详细描述小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的实验方案

本实验的主要目标是表征小鼠 C1498 细胞及其经静脉注射后在小鼠体内诱导的急性白血病。该实验方法的主要优势在于，C1498 细胞注射后所诱导的小鼠骨髓单核细胞性白血病具有许多与人类疾病相似的特征。该动物模型有助于回答血液学领域的关键科学问题，例如白血病发生及免疫缺陷的潜在机制是什么。

该动物模型对白血病治疗具有重要意义，因为它有助于测试新的化疗和免疫治疗药物。首先，将一只5至6周龄的雌性同源C57黑6小鼠转移至无菌超净工作台中，然后将动物放入固定器内。

接下来，使用配备29号针头的1毫升注射器吸取100微升细胞悬液。抓住小鼠尾部远端，用浸有70%乙醇的纱布消毒尾部皮肤。随后缓慢地将1×10⁶个细胞注入侧尾静脉。

当所有细胞输送完毕后，拔出针头，并用无菌纱布在注射部位轻轻按压。随后将动物放回笼中，并在接下来的数周内密切监测。17至19天后，将毛细管插入麻醉后的白血病动物眼部的内眦处。

从眶窦中抽取100至200微升血液至毛细管中。取出毛细管后，用无菌纱布轻轻按压眼部以控制出血。随后将血液转移至EDTA管中，并将管子置于冰上保存，直至进行单个核细胞分离。

为分离血单个核细胞，首先加入含1毫摩尔EDTA的磷酸盐缓冲液，使终体积达500微升。然后将样品转移至微量离心管中。接着，使用配备30号针头的1毫升注射器，小心地将500微升分离液沿管壁缓慢铺于血液下方，注意避免混匀各层。

通过离心分离细胞，并用移液器将不透明的白色单核细胞层转移至新的微量离心管中。随后，用1毫升PBS洗涤免疫细胞。离心后，将沉淀重悬于600微升FACS缓冲液中，用于染色及流式细胞术分析。

将小鼠仰卧固定在塑料板上并固定其四肢，以分离骨髓。用70%乙醇对动物进行消毒。然后，在膝关节上方股骨顶端处切断每条后肢，并轻轻牵拉胫骨，使其与股骨分离。

使用镊子和剪刀去除骨骼上的皮肤和肌肉，并将骨骼转移至冰上的培养皿中。用剪刀切除骨骼的末端。然后将连接有含5毫升冷PBS的10毫升注射器的26号针头逐次插入每根骨骼的一端，冲洗骨髓至培养皿中。

将细胞悬液反复通过针头数次，以破坏骨髓细胞。随后，将细胞通过新的70微米滤膜过滤至50毫升锥形管中，获得单细胞悬液。离心细胞，弃上清，将沉淀重悬于2毫升裂解缓冲液中。

立即用最多50毫升冷的PBS填充试管，并离心细胞。然后，将骨髓沉淀物重悬于冷的FACS缓冲液中，浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞。为准备骨髓细胞染色，首先将载玻片放入带有预装滤纸的 disposable chamber 中，并将chamber放入细胞离心机中。

向每个滤膜板孔中加入 100 微升 FACS 缓冲液，短暂离心载玻片。离心结束后，向每个孔中加入 100 微升细胞，并离心细胞。然后，小心地从孔中取出载玻片，进行空气干燥。

为了染色骨髓细胞，将载玻片浸入盛有迈-格染液的考普林瓶中，染色5分钟。接着，将载玻片转移至pH为6.8的缓冲液中1分钟。然后，将载玻片放入吉姆萨R染液中染色10分钟。

随后用pH中性水清洗10秒。清洗后，让载玻片自然晾干，并向每个样本滴加一滴封片剂。然后将盖玻片的一边接触载玻片，小心地将盖玻片缓缓放下覆盖在细胞上，轻轻按压以去除任何气泡。

与对照组动物相比，注射C1498细胞的动物其骨髓中出现大量C1498细胞浸润，表现为细胞呈原始细胞样形态。骨髓中浸润的C1498细胞表现出单核细胞和粒细胞表型，分别提示为单核母细胞和髓母细胞，符合急性粒-单核细胞白血病的特征。对注射C1498细胞小鼠血液样本中单个核细胞频率进行流式细胞术分析显示，白血病细胞约占全部白细胞群体的四分之一。

对照组与注射C1498细胞的动物之间，T细胞和B细胞的频率相似。然而，注射C1498的小鼠中单核细胞频率较高，这是急性粒-单核细胞白血病的特征。在进行细胞化学染色及May-Grunwald Giemsa染色操作时，必须注意保持适当的pH值、温度和孵育时间。

观看本视频后，您应能够充分了解如何表征急性粒单核细胞白血病。该技术建立后，为血液学领域的研究人员探索其他动物模型中自发性和诱导性急性白血病的特性奠定了基础。