Centromere Associated Kinesin, MCAK）属于Kinesin-13家族的MAP，可结合微管末端，并将ATP水解与微管去组装过程偶联21-23。MCAK的这一功能在有丝分裂纺锤体中具有关键作用24-28，同时在间期也发挥重要功能29,30。在间期的内皮细胞（ECs）中，MCAK介导的微管去组装受到局部Aurora-A激酶磷酸化MCAK的调控，该过程由伤口边缘激活的小GTP酶Rac1所诱导。该信号级联的最终效应是在迁移内皮细胞的前缘抑制MCAK活性，导致微管向细胞前缘极性生长，而在后缘则发生MCAK介导的微管去组装31。
传统测量微管（MT）生长动态的方法通常采用手动追踪荧光标记的微管蛋白，或者近年来更常用的荧光标记微管末端结合蛋白1或3（EB1或EB3）。荧光微管蛋白方法的优势在于能够标记整个微管阵列。然而，由于大多数有丝分裂期细胞类型在间期维持放射状排列的微管阵列8,32,33，中心体附近的微管非常密集，因此使用荧光微管蛋白追踪微管的生长与解聚通常仅限于细胞的周边区域。由于这些局限性，荧光标记EB蛋白（EB1或EB3）的方法已成为测量微管动态更为常用的技术。由于EB蛋白仅标记正在生长的微管正端，因此在显微图像中表现为小而明亮的荧光“彗尾”（1–3 μm），从而提供了一个易于识别的微管聚合标志，且背景荧光极低34–37。尽管EB蛋白仅标记部分微管阵列这一特性是该方法的主要优势之一，但也突显出一个重要局限性，即非生长状态的微管不会被EB3标记。尽管如此，通过随时间测量和追踪EB3彗尾，并可视化亚细胞区域内的微管生长，使该方法成为需要对微管区域组织进行评估的应用的理想选择。
传统方法在测量微管（MT）生长动态方面另一个关键的局限性在于数据集非常庞大，以及数据分析所需的时间过长。这一局限性源于需要以高时间分辨率手动追踪数百个EB彗星状信号。此外，这些测量必须在具有统计学意义数量的细胞中进行，并且还需在多种对照和实验条件下重复执行。近年来，通过专门针对活细胞中延时显微成像下EB3彗星状信号追踪的计算分析技术，这些限制已得到克服35。当合理使用时，这种计算方法不仅能够减少手动追踪所带来的人为误差，还可实现高通量的微管聚合速率测量。利用基于MatLab的软件包plusTipTracker对微管动态进行计算分析，可通过对荧光标记的EB3彗星状信号的追踪来测量微管的生长过程5,31,35,38。此外，plusTipTracker软件还能根据生长中的微管轨迹内EB3彗星信号的消失，计算微管的灾变事件（a.k.a. 去组装），并支持用户自定义感兴趣区域，实现细胞内（a.k.a. 区域性）微管生长动态的亚细胞水平分析。在我们的研究中，比较了分支区域与非分支区域之间，以及细胞前缘与后缘之间的微管生长动态。plusTipTracker软件输出的数据还可用于生成单个细胞及亚细胞区域的彩色编码轨迹叠加图像。
本文描述了用于研究MCAK在调控微管（MT）生长动态中的作用，以及该微管去聚合酶对内皮细胞（EC）分支形态和定向迁移调控贡献的方法学。本方法采用原代人源细胞系——人脐静脉内皮细胞（HUVECs），该细胞易于培养，并且非常适合通过电穿孔实现质粒cDNA的瞬时转染。随后，我们对转染了微管末端结合蛋白3（EB3）和有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）特异性cDNA构建体的HUVECs进行高分辨率、延时荧光显微成像，以评估其对微管动态的影响。利用基于PlusTipTracker的计算图像分析方法，对EB3标记的微管正端进行分析，测量延时图像中微管的生长速度和生长寿命，从而量化并比较实验干预对微管生长动态的影响。该方法可实现对微管动态的研究，并揭示亚细胞区域中微管动态的局部调控如何影响内皮细胞分支与迁移等血管生成过程。这些技术适用于任何可在活细胞中荧光标记并表达的微管相关蛋白（MAP）的研究。

