Name: 详细的定性C1498小鼠细胞系及其关联白血病小鼠模型协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解利用流式细胞术和细胞化学染色表征C1498小鼠急性髓系白血病模型的方法。该方案通过尾静脉注射建立疾病模型，为白血病机制研究和治疗药物筛选提供可靠的实验平台。

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作者感谢“法国国家抗癌联盟”（北部委员会）、SIRIC ONCOLille（资助号 INCa-DGOS-INSERM 6041）以及里尔癌症研究所（IRCL）对本研究工作的支持。感谢 Delphine Taillieu 及动物饲养设施工作人员在小鼠饲养与福利维护方面提供的帮助。同时感谢 Raphaëlle Caillerez 和 Nathalie Jouy 在显微镜技术和流式细胞术方面给予的协助。

动物饲养及所有实验程序均经当地动物护理伦理委员会 CEEA.NPDC（许可编号 512012）批准，所有实验均依照法国及欧洲关于实验动物护理与使用的指南进行。
1. 体外 C1498细胞系的表征
<ol>
	<li>体外培养 C1498 细胞
	<ol>
		<li>通过向 500 ml RPMI 培养基中加入 50 ml 胎牛血清（FBS）、5 ml 青霉素（100 U/ml）-链霉素（100 µg/ml）、500 µl 50 mM β-巯基乙醇、5 ml N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、5 ml 非必需氨基酸和 5 ml 丙酮酸钠，配制完全 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 培养基。</li>
		<li>在完全 RPMI 培养基中培养 C1498 细胞系。用移液器吹打收集悬浮细胞，并转移至 50 ml 离心管中。以 350 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>加入 20 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）（1×）溶液，以 350 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞重悬于 10 ml 流式细胞分选缓冲液（FACs 缓冲液）中（500 ml PBS 溶液中含 2.5 g 牛血清白蛋白（BSA）粉末和 2 ml 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液）。用台盼蓝染色后，使用 Thoma 细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用免疫染色和流式细胞术分析对 C1498 细胞系进行表型鉴定
	<ol>
		<li>细胞表面染色
		<ol>
			<li>配制 FACs 缓冲液。</li>
			<li>将收获的细胞用 FACs 缓冲液调整至 107 个细胞/ml，并将 106 个细胞（100 µl）分装至各流式细胞管中，用于每项染色实验。</li>
			<li>用以下抗体或其相应的同型对照抗体（用 FACs 缓冲液稀释后）100 µl 对细胞进行标记：
			<ol>
				<li>对于前体细胞和分化细胞的标志物，使用抗 CD11b/抗 CD18（1）、抗 Ly-6G（1）、抗 CD19、抗 B220（2）、抗 NK1.1、抗 CD49b、抗 CD4（1）、抗 CD8（2）、抗 CD3（3）、抗 CD21/35、抗 CD115 和抗 TCRVβ 抗体对细胞进行标记。</li>
				<li>对于造血干细胞/祖细胞标志物，单独使用抗 CD34/抗 CD117/抗 Sca-1、抗 CD150/抗 CD117/抗 Sca-1、抗 CD117/抗 CD127 或抗 CD16/32-生物素抗体的组合。</li>
				<li>对于细胞功能标志物（例如，黏附、抗原呈递、共刺激分子和受体），使用抗 CD18（2）/抗 CD11a、抗 MHC I 类、抗 MHC II 类、抗 CD31、抗 CD44、抗 CD80-生物素、抗 CD86 和抗 CD274 抗体对细胞进行染色。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将所有流式细胞管在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
			<li>向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液，洗涤细胞两次：以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
			<li>向每管中加入 100 µl FACs 缓冲液，并加入 100 µl 荧光标记的链霉亲和素（在 FACs 缓冲液中稀释至 1/100，最终稀释度为 1/200），对生物素偶联抗体进行二抗染色。将管子在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
			<li>洗涤细胞两次：向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液，以 350 × g 离心 5 分钟，用移液器吸弃上清液。</li>
			<li>将细胞重悬于 500 µl 冷 PBS 中，将管子置于冰上，并用铝箔包裹以避光。使用流式细胞仪10分析结果。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>胞内染色
		<ol>
			<li>通过将 125 ml 4% 多聚甲醛（PFA）溶液加入 375 ml PBS 溶液中，配制固定缓冲液。 
			注：配制 500 ml 4% PFA 溶液时，将 400 ml PBS 溶液置于通风橱中的搅拌器上加热至约 60 °C。加入 20 g PFA 粉末，并调节 pH 值直至 PFA 溶解。待溶液冷却后，调节 pH 至 6.9，并用 PBS 定容至 500 ml。</li>
			<li>通过将 0.5 g 皂苷和 0.5 g BSA 加入 500 ml PBS 溶液中，配制透化缓冲液。</li>
			<li>将收获的细胞用 FACs 缓冲液调整至 107 个细胞/ml，并将 106 个细胞（100 µl）分装至各流式细胞管中，用于每项染色实验。以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
			<li>用 200 µl 1% PFA 溶液固定细胞，在 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
			<li>向每管中加入 2 ml 透化缓冲液，以 350 × g 离心 5 分钟，用移液器吸弃上清液。向每管中加入 100 µl 透化缓冲液。</li>
			<li>将以下抗体或其相应的同型对照抗体用透化缓冲液稀释后，加入 100 µl 对细胞进行标记：抗 CD3（2）/抗 CD8（1）、抗 CD3（3）/抗 CD4（2）、抗 CD107b 和抗 CD3（3）/抗 TCRVβ。</li>
			<li>在 4 °C 下孵育细胞 30 分钟。</li>
			<li>向每管中加入 2 ml 透化缓冲液，洗涤细胞两次。以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
			<li>向细胞中加入 100 µl 透化缓冲液。加入用透化缓冲液稀释的 100 µl 荧光标记链霉亲和素，对生物素偶联抗体进行二抗染色。将管子在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
			<li>向每管中加入 2 ml 透化缓冲液，以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
			<li>将细胞重悬于 500 µl 冷 PBS 中，然后置于冰上避光保存。使用流式细胞仪10分析结果。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于显微镜观察的细胞悬液涂片
	<ol>
		<li>用 5 ml 冷 FACs 缓冲液将第 1.1.4 步获得的 106 个收获的 C1498 细胞洗涤两次，然后将细胞稀释于 1 ml 冷 FACs 缓冲液中。将管子置于冰上。</li>
		<li>将载玻片放入带有预附滤纸的一次性染色缸中，并将染色缸放入细胞离心机中。</li>
		<li>向每个染色缸和滤纸中加入 100 µl FACs 缓冲液，以 4.52 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>向每个染色缸和滤纸中加入 100 µl 细胞悬液，以 4.52 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>小心地从染色缸中取出载玻片，在进行髓过氧化物酶染色（第 1.4 步）、酯酶染色（第 1.5 步）或 May-Grünwald Giemsa 染色（第 1.6 步）前将载玻片空气干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光法髓过氧化物酶染色
	<ol>
		<li>将载玻片浸入冷甲醇：丙酮（1:1）溶液中 2 分钟，以固定载玻片上的细胞，然后空气干燥载玻片。</li>
		<li>使用疏水笔在细胞周围画圈，以限制液体在含细胞区域的扩散。</li>
		<li>用 200 µl 冷 PBS 溶液冲洗细胞 10 分钟。</li>
		<li>用含 10 µl 正常驴血清和 10 µg/ml 纯化抗 CD16/32 抗体的 200 µl 3% BSA/PBS 缓冲液封闭细胞。</li>
