Name: 非经典氨基酸的具体残留纳入到模型蛋白质使用大肠杆菌无细胞转录翻译系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学习利用大肠杆菌无细胞转录翻译系统将非经典氨基酸类似物位点特异性地掺入模型蛋白质。该方法无需活细胞宿主即可实现毒性氨基酸的整合，适用于医学、制药及结构生物学研究。

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E.G. Worst 和 A. Ott 感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）在合作研究中心 SFB 1027 以及萨尔兰大学提供的财务支持。E.G. Worst、A. Ott 和 V. Noireaux 还感谢人类前沿科学计划组织（Human Frontiers Science Program Organization, HFSPO）提供的经费资助。作者感谢柏林工业大学化学研究所的 Tobias Baumann 和 Stefan Oehm 对本文的审阅与建议。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种易于使用的无细胞表达系统，该策略可将非天然氨基酸（ncAAs）特异性地掺入蛋白质中。具体操作中，向粗提物中添加编码目标蛋白的质粒DNA、能量缓冲液以及相应的氨基酸。需注意，粗提物的取用量取决于其蛋白质浓度34。无细胞表达效率会根据质粒DNA的构建浓度进行优化。能量缓冲液各组分的体积则依据优化后的谷氨酸镁和谷氨酸钾浓度进行调整，以实现模型蛋白在无细胞表达系统中的高产量表达。
可通过对外泌无细胞反应体系进行SDS-PAGE分析，初步评估非天然氨基酸（ncAA）的掺入实验。为进一步详细分析，建议采用高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）来检测ncAA是否在特定位点完全掺入。为进行后续分析，本方案中采用离心柱系统对小体积样品进行His标签蛋白纯化及缓冲液置换。
包括HPLC-ESI质谱分析在内，整个实验方案可在2天内完成。该流程不包含任何特别关键的步骤。然而，为了高效表达目标模型蛋白，必须对Mg-谷氨酸盐、K-谷氨酸盐以及载体DNA的浓度进行优化。强烈推荐使用高效表达载体pBEST-OR2-Or1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500。His标签蛋白的洗脱通常含有高浓度的咪唑（&#62; 150 mM）以及其他盐类，如NaH2PO4（&#62; 300 mM）或NaCl（&#62; 50 mM），这些成分会在质谱分析中产生较高的背景噪音49。将此类洗脱缓冲液置换为合适的蛋白质储存缓冲液，可稳定模型蛋白，并在质谱分析过程中显著降低背景噪音。
因此，Can 在模型蛋白的全部六个位点上取代了 Arg。在该表达系统中，无法检测到任何 Arg 残基。与需要进一步耗竭策略的其他表达系统相比，这简化了 Arg 类似物的残基特异性掺入。29,30. 所介绍的无细胞方法规避了固有的局限性 体内 由于铜的毒性，或单个蛋白质生产策略中对mRNA序列的强依赖性而产生的方法24,31与所采用的相反 体外 系统，体内 Can 裂解为高丝氨酸和羟基胍确实会发生31.
然而，无细胞体系中仍保留有足量的赖氨酸（Lys），可与羟赖氨酸（Hyl）等类似物产生竞争。高效液相色谱-电喷雾质谱分析显示，该模型蛋白中同时含有天然赖氨酸和非天然类似物，且比例各异。位点特异性掺入赖氨酸在总体上是可行的，但要实现完全取代，还需进一步开发耗竭策略，或设计出经过特殊改造、能够高效识别非天然氨基酸（ncAAs）的氨酰-tRNA合成酶（aaRS）和tRNA。
通过以与天然氨基酸相同浓度添加非天然氨基酸（ncAA），我们获得了高效表达的无细胞修饰模型蛋白。掺入效率取决于所掺入ncAA的性质。通过优化ncAA的浓度，可能仍可进一步提高蛋白产量。
实验结果表明，只要非天然氨基酸（ncAA）能够被内源性的经典翻译系统所接受，所采用的系统就适用于在特定位点掺入非天然氨基酸。对于特定非天然氨基酸的位点特异性掺入，还需进一步验证其对应的天然氨基酸残基是否会影响表达系统的正常功能。
无细胞转录-翻译系统可通过来自不同生物体的元件进行工程化改造，以满足不同的需求54。本文所介绍的无细胞系统完全采用大肠杆菌（E. coli）的转录-翻译机制，能够使用噬菌体和大肠杆菌（E. coli）启动子，并可在级联反应中并行或依次发挥作用55。该方法具有广泛的适用性和良好的可操作性，是一种用于进一步研究氨基酸毒性及治疗应用的有力工具。

遗传密码在生物圈中具有普遍性。它编码一组20种标准氨基酸，有时还包括硒代半胱氨酸1或吡咯赖氨酸2。核糖体在tRNA的协助下将遗传密码翻译成氨基酸链，进而折叠形成蛋白质。标准氨基酸的功能基团与翻译后修饰相结合，赋予蛋白质极为广泛的功能3,4。原则上，通过引入更多非标准氨基酸（ncAAs），可克服因标准氨基酸种类有限而导致的功能局限，从而实现新的化学反应和新功能3,4。
掺入非天然氨基酸（ncAAs）有两种互补的方法：位点特异性掺入和残基特异性掺入。前一种方法存在较大的技术难度，因为必须通过一对正交的氨酰-tRNA合成酶（aaRS）-tRNA来扩展经典的氨酰-tRNA合成酶和tRNA体系，且该正交对不能与内源性翻译机制发生相互作用。通过精细的工程化设计，该方法可在目标蛋白质的特定位置以单点突变的形式掺入非天然氨基酸。非天然氨基酸的位点特异性掺入由一个不编码经典氨基酸（cAA）的密码子在基因层面进行编码，通常使用终止密码子5-9。该方法仅在特定位置改变蛋白质功能，而非影响整个蛋白质的功能10-13。