<table><tbody><tr><td>Aurora A 抑制剂 I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis 溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三甲氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405、488、561、640 nm 高功率 MLC400 激光组合模块</td><td>安捷伦科技</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;小鼠IgG免疫沉淀珠</td><td>TrueBlot 试剂；Rockland 公司</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>抗&amp;ndash;兔IgG免疫沉淀 beads</td><td>TrueBlot 试剂；Rockland 公司</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m，DAPI-ET 发射滤光片</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m 发射滤光片</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m 发射滤光片</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m 发射滤光片</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分</td><td>RPI 产品</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara 冷却型电荷耦合器件相机</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 驴抗兔</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 标记的山羊抗大鼠</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot 供应 &amp;和生长因子（内容如下）</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛脑提取物 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 IU 青霉素/ml，10,000 &amp;#181;g Strep/ml&amp;nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>电子快门</td><td>Sutter 仪器</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT蛋白酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的山羊抗小鼠</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记山羊抗兔</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>免疫印迹PVDF膜</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>羊毛脂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康 TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗微管蛋白（DM1A）</td><td>细胞信号技术公司</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>尼康</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector V 试剂盒</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>含有电穿孔缓冲液</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 IU 青霉素/ml，10,000 &amp;#181;g Strep/ml</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>道康宁</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>管道</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>兔抗&amp;ndash;pT288&amp;ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗&amp;ndash;&amp;alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>旋转盘&amp;nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学发光底物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>康宁</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

活体人脐静脉内皮细胞中微管动态的高分辨率延时成像与自动分析

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

由现有血管形成新血管的生理过程需要特定的信号事件，以触发单个内皮细胞（ECs）内部的形态学变化。这些过程对于伤口愈合等稳态维持至关重要，同时也在促进肿瘤生长和转移中发挥关键作用。内皮细胞的形态由细胞骨架的组织结构决定，细胞骨架是一个受到严密调控的系统，包含肌动蛋白和微管（MT）的动态变化，已知其可调控内皮细胞的分支、极性及定向迁移，这些均为血管生成的关键组成部分。为了研究微管动态，我们采用高分辨率荧光显微镜，并结合对荧光标记的微管正端进行计算图像分析，以探究微管生长动态及其对内皮细胞分支形态和定向迁移的调控作用。通过将荧光标记的微管末端结合蛋白3（EB3）以及有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）特异性cDNA构建体转染至活的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，随后进行延时成像，以评估其对微管动态的影响。使用PlusTipTracker软件追踪EB3标记的微管正端，从而在延时图像中测量微管生长速度和微管生长寿命。该方法可实现对微管动态的研究，并有助于揭示细胞内亚区域中微管动态的局部调控如何影响内皮细胞分支与迁移等血管生成过程。