		<li>加入 200 µl 抗小鼠髓过氧化物酶抗体（用 3% BSA/PBS 缓冲液稀释至 20 µg/ml）。在湿盒中 4 °C 过夜孵育细胞。</li>
		<li>用 200 µl 冷 0.1% BSA/PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>加入 200 µl 抗山羊 IgG 抗体（用 3% BSA/PBS 缓冲液稀释至 1/250）。在湿盒中室温孵育 2 小时。</li>
		<li>用 200 µl 0.1% BSA/PBS 缓冲液洗涤细胞 3 次，再用冷 PBS 洗涤 2 次。</li>
		<li>用 200 µl Hoechst 染色液（用 PBS 稀释至 1/1,000，终浓度为 1 µg/ml）在室温下染色细胞核 2 分钟。</li>
		<li>用清水洗涤载玻片，空气干燥后封片。在细胞上滴加一滴封片剂 1，将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酯酶细胞化学 
	注：将所有试剂预热至室温。
	<ol>
		<li>固定液配制
		<ol>
			<li>配制柠檬酸-丙酮-甲醛（CAF）溶液：将 2.5 ml 柠檬酸溶液、6.5 ml 丙酮和 0.8 ml 37% 甲醛加入玻璃瓶中。轻轻混匀，4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>萘酚 AS-D 氯乙酸酯酶（CAE）活性检测
		<ol>
			<li>将去离子水加热至 37 °C。</li>
			<li>在 50 ml 管中，将 1 ml 亚硝酸钠溶液加入 1 ml 染料溶液中。轻轻混匀，静置 2 分钟。加入 40 ml 预热的去离子水、5 ml pH 6.3 缓冲液浓缩液和 1 ml 萘酚 AS-D 氯乙酸酯溶液。混匀后转移至 Coplin 染色缸中。</li>
			<li>用 CAF 溶液（见第 1.5.1.1 步）固定载玻片上的细胞（见第 1.3 节）30 秒，然后用去离子水冲洗 45 秒。</li>
			<li>将载玻片转移至第 1.5.2.2 步配制的溶液中，在避光湿盒中 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
			<li>干燥载玻片，然后将其浸入去离子水中冲洗 2 分钟。</li>
			<li>滴加数滴苏木精溶液对细胞进行复染，孵育 1 分钟。</li>
			<li>用中性水（pH 7）洗涤载玻片，空气干燥。在细胞上滴加一滴封片剂 2，将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>α-萘酚丁酸酯酶（NBE）活性检测
		<ol>
			<li>使用前将 α-萘酚丁酸酯溶液预热至 37 °C。</li>
			<li>将一片亚硝酸钠片剂溶于 6.25 ml 去离子水中。</li>
			<li>在 50 ml 管中，加入 1.5 ml 亚硝酸钠片剂溶液和 1.5 ml 副品红溶液。轻轻混匀，静置 5 分钟。加入 40 ml 磷酸盐缓冲液。逐滴小心加入 10 N NaOH 调节 pH 至 6。加入 5 ml α-萘酚丁酸酯溶液，混匀全部溶液，转移至 Coplin 染色缸中。</li>
			<li>在室温下用 CAF 溶液固定载玻片上的细胞 10 秒，然后用去离子水冲洗 45 秒。</li>
			<li>将载玻片转移至含有第 1.5.3.2 步配制溶液的 Coplin 染色缸中，在避光湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。</li>
			<li>用中性水（pH 7）冲洗载玻片 2 分钟，空气干燥。</li>
			<li>滴加数滴亚甲蓝溶液对细胞进行复染，孵育 4 分钟。</li>
			<li>将载玻片浸入去离子水中 2 分钟，空气干燥。封片时，在细胞上滴加一滴封片剂 2，将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>May-Grünwald Giemsa（MGG）染色
	<ol>
		<li>将第 1.3 节制备的细胞进行染色：将载玻片浸入含 May-Grünwald 溶液的 Coplin 染色缸中 3 分钟。</li>
		<li>将载玻片转移至含 pH 6.8 缓冲液的 Coplin 染色缸中 1 分钟。</li>
		<li>将载玻片放入含 Giemsa R 溶液（用 pH 6.8 缓冲液稀释至 1/20）的 Coplin 染色缸中染色 10 分钟。用中性水（pH 7）洗涤 10 秒。</li>
		<li>沥干并空气干燥载玻片。封片时，在细胞上滴加一滴封片剂 2。将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在体 内 急性白血病的开发与表征
注意：四周龄雌性同源C57BL/6J-Ly5.1小鼠在无特定病原体条件下（i.e., 无菌环境）饲养。小鼠在5至6周龄期间进行注射。
<ol>
	<li>静脉注射 C1498 细胞
	<ol>
		<li>用移液器收集悬浮培养的C1498细胞，转移至50 mL离心管中，在350 × g下离心10分钟。用10 mL冷的PBS洗涤细胞两次，制备成10⁷个细胞/mL的细胞悬液7 细胞/ml 的 PBS 悬液。注射前将细胞悬液置于冰上。</li>
		<li>将小鼠置于固定器中，并在超净工作台内无菌条件下进行注射。</li>
		<li>使用29G针头连接注射器，将细胞注入尾静脉。抓住尾部远端，用浸有70%乙醇的纱布擦拭消毒。检查注射器内是否有气泡，确认无气泡后，缓慢注射100 µl C1498细胞悬液（106 尾静脉注射细胞。</li>
		<li>注射完成后，将针头从尾部拔出，并用无菌纱布在注射部位按压以止血。将动物放回笼中，并在接下来的数小时至数天内密切观察其健康状况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>眼眶后采血
	<ol>
		<li>监测PBS和C1498注射小鼠的行为，观察白血病疾病的迹象（例如毛发竖立、脱离群体、在笼内活动减少或无活动。 
		注意：这通常发生在细胞注射后17至19天之间。</li>
		<li>在安乐死前（见步骤2.2.7），于超净台内无菌条件下，在加热灯下进行眼后窝采血，以防止低体温。</li>
		<li>麻醉时使用 150 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的赛拉嗪。通过将 1.5 ml 氯胺酮和 0.5 ml 赛拉嗪溶于 18 ml PBS 溶液中来配制麻醉剂溶液。</li>
		<li>麻醉对照组和白血病小鼠。使用26G针头和1 ml注射器，按每10 g小鼠体重腹腔注射200 µl麻醉溶液。通过检查足底反射消失确认麻醉效果。</li>
		<li>将毛细管插入眼睛的内眼角。血液会从眶窦流入毛细管中。用无菌纱布轻轻按压眼部以控制出血。 
		注意：使用该技术可采集100至200 µl的血液。</li>
		<li>将血液收集至含EDTA的试管中，在分离单个核细胞前将样本置于冰上保存。</li>
		<li>采用颈椎脱位法处死小鼠，随后进行器官分离（第2.3节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器官与细胞分离
	<ol>
		<li>器官分离
		<ol>
			<li>将安乐死的小鼠仰卧置于塑料板上，用针固定动物四肢以方便器官分离。在进行切口前，使用70%乙醇对小鼠消毒。</li>
			<li>使用无菌剪刀，从腹部皮肤向颈部做腹侧切口。切开腹壁以暴露肝脏。剪开肋骨和膈肌以暴露肺脏。将肠道移至一侧，使用无菌剪刀和镊子取出脾脏。</li>
			<li>为分离骨髓，使用无菌剪刀在关节上方股骨顶端处剪断腿部。轻轻拉扯使胫骨与股骨分离，并用镊子和剪刀去除骨骼上的皮肤和肌肉。</li>
			<li>将每个器官和骨骼置于含有冷PBS的50 ml离心管中，并置于冰上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从器官中分离细胞
		<ol>
			<li>称重脾脏后再进行细胞破碎。将脾脏、肺和肝脏通过50 ml离心管中的70 µm细胞筛，使用注射器活塞进行机械破碎，并将细胞收集至30 ml冷PBS中。</li>
			<li>为收集骨髓细胞，将股骨和胫骨置于冰上的培养皿中，使用无菌剪刀剪去骨两端，然后插入连接含有5 ml冷PBS的10 ml注射器的26G针头，冲洗骨髓。
			<ol>
				<li>通过针头/注射器反复吹打使骨髓细胞充分解离，然后将细胞悬液经70 µm细胞滤网过滤至50 ml离心管中。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>将所有含有各器官和骨髓细胞的离心管在350 × g下离心10分钟。弃去上清液，用移液器轻轻吹打，将肺和骨髓中收集的细胞重悬于2 ml裂解缓冲液（1×）中，将肝脏和脾脏中分离的细胞重悬于5 ml裂解缓冲液（1×）中。用预冷的PBS将各离心管补至50 ml。</li>
			<li>以 350 × g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 FACs 缓冲液中，用于流式细胞术分析或显微镜样品制备。用台盼蓝染色后，使用托马细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>器官来源细胞的流式细胞术分析细胞表面染色
	<ol>
		<li>在流式细胞术管中，标记106 使用100 µl FACs缓冲液中含10 µg/ml纯化抗CD16/32抗体从器官中分离的细胞。</li>
