活体人脐静脉内皮细胞中微管动态的高分辨率延时成像与自动分析

本实验的总体目标是培养人脐静脉内皮细胞，并利用活细胞延时成像技术分析细胞骨架动态变化和细胞迁移。本视频中描述的方法有助于解答细胞生物学、分子生物学和力学生物学领域中的关键问题。例如，该方案可用于确定不同细胞外基质（ECMs）的结合如何调控细胞形态和运动能力。

直观演示至关重要，因为样品制备步骤难以操作，整个过程中需要及时且精确地处理细胞。尽管该方法可为血管生成过程中内皮细胞的运动性提供见解，但它也可应用于几乎所有贴壁细胞模型系统的显微观察研究。

使用镊子从盛有100%乙醇的储存瓶中取出盖玻片，通过本生灯火焰灼烧以灭菌，然后将其放入35毫米的培养皿中。每个样本准备一片盖玻片。

向一个1.5毫升的微量离心管中加入10微升浓度为1毫克/毫升的纤连蛋白储备液和990微升磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将250微升该溶液移液至每个盖玻片上，均匀铺布以覆盖整个表面。

将盖玻片在37摄氏度条件下孵育至少三小时。使用前，用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗每张盖玻片三次。使用血细胞计数板确定培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）数量，并将含有100,000个细胞/盖玻片（非迁移实验）或500,000个细胞/盖玻片（迁移实验）的细胞悬液转移至微量离心管中。

以1,400 × g离心4分钟，使细胞沉淀。离心后，将每种待测条件下的最多一百万个细胞重悬于100 µL电穿孔缓冲液中，并加入1 µg cDNA。将细胞转移至电穿孔比色皿中。

使用指定用于 HUVEC 电穿孔的程序转染细胞和 DNA 混合物。接着，通过加入 500 微升完全内皮基础培养基来复苏转染后的细胞。然后，将适当体积的细胞接种到纤维连接蛋白包被的盖玻片上。

将细胞在37摄氏度下孵育三至四小时，以留出足够时间使cDNA构建体得以表达。为成像做准备时，取两条尺寸为2.5厘米×0.65厘米的双面胶带，将其水平固定在洁净载玻片的顶部和底部边缘。注意：胶带与载玻片边缘之间应留出少量空隙，以便密封反应腔室。

将盖玻片细胞面朝下放置，使盖玻片的两个边缘落在胶带上。用镊子轻轻按压以固定盖玻片。使用微量移液器在盖玻片与载玻片之间加入40微升成像培养基。

确保盖玻片与载玻片之间的空间完全充满成像介质。如有必要，用擦镜纸吸去多余介质。用温热的VALAP密封载玻片的所有边缘。

轻轻按压玻璃盖玻片以检查是否泄漏。将安装并密封好的盖玻片置于预热至37摄氏度的显微镜载物台上。使用转盘共聚焦显微镜采集延时成像序列、蓝色荧光蛋白图像和微分干涉差（DIC）图像。

按照随附文档中所述的方法分析微管动态变化和共定位现象。进行细胞迁移实验时，在电穿孔步骤后，加入 80 微升完全内皮基础培养基以复苏转染的细胞。然后，用移液器将全部 80 微升样品作为单滴加至经干燥处理的纤连蛋白包被盖玻片的中心。

不要摊开液滴。干燥盖玻片是必要的，以防止80微升的液滴在接触盖玻片时发生分离。该方法可使HUVECs集中在盖玻片的较小区域内，从而促进细胞快速形成融合的单层。

将盖玻片在37摄氏度下孵育三至四小时，以使细胞有足够时间贴壁形成融合的单层。随后用完全内皮基础培养基将玻片冲洗两次，以去除未贴附的细胞。为在HUVEC单层上创建伤口边缘，使用镊子轻轻固定盖玻片，并用剃刀刀片用力划过细胞单层的中央区域。

将细胞置于37摄氏度培养箱中恢复3小时。随后按照之前的方法组装并安装盖玻片用于成像。使用10倍、数值孔径0.45的相差物镜和数值孔径0.52的长工作距离聚光镜，每隔10分钟采集一次相差图像，持续12小时。

使用图像采集软件程序中的 ND Acquisition 面板。最后，按照随附文档中所述的方法定量分析 HUVEC 的分支和迁移。HUVEC 被转染以表达 mApple 标记的 EB3（一种微管末端结合蛋白），并采集了延时图像。

左侧显示EB3的原始图像，右侧显示由plusTipTracker软件追踪的蓝色EB3彗星。根据每帧之间位置的变化，将各帧中检测到的彗星进行连接，以生成EB3轨迹及如图所示的可视化EB3轨迹叠加图。

缓慢且寿命较短的微管生长以红色表示，缓慢且寿命较长的微管生长以绿色表示，快速且寿命较短的微管生长以黄色表示，快速且寿命较长的微管生长以蓝色表示。为分析内皮细胞分支，采集了单个HUVEC细胞在60倍放大下的微分干涉差（DIC）图像和荧光图像。在荧光图像中，手动绘制细胞边缘的边界。

随后通过在分支两侧曲率最大的位置画一条穿过分支的直线来定义分支起点。对于长度大于宽度且长度至少为10微米的分支，进行计数，并从分支起点测量至分支远端末端以确定其长度。为评估内皮细胞伤口边缘迁移能力，将HUVECs以高密度培养，并在划痕处理后按照本视频所述方法进行活细胞延时成像。

如图所示，伤口边缘的内皮细胞向伤口区域定向迁移。该运动过程通过核仁作为标记物来追踪细胞迁移速度、持续性及迁移距离。观看本视频后，您应能够充分掌握如何培养、转染并制备人脐静脉内皮细胞（HUVECs），以用于细胞形态与细胞骨架动态成像实验或伤口边缘细胞迁移研究。

完成此操作后，还可采用聚丙烯酰胺或胶原蛋白偶联等其他方法，以进一步探究细胞与修饰后的细胞外基质相互作用的相关问题。感谢观看，祝您的实验顺利成功。