用于活细胞显微镜观察的 HUVEC 培养 
对表达荧光蛋白的 HUVEC 进行活细胞成像时，必须将 HUVEC 维持在适合细胞正常生长与维持、以及蛋白质正常表达和功能的环境中。图 1 示意性地展示了用于制备缓冲且封闭系统的方法流程，该系统可保持优化的光学特性，以采集活细胞的延时图像。将双面胶带切成细条后粘附在载玻片上（图 1A），然后将含有培养 HUVEC 的盖玻片倒置在胶带上，使细胞面向载玻片（图 1B）。通过这种方式，胶带在两片玻璃表面之间形成微小间隙，从而为细胞提供一个可浸润于适当细胞培养基中的空间（图 1C；见上述方案 4）。最后一步，使用凡士林：羊毛脂：石蜡（1:1:1 混合物，VALAP；图 1D）将盖玻片密封至载玻片，以建立一个封闭系统。该细胞培养方法既适用于 EB3 星状结构的短时间序列成像，也适用于长时间序列的分支与迁移实验。此外，VALAP 类似蜡质的一致性使得在成像实验结束后可轻松将其从载玻片和盖玻片上去除，从而可在同一盖玻片及细胞样本上进一步进行其他补充性操作，例如固定和免疫标记（见方案 8），而该样本此前已通过活细胞成像方法进行了观察。
<img alt="载玻片制备示意图，展示盖玻片、胶带、加样及VALAP封片过程。" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：活细胞显微成像中HUVEC培养的方法学。（A）将两段双面胶带裁剪为0.65 cm × 2.50 cm的矩形条状，将其中一条水平粘贴于载玻片顶部边缘，另一条粘贴于底部边缘。在胶带与载玻片边缘之间需预留微小空隙，以便后续如（D）中所述密封成像腔室。（B）使用镊子取出含HUVEC的盖玻片，并将其细胞面朝下倒置覆盖在两段胶带之上。（C）使用移液器在盖玻片与载玻片之间加入40 μl成像培养基（补充25 μM HEPES的完全内皮基础培养基），确保盖玻片与载玻片之间的空间完全充满成像培养基，并避免产生气泡。如有需要，可沿盖玻片边缘使用抽吸装置去除多余液体。（D）使用温热的VALAP（1:1:1凡士林∶羊毛脂∶石蜡）沿盖玻片四周进行密封。轻压盖玻片以检查是否有培养基渗漏，如有渗漏则补充VALAP进行修补。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
对荧光标记的EB3进行自动追踪，可实现对整个细胞及区域微管（MT）生长动态的全面分析。获取清晰、分明且具有高时空分辨率的EB3蛋白显微图像，是分析细胞内EB3运动的基础。HUVEC细胞中荧光标记EB3的表达水平在不同细胞间差异显著，且同一细胞内的荧光强度通常在数小时内逐渐增强。因此，必须关注并监测表达谱的这些变化，以识别EB蛋白表达升高对微管生长动态可能产生的影响。最佳策略是评估每张成像细胞的灰度荧光强度分布，并将数据分析限定于具有特定灰度表达范围的细胞。对表达谱数据集的初步评估至关重要，应将其与plusTipTracker软件获取的每细胞微管生长动态数据进行比较。可通过将每个实验组中各细胞的表达谱分别与微管生长速度和微管生长寿命作图，以确定理想的灰度表达范围，并识别潜在的离群值。
图2展示了一种在纤连蛋白基质上培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（见上文方案2.1），该细胞表达接近最佳水平的mApple标记EB3蛋白。荧光EB3星号在12秒的时间序列图像中显示（图2A）。利用plusTipTracker软件对EB3星号进行分析，可实现自动化的逐帧EB3星号检测（绿色和黄色圆点，图2B）。在每一帧中检测到的星号根据其逐帧位置变化进行连接，从而生成EB3轨迹及可视化轨迹叠加图（图2C-F）。轨迹叠加图采用颜色编码，颜色差异由用户输入的参数决定。通常，这些参数基于微管（MT）生长速度和微管生长寿命的全局平均值5,31，将数据分为四组：慢速且短寿命（红色）、慢速且长寿命（黄色）、快速且短寿命（绿色）以及快速且长寿命的微管生长（蓝色；图2G）。通过plusTipTracker对EB3标记的微管生长动态进行追踪，还可支持用户自定义感兴趣区域（ROIs）。plusTipTracker从用户定义的感兴趣区域内提取微管生长轨迹数据（图2A、B 和 F），从而实现对同一细胞内不同区域微管生长动态的比较。