		<li>106 骨髓细胞，加入100 µl以下抗体或抗体组合及其相应的同型对照，用FACs缓冲液稀释：抗CD11b/抗CD3(1)/抗Ly6C/抗Ly6G(2)、抗B220(1)/抗CD45.2/抗CD19、抗CD115/抗CD3(1)/抗Ly6C/抗Ly6G(2)、抗CD45.2、抗Ly6G(2)、抗CD11b、抗CD115或单独抗CD19，用于补偿设置。</li>
		<li>向脾细胞中加入100 µl用FACs缓冲液稀释的以下抗体及其相应的同型对照：用于补偿设置的抗体组合包括anti-CD11b/anti-CD3(1)/anti-Ly6C/anti-Ly6G(2)、anti-B220(1)/anti-CD45.2/anti-CD19、anti-CD45.2、anti-Ly6G(2)、anti-CD11b或anti-CD19。</li>
		<li>向肺细胞和肝细胞中加入 100 µl 抗-CD45.2 抗体及其相应的同型对照抗体，用 FACs 缓冲液按 1:100 稀释。</li>
		<li>将所有细胞溶液在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液洗涤细胞。在 350 × g 条件下离心 5 分钟，用移液器吸弃上清液。重复此步骤一次。</li>
		<li>将标记的细胞重悬于500 µl预冷的PBS中。在进行流式细胞术采集与分析前，将细胞置于冰上并避光保存。10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血液单个核细胞的分离及用于流式细胞术分析的免疫荧光染色
	<ol>
		<li>在开始实验方案之前，将分离液预热至室温。</li>
		<li>将血液样本（100 至 200 µl，来自步骤 2.2）转移至微量离心管中，加入 PBS/1 mM EDTA 溶液，使溶液总体积达到 500 µl。使用 30G 针头和 1 ml 注射器，将 500 µl 分离液小心地铺在含血液的溶液下方。切勿混合血液与分离液。</li>
		<li>在室温下以800 × g离心20分钟（不启用刹车）。离心后，用移液器收集细胞环（不透明的白色层），并将细胞转移至微量离心管中。 
		注意：不透明的白色层含有淋巴细胞以及单核细胞，位于下层（分离液）与上层之间。</li>
		<li>加入1 ml PBS溶液，将离心管在350 x g下离心10分钟。用600 µl FACs缓冲液重悬细胞。</li>
		<li>加入10 µg/ml的纯化抗CD16/32抗体，将100 µl细胞悬液分装至六个独立的试管中（每管100 µl）。</li>
		<li>使用FACs缓冲液将以下抗体或相应的同型对照稀释后，各取100 µl标记细胞：用于补偿设置的抗体组合包括anti-CD3 (1)/anti-B220 (1)/anti-CD45.2，或anti-Ly6C/anti-CD115/anti-CD45.2，或单独使用anti-CD45.2和anti-CD115。</li>
		<li>将所有试管在 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液洗涤细胞，然后以 350 × g 离心 10 分钟，用移液器弃去上清液。</li>
		<li>将标记的细胞重悬于500 µl预冷的PBS中。在进行流式细胞术检测与分析前，将细胞置于冰上并避光保存。10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于显微镜观察的骨髓细胞悬液涂片
	<ol>
		<li>按照第1.3节所述步骤操作，但在1.3.1步骤中，使用105 骨髓细胞，并在步骤1.3.4中以72.26 × g离心10分钟，使细胞沉入各腔室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用骨髓细胞进行酯酶活性检测
	<ol>
		<li>进行骨髓酯酶细胞化学检测时，按步骤1.5至1.5.3.7操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨髓细胞的May-Grünwald Giemsa染色
	<ol>
		<li>对骨髓细胞进行染色时，遵循第1.6节所述方案，但在步骤1.6.1中，将载玻片在May-Grünwald溶液中孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li>
<li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+free+C1498+%28granulocytic+leukemia%29+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li>
<li>Tanaka, K. K., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+E.L.4+lymphoma+and+C+Leukemia+in+susceptible+%28C57BL%29+and+resistant+%28B10.D2%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice.</a> Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在以往的研究中，C1498细胞系被描述为可诱导急性粒细胞性5、粒单核细胞性6或NKT7细胞白血病的细胞系。然而，文献中支持这些结论的数据要么缺失，要么不完整。本方案采用多种技术，如流式细胞术、免疫荧光、MGG染色和细胞化学检测，以表征培养的C1498细胞，并确定将其注射到小鼠体内后所诱导白血病的性质。
当我们进行表型分析时 体外 在对C1498细胞进行免疫染色和流式细胞术分析后，我们观察到一些局限性，因为这些细胞表达的细胞表面造血标志物较少，而这些标志物在以往文献中已有描述。6,7与我们的结果一致，Labelle 等 未通过流式细胞术染色检测到C1498细胞表面表达成熟的TCR。然而，他们在检测到CD3ε和TCRVβ8.2 mRNA后，认为该细胞系为NKT细胞系7我们还观察到大多数细胞内存在TCRVβ链和CD3ε分子的表达（&#62; 70%），但由于同时存在Mac-3分子的细胞内表达，无法确定其造血谱系。
髓过氧化物酶、MGG染色以及通过细胞化学方法分析功能性酯酶的检测结果表明，C1498细胞系具有髓系来源特征，由单核母细胞和原粒细胞组成。这些结果与流式细胞术染色分析中获得的Mac-3+细胞百分比一致。尽管这些方法并非定量检测，但它们代表了必须执行的关键实验步骤。事实上，迄今为止，这些方法仍是表征那些不表达或仅表达少量特异性表型标志物的造血细胞谱系及分化阶段的最佳现有手段。
流式细胞术染色有助于证明将C1498细胞尾静脉注射入同源小鼠后急性白血病的发生。分离出浸润至外周血及多种器官的CD45.2+ C1498细胞，并测定其频率。在完成免疫表型分析后，还对骨髓和脾脏中的固有细胞进行了定量分析。当检测C1498细胞在器官中的表型时遇到了局限性，因为这些细胞表达的造血标志物极少（仅有少数为B220+）。为了明确所观察到的急性白血病的性质，采用骨髓样本进行了May-Grünwald Giemsa染色，并检测了单核细胞和粒细胞酯酶的活性。结果显示，C1498细胞保持了其髓母细胞和单核母细胞的形态与功能，揭示了髓单核细胞性白血病的发生。
鉴于本方案中所述的关键步骤，在进行细胞化学反应和MGG染色时应特别注意pH值，因为pH值的偏差可能导致结果的错误解读。例如，α-萘丁酸酯酶活性仅在pH为6.0时对单核细胞具有特异性，因为在较高的pH值下，粒细胞和淋巴细胞也可能在此检测中呈阳性。进行MGG染色前不建议对细胞进行固定，我们已证明在使用C1498细胞进行酯酶细胞化学反应时，仅CAF固定可获得满意的结果。为保持CD115分子的表达及其在流式细胞术中的检测，所有样本（例如，血液、骨髓和脾细胞）在操作过程中均应置于冰上。如果在流式细胞术和/或免疫荧光实验中未观察到染色信号，应检查抗体的货号、储存条件及其稀释比例。材料/设备表中列出的抗体货号是专为流式细胞术或免疫荧光应用所选定的。一抗/二抗或其偶联的荧光染料可能因储存不当（例如，暴露于光照或高温）、稀释错误、反复冻融或使用了被污染的缓冲液而失去活性。应运行阳性对照以确保试剂正常工作，可使用已知表达目标蛋白的小鼠骨髓或脾来源细胞。为避免高背景和非特异性染色，需确保细胞充分洗涤，并在免疫荧光实验中保持高湿度环境，同时严格按照说明稀释抗体。同型对照抗体与一抗应使用相同的浓度和稀释比例，以准确确定样本中的背景水平。对于酯酶细胞化学实验，可通过使用包含纯化的小鼠脾源性粒细胞（Ly6G+）和单核细胞（CD115+）的阳性与阴性对照切片来测试试剂的有效性。
本研究中描述的实验程序表明，C1498细胞注射后小鼠所表现出的多种白血病特征与人类急性粒单核细胞白血病具有共同的典型特征11,12。浸润的白血病细胞导致骨髓中成熟及未成熟（祖细胞和前体细胞）造血细胞减少。外周血中C1498细胞频率较高（&#62; 20%），单核细胞亦如此。由于白血病细胞的浸润，可观察到肝肿大和脾肿大，且脾肿大伴随B淋巴细胞和髓系细胞的显著增加。使用血液分析仪评估血小板数量时，亦可观察到血小板减少症。
已通过实验证明，使用 体外 实验表明，C1498细胞通过分泌可溶性因子抑制正常小鼠造血功能13在多种肿瘤小鼠模型中，未成熟的髓系细胞（包括单核细胞和粒细胞）也被证实可从骨髓迁移至脾脏，在此抑制抗肿瘤特异性T细胞的活化与增殖14因此，骨髓中观察到的造血细胞减少可能是由于造血功能缺陷和/或细胞迁移所致。后一种机制可以解释外周血中单核细胞增多，或脾脏中髓系组分增大的现象。此外，这些细胞也可能来源于增强的脾脏造血功能。事实上，在稳态条件下，已发现某些脾脏B细胞亚群是成熟B淋巴细胞的前体。15此外，在炎症条件下，髓质干细胞和祖细胞被发现会迁移至脾脏，以促进成熟单核细胞的生成。16该方案无法让我们得出有关白血病发病机制的结论，需采用其他功能性及分子检测方法来进一步研究。然而，这些数据包含了急性粒单核细胞白血病临床特征的详细信息，将有助于研究人员评估和理解新型治疗药物的作用效果。