相比之下，残基特异性掺入依赖于经典翻译机制对非天然氨基酸的错误识别。这种掺入的发生是由于氨酰-tRNA合成酶（aaRS）缺乏底物特异性。基于Cohen及其同事的工作14，非天然氨基酸（ncAAs）的残基特异性掺入已实现多种重要应用3,10，其中包括蛋白质的生物正交标记15-17以及通过X射线晶体学解析蛋白质结构18。
由于天然氨基酸酰-tRNA合成酶（aaRS）通常对其同源氨基酸的偏好性高于结构相似的非天然氨基酸（ncAA），因此高效 体内 残基特异性掺入通常需要一种营养缺陷型表达宿主，该宿主无法合成非天然氨基酸（ncAA）对应的天然类似物。将宿主细胞培养在仅提供低浓度相应天然氨基酸（cAA）的培养基中。当天然氨基酸耗尽后，连续补充非天然氨基酸，从而迫使表达宿主在模型蛋白的多个天然指定位置掺入非天然氨基酸。与位点特异性方法相比，该策略通常对整个蛋白质结构产生深远影响，导致蛋白质的理化性质发生显著改变。19,20然而，大多数非天然氨基酸会对表达宿主产生生长抑制作用3，因为它们在重组基因表达过程中会被整合到许多其他非目标蛋白中。这显然限制了 体内 方法。该 体内 掺入对蛋白质结构具有毒性或强烈影响的氨基酸仍然极具挑战性。然而，这些分子在构建具有非凡功能的蛋白质方面最具前景。
一个例子是天然存在的有毒非标准氨基酸L-刀豆氨酸（Can），它是L-精氨酸（Arg）的类似物。它能够影响并阻断与精氨酸相关的调控和催化反应通路，其在活细胞中的存在可导致细胞立即死亡3,21-23。L-刀豆氨酸在蛋白质中取代精氨酸位点会导致蛋白质稳定性降低21-23。由于其由此产生的毒性，在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）及其他常用表达宿主中表达含刀豆氨酸的蛋白质仍是一项挑战。因此，迄今为止仅在一种经过精心设计的单蛋白表达系统中，成功证实了在所有精氨酸位点完全实现体内掺入刀豆氨酸24。然而，刀豆氨酸已被提出可作为抗癌剂25-27，并在人类中作为自身免疫性疾病的刺激因子28。此外，它还被广泛研究其抗代谢、抗菌、抗真菌和抗病毒特性25。这些特性促使人们迫切需要高效且易于操作的方法，以表达含刀豆氨酸的蛋白质，用于药物、医学及功能研究。
尽管存在许多相关问题 体内 可利用无细胞表达系统绕过蛋白质表达的限制， 体外 残基特异性方法迄今尚未得到充分探索。无细胞体系中L-色氨酸类似物的残基特异性掺入29 以及多种非天然氨基酸30 已有报道。这些方法基于高效的T7 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶介导类似噬菌体的转录过程，因而与内源性转录相比会降低基因功能活性。
最近有报道称，利用无细胞表达系统31，已实现将Can完全且特异性地掺入模型蛋白的所有Arg位点32。对该系统稍作改进后，可通过终止密码子抑制技术实现多种吡咯赖氨酸类似物在模型蛋白中的位点特异性掺入33。所采用的无细胞系统31-33基于全E. coli转录-翻译系统，其蛋白表达效率可与当前的噬菌体系统相媲美（重组蛋白产量达0.5 - 1 mg/ml）32，同时保留了大部分原始转录-翻译系统的模块化特性。
本研究详细阐述了如何利用这种全 E. coli 无细胞系统实现位点特异性非天然氨基酸（ncAA）的掺入32。此外，还提出了进一步的步骤，以制备表达的蛋白质并利用高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）进行适当分析。为了拓展该无细胞系统的性能，本研究不仅参考了已发表的Can掺入研究31，还展示了与非天然L-赖氨酸类似物L-羟基赖氨酸相关的新数据。
以下关于非天然氨基酸（ncAAs）位点特异性掺入的实验方案改编自近期在 JoVE 上发表的一项方案34。该原始方案描述了如何使用标准氨基酸进行高效无细胞表达，并介绍了本方法中所用的粗制无细胞提取物、氨基酸溶液、能量储存液及能量缓冲液的制备过程。本方案重点介绍相对于先前方案的修改步骤，以实现非天然氨基酸的位点特异性掺入。建议使用校准过的移液器、低吸附移液器吸头和微量离心管进行配制。下文中采用国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）规定的氨基酸缩写。

<table><tbody><tr><td>护目镜</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>腈类手套（S号）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z768960</td><td>其他尺码货号：M号为Z768979，L号为Z768987，XL号为Z768995</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管 1.5 ml（PCR洁净）</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>微量天平 Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Switzerland</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺（长6 5/8英寸，不锈钢，杆径0.09英寸）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-刀豆氨酸</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C9758</td><td>急性毒性：佩戴护目镜、防尘口罩和防护手套</td></tr><tr><td>羟基赖氨酸（外消旋混合物）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>低温防护手套（S号，防水）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z183490</td><td>其他尺码货号：M号为Z183512，L号为Z183520，XL号为Z183539</td></tr><tr><td>RTS 