<img alt="细胞动态：延时显微镜、微管生长、蛋白质分析，红色箭头指示变化。" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： EB3 星状结构的检测、追踪及 plusTipTracker 数据输出。 （A）表达 mApple-EB3 的 HUVEC 细胞的延时成像视频。左侧面板显示整个细胞的视野及全细胞掩膜（白线），用于界定细胞边界。红色框表示右侧时间序列图像中放大的区域。右侧面板显示连续成像帧中 EB3 星状结构的原始灰度延时图像（t = 0 秒 – t = 12 秒）。（B）基于（A）中图像的 plusTipTracker 对 EB3 星状结构的检测结果。左侧面板显示检测到的星状结构整体分布（黄色点）。红色框表示右侧时间序列图像中放大的区域。右侧面板突出显示五个被检测到的 EB3 星状结构（红箭头），并追踪这五个星状结构在 12 秒成像期间的运动轨迹。绿色点表示在前一时间间隔中不存在（或未被检测到）的 EB3 星状结构。（C）对（A）中所示 EB3 星状结构连续 61 帧（2 分钟视频）的最大强度投影。（D）对（C）中相同 61 帧（2 分钟视频）的 plusTipTracker 微管轨迹叠加图。（E）最大强度投影的放大区域（C 中红框）。（F）最大强度投影上叠加 plusTipTracker 微管轨迹的放大区域（D 中红框）。（G）（D）和（F）中轨迹叠加图的颜色编码图例。慢速、快速、短寿命或长寿命的分类依据来自十组表达 mApple-EB3 的 HUVEC 细胞中所有生长轨迹测量值的平均值。为便于可视化，（D）和（F）中的轨迹叠加图使用（A）中细胞图像的反相像素强度生成。比例尺 = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
HUVEC 的分支和迁移模式对来自细胞外基质（ECM）的力学物理信号敏感。
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）众所周知能够响应多种类型的信号刺激，并在此过程中发生形态学改变，从而决定细胞对特定信号刺激产生相应的细胞反应。36,40-42在纤连蛋白包被的玻璃基质上培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）图 3A），或在较硬的二维聚丙烯酰胺细胞外基质（55 kPa）上通常呈现圆形或细长形态，分支突起较少且不明显图3B然而，当在非常柔软的二维聚丙烯酰胺细胞外基质（0.7 kPa）上培养时，HUVECs 呈现出高度分支的形态，这种形态已知是由顺应性诱导的肌球蛋白-II 收缩力下调所致。4,5,31 (图3C因此，HUVECs 通过细胞外基质的力学感知来调控其细胞形态，这一过程依赖于微管动力学和肌动球蛋白收缩力的局部调节。
由于HUVECs表现出多种形态学特征，为了测量HUVECs的分支情况，首先必须明确定义何为分支突起，然后定义如何客观地测量分支突起。一种技术采用四步法，即通过手绘表达荧光体积标记物的细胞图像边缘来生成细胞边界或“掩模”（图3D）。在生成掩模后，通过确定分支突起与细胞体之间曲率最大的位置来定义分支起点。绘制一条线以标示“分支起点”（紫色斜线；图3E）。分支数量通过统计具有明确定义分支起点的分支数目来测量（图3F）。分支长度定义为从分支起点至远端分支尖端的距离（图3G）。为避免将微小的片状伪足突起纳入数据分析，额外设定标准：分支的长度（“分支长度”）必须大于其在“分支起点”处的宽度，且分支长度至少需达到10微米5,31。
<img alt="不同基底上的细胞形态；显微镜图像（A-D）与示意图（E-G）。" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 人脐静脉内皮细胞分支形态分析 (A-C) 纤维连接蛋白包被的玻璃细胞外基质上培养的 HUVECs 的 DIC 图像示例A) 坚硬（55 kPa）聚丙烯酰胺细胞外基质（ECMs）B）以及软性（0.7 kPa）聚丙烯酰胺ECM（C）。在 0.7 kPa 聚丙烯酰胺 ECM 上培养的 HUVEC 中，分支显著增加（C) 与较硬的ECM相比（A, B). (D). 转染表达mApple-C1 cDNA构建体（细胞体积标记物）的HUVEC的DIC显微图像（左图）与荧光图像（右图）。(E) 通过寻找曲率最大处来确定分支起点（即 膜弯曲程度最大的位置（紫色线条）位于分支两侧，然后用一条直线连接这两个角度（蓝色线条）。F) 识别并选择延伸的分支状突起 &gt;10 μm 从“分支起点”（见E部分定义）开始计数，统计分支突起的数量，得到“分支数量”。 (G使用 NIS Elements 软件的注释与测量应用程序中的直线工具，测量“分支起点”中心到分支最远端点的距离，以获得“分支长度”。比例尺 = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