急性髓系白血病（AML）的特征是造血髓系细胞不受控制地增殖，并在不同成熟阶段受阻。这种失调可能影响粒细胞、单核细胞、红细胞或巨核细胞的分化通路1。AML细胞在骨髓中积聚，导致造血功能受损，进而引起血小板减少、淋巴细胞减少和贫血。白血病细胞还可侵入血液和非淋巴器官。
C1498 小鼠模型数十年来一直被用作急性白血病的模型，因为该模型的癌细胞于1941年从一只患有白血病的10月龄C57BL/6（H-2b）雌性小鼠中分离得到。文献报道，将高度增殖的C1498细胞通过静脉、皮下或腹腔注射途径注入易感小鼠后，这些细胞会侵袭血液、造血器官（例如，脾脏和淋巴结）以及非造血器官（例如，肝脏、肺、卵巢和肾脏）2-4。然而，有研究报道该小鼠模型可诱导粒细胞性2,5或粒单核细胞性6白血病。更近的一项发表于2002年的研究将此类癌症描述为小鼠NKT细胞白血病7。因此，关于C1498细胞系的性质及其在小鼠中所诱导的白血病类型，现有文献存在分歧。这些差异主要源于总体上缺乏针对该细胞及其所引起的白血病疾病的详细且最新的公开信息，因为许多相关研究是在20世纪50至70年代完成的。
本文提供了一项详细实验方案，用于描述如何对C1498细胞进行表征，并分析通过尾静脉注射C1498细胞至小鼠体内所诱导的白血病疾病的特性。本方案的第一部分重点描述体外培养的C1498细胞 体外使用针对表面和细胞内造血标志物的荧光标记抗体，通过流式细胞术分析其表型。采用免疫荧光显微镜检测髓过氧化物酶（myeloperoxidase）的存在，并通过酯酶活性的细胞化学染色评估细胞的造血谱系及分化阶段，同时进行May-Grünwald Giemsa染色。随后将C1498细胞注射入小鼠体内，所诱导的急性白血病模型在本文第二部分中予以描述。采用相同的技术方法检测骨髓、外周血、脾脏以及非造血器官（肝脏和肺脏）中白血病细胞及固有细胞的频率与表型。
该方案具有高度可重复性，本文提供的数据将有助于研究人员评估新治疗策略的效果。该白血病小鼠模型已用于测试免疫治疗方案以及多种癌症化疗药物8,9。其疗效通过测定肿瘤负荷的演变和生存率进行评估。本方案可用于在治疗过程中进一步了解白血病细胞及其他造血细胞群体的分布与存续情况。