除了感知细胞外基质的刚度外，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）还能感知并响应因划痕损伤所导致的相邻细胞接触的丧失。在迁移实验中，将单层培养的 HUVECs 进行划痕处理，并测量其迁移特性（见上述方案9）。在通过划破单层细胞诱导损伤后，伤口边缘的 HUVECs 会极化，形成向前延伸至伤口区域的突出前缘（图4A，t = 0 小时）。在接下来的10–12小时过程中，极化的伤口边缘 HUVECs 迁移进入伤口区域，填补缺损，重建新的融合单层（图4A，t = 11 小时）。与 HUVEC 分支类似，现有证据表明，细胞极化和迁移过程高度依赖于微管（MT）和肌动蛋白细胞骨架的协调性重组43–49。这一过程部分通过在伤口边缘 HUVECs 的前缘而非后缘局部抑制 MCAK 介导的微管解聚来实现31。微管动态对伤口诱导极化的敏感性由 Rac1 GTP酶启动，后者作用于多种下游调控蛋白，包括 Aurora-A 激酶——该激酶可磷酸化并抑制前缘的 MCAK，以及其他能够抑制或激活微管相关蛋白（MAPs）从而局部调节微管生长与缩短的激酶18,31,36,48,50–53。大量实验证据支持如下观点：前缘突出与后缘收缩的协调是通过 Rac1 激活周期促进前缘微管组装，以及 RhoA 激活周期促进后缘肌动蛋白-肌球蛋白收缩性来实现的，从而驱动定向运动9,41,51,52,54–58。
迄今为止，尚无公认的自动化细胞迁移追踪方法。这主要是由于在计算上难以分析细胞-细胞外基质（ECM）边界，这些边界会随着伤口边缘细胞的极化和迁移而持续变化。尽管许多软件程序能够追踪荧光标记的细胞59-64，但在伤口边缘迁移实验中，荧光标记的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）仅占总HUVEC群体的约30-40%，因此大多数伤口边缘细胞必须通过相差或微分干涉差（DIC）成像进行观察。此外，在测量伤口边缘迁移时，重要的是在同一伤口内同时评估荧光标记和非荧光标记的细胞，以便在实验组内及实验组间识别表达载体的特异性效应。目前，测量HUVEC迁移的最佳方法是采用手动追踪法：首先识别一个伤口边缘细胞，然后确定其细胞核和核仁（图4B）。核仁因其较高的光散射密度和相对较小的尺寸，被用作细胞追踪的位置判定依据。这两个特征使得核仁更易于识别，并通过限制操作者放置单个追踪点的区域来减少测量误差。HUVEC的迁移轨迹通过在连续的时间推移图像帧中点击核仁位置生成。最后，对对照组和实验组细胞的迁移速度及迁移距离（相对于起始位置）进行测量和分析（图4B）。
<img alt="细胞迁移过程、基于延时显微镜的伤口愈合实验及细胞追踪图示。" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 伤口边缘 HUVEC 分析与迁移轨迹追踪 (A) 11小时划痕伤口边缘HUVECs延时成像序列的20倍相差图像（又称为 “迁移实验”。伤口和细胞迁移方向在 t = 0 hr 图中标出。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）跨越伤口边缘并向伤口内迁移，直至形成单层细胞（t = 3.5 hr - t = 11 hr）。(B) 迁移实验延时成像分析（如 A 所示）首先需要根据细胞位置确定一个可追踪的伤口边缘 HUVEC即 细胞位于伤口边缘的物理位置）及其表达谱（即， 如果实验涉及GFP表达，则选择绿色伤口边缘的细胞。利用相差图像识别细胞核和核仁。使用NIS Elements软件中的注释与测量工具，在连续的时间推移图像中手动追踪核仁，以确定其迁移速度和距原点的距离。比例尺 = 100 μm  （A）， 20 μm （B） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

详细介绍了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养、微管生长荧光标记物的瞬时转染、活细胞成像以及间期微管生长动态的自动化分析方案。

由现有血管形成新血管的生理过程需要特定的信号事件来触发形态学变化……

本实验的总体目标是培养人脐静脉内皮细胞，并利用活细胞延时成像技术分析细胞骨架动态变化和细胞迁移。本视频中描述的方法有助于解答细胞生物学、分子生物学和力学生物学领域中的关键问题。例如，该方案可用于确定不同细胞外基质（ECMs）的结合如何调控细胞形态和运动能力。直观演示至关重要，因为样品制备步骤难以操作，整个过程中需要及时且精确地处理细胞。尽管该方法可为血管生成过程中内皮细胞的运动性提供见解，但它也可应用于几乎所有贴壁细胞模型系统的显微观察研究。使用镊子从盛有100%乙醇的储存瓶中取出盖玻片，通过本生灯火焰灼烧以灭菌，然后将其放入35毫米的培养皿中。每个样本准备一片盖玻片。向一个1.5毫升的微量离心管中加入10微升浓度为1毫克/毫升的纤连蛋白储备液和990微升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将250微升该溶液移液至每个盖玻片上，均匀铺布以覆盖整个表面。将盖玻片在37摄氏度条件下孵育至少三小时。使用前，用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗每张盖玻片三次。使用血细胞计数板确定培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）数量，并将含有100,000个细胞/盖玻片（非迁移实验）或500,000个细胞/盖玻片（迁移实验）的细胞悬液转移至微量离心管中。以1,400 × g离心4分钟，使细胞沉淀。离心后，将每种待测条件下的最多一百万个细胞重悬于100 µL电穿孔缓冲液中，并加入1 µg cDNA。将细胞转移至电穿孔比色皿中。使用指定用于 HUVEC 电穿孔的程序转染细胞和 DNA 混合物。接着，通过加入 500 微升完全内皮基础培养基来复苏转染后的细胞。然后，将适当体积的细胞接种到纤维连接蛋白包被的盖玻片上。将细胞在37摄氏度下孵育三至四小时，以留出足够时间使cDNA构建体得以表达。为成像做准备时，取两条尺寸为2.5厘米×0.65厘米的双面胶带，将其水平固定在洁净载玻片的顶部和底部边缘。注意：胶带与载玻片边缘之间应留出少量空隙，以便密封反应腔室。将盖玻片细胞面朝下放置，使盖玻片的两个边缘落在胶带上。用镊子轻轻按压以固定盖玻片。使用微量移液器在盖玻片与载玻片之间加入40微升成像培养基。确保盖玻片与载玻片之间的空间完全充满成像介质。如有必要，用擦镜纸吸去多余介质。用温热的VALAP密封载玻片的所有边缘。轻轻按压玻璃盖玻片以检查是否泄漏。将安装并密封好的盖玻片置于预热至37摄氏度的显微镜载物台上。使用转盘共聚焦显微镜采集延时成像序列、蓝色荧光蛋白图像和微分干涉差（DIC）图像。按照随附文档中所述的方法分析微管动态变化和共定位现象。进行细胞迁移实验时，在电穿孔步骤后，加入 80 微升完全内皮基础培养基以复苏转染的细胞。然后，用移液器将全部 80 微升样品作为单滴加至经干燥处理的纤连蛋白包被盖玻片的中心。不要摊开液滴。干燥盖玻片是必要的，以防止80微升的液滴在接触盖玻片时发生分离。该方法可使HUVECs集中在盖玻片的较小区域内，从而促进细胞快速形成融合的单层。 将盖玻片在37摄氏度下孵育三至四小时，以使细胞有足够时间贴壁形成融合的单层。随后用完全内皮基础培养基将玻片冲洗两次，以去除未贴附的细胞。为在HUVEC单层上创建伤口边缘，使用镊子轻轻固定盖玻片，并用剃刀刀片用力划过细胞单层的中央区域。将细胞置于37摄氏度培养箱中恢复3小时。随后按照之前的方法组装并安装盖玻片用于成像。使用10倍、数值孔径0.45的相差物镜和数值孔径0.52的长工作距离聚光镜，每隔10分钟采集一次相差图像，持续12小时。使用图像采集软件程序中的 ND Acquisition 面板。最后，按照随附文档中所述的方法定量分析 HUVEC 的分支和迁移。HUVEC 被转染以表达 mApple 标记的 EB3（一种微管末端结合蛋白），并采集了延时图像。左侧显示EB3的原始图像，右侧显示由plusTipTracker软件追踪的蓝色EB3彗星。根据每帧之间位置的变化，将各帧中检测到的彗星进行连接，以生成EB3轨迹及如图所示的可视化EB3轨迹叠加图。缓慢且寿命较短的微管生长以红色表示，缓慢且寿命较长的微管生长以绿色表示，快速且寿命较短的微管生长以黄色表示，快速且寿命较长的微管生长以蓝色表示。为分析内皮细胞分支，采集了单个HUVEC细胞在60倍放大下的微分干涉差（DIC）图像和荧光图像。在荧光图像中，手动绘制细胞边缘的边界。随后通过在分支两侧曲率最大的位置画一条穿过分支的直线来定义分支起点。对于长度大于宽度且长度至少为10微米的分支，进行计数，并从分支起点测量至分支远端末端以确定其长度。为评估内皮细胞伤口边缘迁移能力，将HUVECs以高密度培养，并在划痕处理后按照本视频所述方法进行活细胞延时成像。如图所示，伤口边缘的内皮细胞向伤口区域定向迁移。该运动过程通过核仁作为标记物来追踪细胞迁移速度、持续性及迁移距离。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养、转染并制备人脐静脉内皮细胞（HUVECs），以用于细胞形态与细胞骨架动态成像实验或伤口边缘细胞迁移研究。完成此操作后，还可采用聚丙烯酰胺或胶原蛋白偶联等其他方法，以进一步探究细胞与修饰后的细胞外基质相互作用的相关问题。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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利用基于阻抗的实时细胞分析技术监测病毒感染下人脐静脉内皮细胞的变化

学习使用活细胞延时成像技术在人脐静脉内皮细胞中分析微管动力学和细胞迁移的方法。该方案有助于研究细胞骨架动态和血管生成过程中的细胞行为。

活体人脐静脉内皮细胞中微管动态的高分辨率延时成像与自动分析

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