<table><tbody><tr><td>C1498细胞系</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>查尔斯河实验室</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇，Gibco</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，Gibco（1 M）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液，Gibco&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，Gibco&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（Gibco，含 GlutaMAX 补充剂）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠，Gibco（100 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;流式细胞术染色试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 B220 APC（1）</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>克隆 RA3-6B2，终浓度 1/100</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠B220（2）</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>克隆 RA3-6B2，1/400</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 eFluor450（1）</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>克隆 17A2，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 PE（2）</td><td>BD 生物科学</td><td>555275</td><td>克隆 17A2，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 PE-Cy5（3）</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>克隆 145-2C11，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4 APC（1）</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>克隆 GK1.5，1:500</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4 PE（2）</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>克隆 GK1.5，1:200</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8 生物素 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>克隆 53-6.7，1:100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8 eFluor450（2）</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>克隆 53-6.7，1/500</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD11a</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>克隆 M17/4，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b PE&amp;nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>克隆 M1/70，1/200</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD16/32</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>克隆93，1/400</td></tr><tr><td>纯化的抗小鼠 CD16/32（FcR 封闭）&amp;nbsp;</td><td>BD生物科学</td><td>553141</td><td>克隆 2.4G2</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD18 抗体 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>克隆 M18/2，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>克隆 M18/2，1/50</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>克隆 1D3，1/200</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>克隆 8D9，1/50</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>克隆390，1:100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>克隆 RAM34，1/20</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD44 PE</td><td>BD生物科学</td><td>553134</td><td>克隆 IM7，1/50</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45.2 FITC&amp;nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>克隆104，1:100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD49b/泛NK PE</td><td>&amp;nbsp;BD 生物科学</td><td>553858</td><td>克隆 DX5，1/50</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD80</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>克隆 16-10A1，1/200</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD86</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>克隆 GL1，1/200</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>克隆 M3/84，1/40</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>克隆 AFS98，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>克隆2B8，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>克隆 A7R34，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>克隆 9D1，1/20</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD274（PD-L1）抗体</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>克隆 MIH5，1/200</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>克隆 D7，1/100</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>克隆 HK1.4，1/200</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G&amp;nbsp; (Gr-1) 生物素 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>克隆 RB6-8C5，1/400</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G FITC（2）</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>单克隆抗体 1A8，1:50</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠MHC I类分子（H-2Db）抗体</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>克隆 28-14-8，1/50</td></tr><tr><td>抗小鼠MHC II类分子（I-A/I-E）PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>克隆 M5/114.15.2，1/1000</td></tr><tr><td>PE标记的抗小鼠NK1.1抗体</td><td>BD生物科学</td><td>557391</td><td>克隆 PK136，1/50</td></tr><tr><td>抗小鼠 TCRVb FITC</td><td>BD 生物科学</td><td>553170</td><td>克隆 H57-597，1/50</td></tr><tr><td>链霉亲和素 PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1/200</td></tr><tr><td>免疫荧光染色试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠髓过氧化物酶（重链抗体）&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;抗山羊IgG（Texas Red标记抗体）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 溶液</td><td>BD 生物科学</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>封片剂 1（Fluoromount）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>默克密理博</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;酯酶细胞化学染色试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AS-D 萘酚氯乙酸酯溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>染料溶液（Fast Red Violet LB Base 溶液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6.3 缓冲液浓缩液（TRIZMAL）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>苏木精溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液，37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-萘丁酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>品红溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>封片剂 2（Clearmount）</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;梅-格雷夫斯病&amp;uuml;nwald Giemsa 染色试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>梅-格伦斯费尔德（May-Grünwald）&amp;uuml;nwald溶液</td><td>RAL 诊断</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨R溶液&amp;nbsp;</td><td>RAL 诊断</td><td>320310</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1/20</td></tr><tr><td>pH 6.8 缓冲液</td><td>RAL 诊断学</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;其他材料、试剂和设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮 1000（100 mg/ml）</td><td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 SEDAXYLAN（20 mg/ml）</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）粉末</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>PBS 溶液（1 倍浓缩液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>皂苷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>超纯 0.5 M EDTA 溶液，pH 8.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>分离液（Pancoll Mouse）</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液（红细胞裂解缓冲液）（10倍浓缩）</td><td>BD 生物科学</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4 %）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>50 ml 离心管（Falcon）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞滤网（Falcon）&amp;nbsp;</td><td>康宁生命科学</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;腔室 &amp;和滤膜卡（EZ Cytofunnel Shandon）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片，24 x 24 mm</td><td>克尼特尔玻璃</td><td>VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（Starfrost - 磨边 90）</td><td>克尼特尔玻璃</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>EDTA管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管 150 mm（毛细管）</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>26 G 针头</td><td>Terumo</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;胰岛素注射器及29 G针头</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>30 G 针头&amp;nbsp;</td><td>贝克顿 &amp;和 Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术管（蓝色）</td><td>贝克曼库尔特</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>防水笔（Dakopen）</td><td>Dako</td><td>S200230</td><td></td></tr><tr><td>锋利的无菌剪刀&amp;nbsp;</td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>血球计数板</td><td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（Fisherbrand 塑料）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>微型离心管（1.5 ml）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>圆柱形固定器 15 - 30 克</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 细胞离心涂片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>泰尔茂</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>默克</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布块</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

详细描述小鼠c1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的实验方案

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

自1941年以来，已开展将C1498细胞通过静脉注射注入同源或同源背景小鼠的研究。此类注射可导致急性白血病的发生。然而，该疾病的具体性质在现有文献中尚未得到充分描述。本文提供了一项用于表征C1498细胞的技术方案。 体外 并确定所诱导白血病的性质 体内该实验的第一部分旨在确定培养的C1498细胞的造血谱系及其分化阶段。为此，采用多参数流式细胞术染色检测造血细胞标志物。随后通过免疫荧光显微镜、细胞化学染色以及May-Grünwald Giemsa染色，分别评估髓过氧化物酶的表达、酯酶活性及细胞形态。本方案的第二部分重点描述所诱导的白血病疾病 体内后者可通过测定血液和造血器官中白血病细胞与固有细胞的频率来实现例如、骨髓和脾脏）以及非淋巴组织（例如，肝脏和肺）进行特异性染色和流式细胞术分析。随后通过骨髓的迈-格染色（May-Grünwald Giemsa staining）和特异性酯酶染色来确认白血病的性质。本文展示了在年龄匹配的C1498细胞注射小鼠与PBS注射小鼠中应用该方案所获得的结果。

为表征C1498小鼠模型，我们进行了两个主要步骤。首先，对C1498细胞进行表征，以确定其造血谱系及成熟阶段 体外 (图1随后将这些细胞注射到同源小鼠体内，评估所诱导的白血病特征，包括：白血病细胞浸润情况、细胞表型、骨髓中造血细胞（成熟细胞及祖细胞/前体细胞）的定量分析、外周血中C1498细胞与成熟造血细胞的频率，以及器官肿大（脾脏、肝脏和肺脏）程度和细胞组成分析。
表征C1498细胞表型 体外，细胞使用针对造血前体细胞和成熟细胞表达的分子的抗体进行标记（表1），并使用流式细胞术分析结果。C1498细胞在细胞表面表达Mac-1（CD11b/CD18）（约7%）和B220（&gt; 25%），且表达细胞内CD3ε、T细胞受体（TCR）Vβ链和Mac-3（图2A和B）。细胞对表面标志物 Ly6G、Ly6C、CD115、CD21/CD35、CD19、CD3、CD4、CD8、NK1.1 和 pan-NK 分子呈阴性，且胞内不表达 CD4 和 CD8（数据未显示）。随后检测其造血干细胞及祖细胞标志物的表达情况（表1）。它们在细胞表面不表达 CD117、CD34、Sca-1、CD150 和 CD16/32（数据未显示）。随后检测这些白血病细胞的黏附分子、抗原呈递分子及共刺激分子的表达情况。结果显示，这些细胞表达表面标志物 LFA-1（CD11a/CD18）、CD44、CD31（PECAM-1）和 H-2Db 且对MHC II类分子、CD80、CD86和CD274呈阴性（数据未显示）。因此，C1498细胞同时表达髓系（Mac-1、Mac-3）和淋巴系标志物（B220、CD3、TCR）。
为了更准确地表征其造血谱系，采用免疫荧光显微镜检测了髓过氧化物酶的表达。所有细胞均呈髓过氧化物酶阳性，证实了其髓系来源（图3A）。大多数细胞也呈α-丁酸萘酯酶阳性（图3B，左图），部分细胞呈AS-D氯乙酸萘酚酯酶阳性（黑色箭头）（图3B，右图）。结果表明，这些细胞包含单核细胞和粒细胞的混合群体。经May-Grünwald Giemsa染色后，观察到C1498细胞呈现类似原始细胞的形态，具有较高的核质比，细胞核内含有3至5个核仁，存在核周晕环，细胞质中可见大量空泡，且细胞质呈嗜碱性（图3C）。因此，C1498细胞系由单核母细胞和髓母细胞组成。
随后将C1498细胞（CD45.2+）通过静脉注射注入CD45.1+小鼠体内。小鼠在细胞注射后17至19天内出现濒死状态。为在小鼠因疾病死亡前分析其白血病类型，对其实施了安乐死。同时对注射了PBS的对照组小鼠在相同时间点进行分析以作比较。C1498细胞注射小鼠的骨髓中出现大量C1498细胞浸润，经May-Grünwald Giemsa染色后可见细胞呈现类似原始细胞的形态（图4A）。这些细胞还保留了单核细胞和粒细胞表型（图4B和C），表现出单核母细胞和髓母细胞的积聚，这是急性粒-单核细胞白血病的典型特征。
为了确定白血病细胞浸润后骨髓造血细胞数量是否降低，使用免疫荧光染色和多参数流式细胞术分析定量了CD45.2+ C1498细胞以及B淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体（包括前体细胞、祖细胞和成熟细胞）。白血病细胞占造血细胞的16%至36%（数据未显示）。与PBS注射小鼠相比，C1498注射小鼠中其他各类细胞的数量均显著减少（B细胞亚群平均减少5倍，粒细胞平均减少4倍，单核细胞亚群平均减少3倍）（图5A至C）。
对白血病小鼠和对照小鼠血液样本中单核细胞频率的分析显示，两者所含淋巴细胞比例相似（图6A），但单核细胞和白血病细胞的频率更高。这些特征具有急性粒-单核细胞白血病的典型代表性11（图6B）。
急性粒单核细胞白血病的其他特征中12，C1498细胞注射小鼠出现肝脏肿大（肝肿大）、肺脏和脾脏肿大（脾肿大）（图7A）。CD45.2 的不同频率+ 通过免疫荧光染色和流式细胞术分析在这些器官中检测到C1498细胞（图7B）。由于脾肿大可能由大量浸润的单核细胞引起，我们还估算了脾脏中各细胞群体的比例。与对照组脾脏相比，白血病脾脏中B淋巴细胞、单核细胞和粒细胞组分的细胞数量分别显著增加了约2倍、2.5倍和3倍（图7C).
<img alt="体外/离体白血病研究示意图；流式细胞术、细胞注射、形态学、白血病细胞定量" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 用于表征的实验方案设置示意图 体外 培养的C1498细胞系及 体内 急性白血病的描述 首先确定体外培养的C1498细胞的造血谱系及其分化阶段。随后将C1498细胞注射至同源性小鼠体内，以诱导急性白血病的发生。通过分离骨髓、外周血、脾脏、肝脏和肺组织，分析C1498细胞浸润后的细胞频率、表型及形态学变化。 
IV：静脉注射 
MGG：May-Grünwald Giemsa. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术点图分析C1498细胞表面及细胞内分化标志物。" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. C1498细胞的表型分析 体外 培养。 代表性流式细胞术细胞表面点图和直方图 （A） 和细胞内（B) 显示了与造血成熟细胞分化相关的C1498细胞表达的分子。收集C1498细胞培养物中的细胞，洗涤后使用针对细胞表面CD11b、CD18和B220标记物或其同型对照的荧光标记抗体进行标记。对于细胞内染色，细胞经固定、透化处理后，使用针对Mac-3、CD3ε以及TCR（T细胞受体）Vβ链共同表位的抗体或其同型对照进行标记。分析时通过活细胞设门进行。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="髓过氧化物酶染色显微图像；NBE、CAE、MGG 细胞化学分析，×20 和 ×100 放大倍数。" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 培养的 C1498 细胞的功能与形态学表征。从培养物中收获 C1498 细胞，经离心沉降于载玻片上用于显微镜观察。（A） 采用免疫荧光法检测 C1498 细胞中髓过氧化物酶的表达。（B） 采用细胞化学反应分析 C1498 细胞中 α-萘基丁酸酯酶（NBE）和萘酚 AS-D 氯乙酸酯酶（CAE）的活性。当观察到胞质内出现棕色或红紫色的大颗粒时，分别判定为相应染色阳性。（C） C1498 细胞的 May-Grünwald Giemsa（MGG）染色。每次染色实验均标明显微镜物镜的放大倍数。每张图像均代表三次独立实验的结果。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="骨髓分析；PBS 对照与 C1498 细胞；比较染色方法；显微图像 ×100。" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. PBS 和 C1498 细胞注射小鼠的骨髓形态学。 从小鼠骨髓中分离出 PBS 和 C1498 细胞注射后的小鼠骨髓细胞，并通过离心涂片后进行显微镜观察。(A) 使用 May-Grünwald Giemsa (MGG) 染色；(B) α-萘丁酸酯酶 (NBE) 染色；(C) 萘酚 AS-D 氯乙酸酯酶 (CAE) 染色，通过细胞化学方法评估其活性。在 A 图中，与 PBS 注射小鼠相比，C1498 注射小鼠骨髓中的带状（未成熟）或分叶状（成熟）中性粒细胞可见性较低。B 和 C 图表明，与对照组骨髓相比，白血病骨髓中单核细胞和粒细胞系细胞出现积聚现象。所有显微镜分析均使用 100× 物镜放大倍数进行。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="骨髓细胞亚群流式细胞术分析；B细胞、粒细胞、单核细胞及PBS与C1498组示意图。" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. PBS注射与C1498细胞注射小鼠骨髓细胞群体的定量分析。 从小鼠骨髓中分离PBS注射组和C1498细胞注射组的骨髓细胞，并在完成细胞计数后进行评估。通过免疫染色及活细胞门控流式细胞术分析确定不同细胞群体的频率。（A） B细胞亚群包括从早B细胞至成熟B淋巴细胞各阶段的CD19+B220+细胞；（B） 粒细胞位于CD3-和CD11b+Ly6G+谱系中，包含前体细胞、未成熟及成熟粒细胞；（C） 单核细胞亚群定义为CD3-CD115+，包括从祖细胞至成熟单核细胞各阶段的细胞。每组n = 7只小鼠，数据以均值±标准误的柱状图表示。***，p &lt; 0.0001；**，p &lt; 0.01，采用非配对Student's t-检验比较PBS注射组与C1498注射组小鼠。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示B细胞、T细胞和单核细胞的流式细胞术图；用于白血病细胞分析的CD45.2设门。" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. PBS和C1498注射小鼠中单个核细胞亚群的血液分析。代表性流式细胞术点图显示（A） T和B淋巴细胞百分比，分别定义为PBS注射和C1498细胞注射小鼠中的CD3+和B220+细胞。（B） 通过分析CD115+Ly6C-和CD115+Ly6Chigh细胞，确定C1498白血病小鼠和对照（PBS）小鼠中单核细胞的频率。分析时首先设门选取活细胞。为比较白血病小鼠与对照小鼠，排除了CD45.2+ C1498细胞。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肝脏、肺脏、脾脏器官在PBS、C1498中的结果；白血病细胞；脾细胞分析；图表。" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7. 白血病小鼠与对照小鼠脾细胞群的定量分析。（A） 白血病小鼠与对照小鼠肝脏、肺脏和脾脏肿大的代表性照片。收集脾脏并称重，经组织破碎后计数脾细胞。 （B） 对不同器官进行CD45.2+细胞免疫染色后，通过流式细胞术分析白血病细胞在各器官中的频率，结果以直方图表示。 （C） 经免疫染色及流式细胞术分析设门后，对脾脏中B细胞、粒细胞和单核细胞数量进行定量：分别鉴定活细胞中CD19+B220+、CD3-CD11b+Ly6G+、CD3-CD11b+Ly6C-以及CD3-CD11b+Ly6Chigh 细胞亚群。肺脏、脾脏和肝脏标尺所示长度为1 cm。每组n = 5 - 8只小鼠，数据以均值 ± 标准误（SEM）表示的直方图呈现。*, p&lt; 0.05；**, p = 0.0033，采用非配对Student's t-检验比较PBS注射组与C1498注射组小鼠。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细胞类型</td>
			<td>膜表面或胞内分子</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>前体细胞与成熟细胞</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK细胞</td>
			<td>NK1.1+, pan-NK+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NKT细胞</td>
			<td>NK1.1+, pan-NK+, TCR Vbeta+(8.2), CD3+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T淋巴细胞</td>
			<td>TCR Vbeta+, CD3+, CD4+, CD8+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B细胞前体与B淋巴细胞</td>
			<td>B220+, CD19+, CD21/35+ </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>粒细胞前体与粒细胞</td>
			<td>Ly6G+, Mac-1+, CD11b+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单核细胞前体与单核细胞/巨噬细胞</td>
			<td>CD11b+, Mac-1+, Mac-3+, CD21/35+, CD115+, Ly6Chi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>祖细胞</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多能祖细胞</td>
			<td>CD117+ Sca-1+ CD34+ (Lin- CD150-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>淋巴定向多能祖细胞</td>
			<td>CD117hi Sca-1hi CD127+ (Lin- )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>共同淋巴祖细胞</td>
			<td>CD117lo Sca-1lo CD127+ (Lin- )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>共同髓系祖细胞</td>
			<td>CD16/32lo CD117+ CD34int (Lin- Sca-1-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>粒细胞-巨噬细胞祖细胞</td>
			<td>CD16/32hi CD117+ CD34hi (Lin- Sca-1-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>巨核细胞-红细胞祖细胞</td>
			<td>CD16/32lo CD117+ CD34lo (Lin- Sca-1-)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>造血干细胞</td>
			<td>CD117+ Sca-1+ CD150+ (Lin- CD34-)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 造血细胞谱系及分化标志物。 
CD：分化簇；Lin：成熟细胞标志物；lo：低表达；hi：高表达；int：中等表达；NK：自然杀伤细胞；TCR：T细胞受体。

本文提供了一种可用于表征C1498细胞培养的技术流程 体外 以及小鼠注射后诱导的急性白血病。通过流式细胞术、免疫荧光显微镜、细胞化学和May-Grünwald Giemsa染色进行表型和功能分析。

详细描述小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的实验方案

自1941年以来，已开展将C1498细胞静脉注射至同源或同源背景小鼠的研究。此类注射可导致……

本实验的主要目标是表征小鼠 C1498 细胞及其经静脉注射后在小鼠体内诱导的急性白血病。该实验方法的主要优势在于，C1498 细胞注射后所诱导的小鼠骨髓单核细胞性白血病具有许多与人类疾病相似的特征。该动物模型有助于回答血液学领域的关键科学问题，例如白血病发生及免疫缺陷的潜在机制是什么。该动物模型对白血病治疗具有重要意义，因为它有助于测试新的化疗和免疫治疗药物。首先，将一只5至6周龄的雌性同源C57黑6小鼠转移至无菌超净工作台中，然后将动物放入固定器内。接下来，使用配备29号针头的1毫升注射器吸取100微升细胞悬液。抓住小鼠尾部远端，用浸有70%乙醇的纱布消毒尾部皮肤。随后缓慢地将1×10⁶个细胞注入侧尾静脉。当所有细胞输送完毕后，拔出针头，并用无菌纱布在注射部位轻轻按压。随后将动物放回笼中，并在接下来的数周内密切监测。17至19天后，将毛细管插入麻醉后的白血病动物眼部的内眦处。从眶窦中抽取100至200微升血液至毛细管中。取出毛细管后，用无菌纱布轻轻按压眼部以控制出血。随后将血液转移至EDTA管中，并将管子置于冰上保存，直至进行单个核细胞分离。为分离血单个核细胞，首先加入含1毫摩尔EDTA的磷酸盐缓冲液，使终体积达500微升。然后将样品转移至微量离心管中。接着，使用配备30号针头的1毫升注射器，小心地将500微升分离液沿管壁缓慢铺于血液下方，注意避免混匀各层。通过离心分离细胞，并用移液器将不透明的白色单核细胞层转移至新的微量离心管中。随后，用1毫升PBS洗涤免疫细胞。离心后，将沉淀重悬于600微升FACS缓冲液中，用于染色及流式细胞术分析。将小鼠仰卧固定在塑料板上并固定其四肢，以分离骨髓。用70%乙醇对动物进行消毒。然后，在膝关节上方股骨顶端处切断每条后肢，并轻轻牵拉胫骨，使其与股骨分离。使用镊子和剪刀去除骨骼上的皮肤和肌肉，并将骨骼转移至冰上的培养皿中。用剪刀切除骨骼的末端。然后将连接有含5毫升冷PBS的10毫升注射器的26号针头逐次插入每根骨骼的一端，冲洗骨髓至培养皿中。将细胞悬液反复通过针头数次，以破坏骨髓细胞。随后，将细胞通过新的70微米滤膜过滤至50毫升锥形管中，获得单细胞悬液。离心细胞，弃上清，将沉淀重悬于2毫升裂解缓冲液中。立即用最多50毫升冷的PBS填充试管，并离心细胞。然后，将骨髓沉淀物重悬于冷的FACS缓冲液中，浓度为每毫升1 × 10⁶个细胞。为准备骨髓细胞染色，首先将载玻片放入带有预装滤纸的 disposable chamber 中，并将chamber放入细胞离心机中。向每个滤膜板孔中加入 100 微升 FACS 缓冲液，短暂离心载玻片。离心结束后，向每个孔中加入 100 微升细胞，并离心细胞。然后，小心地从孔中取出载玻片，进行空气干燥。为了染色骨髓细胞，将载玻片浸入盛有迈-格染液的考普林瓶中，染色5分钟。接着，将载玻片转移至pH为6.8的缓冲液中1分钟。然后，将载玻片放入吉姆萨R染液中染色10分钟。随后用pH中性水清洗10秒。清洗后，让载玻片自然晾干，并向每个样本滴加一滴封片剂。然后将盖玻片的一边接触载玻片，小心地将盖玻片缓缓放下覆盖在细胞上，轻轻按压以去除任何气泡。与对照组动物相比，注射C1498细胞的动物其骨髓中出现大量C1498细胞浸润，表现为细胞呈原始细胞样形态。骨髓中浸润的C1498细胞表现出单核细胞和粒细胞表型，分别提示为单核母细胞和髓母细胞，符合急性粒-单核细胞白血病的特征。对注射C1498细胞小鼠血液样本中单个核细胞频率进行流式细胞术分析显示，白血病细胞约占全部白细胞群体的四分之一。对照组与注射C1498细胞的动物之间，T细胞和B细胞的频率相似。然而，注射C1498的小鼠中单核细胞频率较高，这是急性粒-单核细胞白血病的特征。在进行细胞化学染色及May-Grunwald Giemsa染色操作时，必须注意保持适当的pH值、温度和孵育时间。观看本视频后，您应能够充分了解如何表征急性粒单核细胞白血病。该技术建立后，为血液学领域的研究人员探索其他动物模型中自发性和诱导性急性白血病的特性奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

详细的定性C1498小鼠细胞系及其关联白血病小鼠模型协议

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体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

将bm12淋巴细胞移植到C57BL/6受体小鼠体内是系统性红斑狼疮的成熟动物模型。本文介绍如何利用该模型诱导疾病发生，并通过流式细胞术对滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞和浆细胞进行表征分析。...

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详细描述小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的实验方案

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