氨基酸样品包</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany</td><td>BR1401801</td><td>用于自制氨基酸储备液，请遵循此方案&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;，并使用固体氨基酸试剂盒LAA21-1KT、L-脯氨酸（81709-25G）、L-半胱氨酸（30089-25G）、L-组氨酸（53319-25G）和L-赖氨酸（L5501-5G）&amp;nbsp;（均来自Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA（来自 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;，包装规格100 mg）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>500 mg包装规格的货号为10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD（来自酵母）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-磷酸甘油酸（3-PGA）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸镁（Mg-glutamate）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸钾（K-glutamate）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, USA</td><td>质粒#40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% 预制Tris-甘氨酸凝胶（10 cm × 10 cm × 1 mm，10块）</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&amp;szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS电泳缓冲液（10倍浓缩液，5,000 ml）</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&amp;szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS上样缓冲液（2倍浓缩液，50 ml）</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&amp;szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>未标记蛋白分子量标准（宽范围，2-212 kDa）</td><td>New England Biolabs, Ipswich, USA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1060091011</td><td>吸入、皮肤接触或吞咽有毒：佩戴防护手套并在通风橱内操作</td></tr><tr><td>乙酸（99.8%）</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝G-250（10 g）</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>His-Spin 蛋白纯化小量试剂盒</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Germany</td><td>P2002</td><td>该产品亦由Zymo Research Corporation, Irvine, USA分销&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>甘油，99%</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25微型离心柱</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Germany</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>浓缩仪5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>细菌琼脂（Bacto-Agar）</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>珠磨管（聚丙烯微量离心管）</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>珠子，直径0.1&amp;nbsp;mm</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;菌株</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA蛋白测定试剂盒</td><td>Bio-Rad, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>比色皿，1.5&amp;nbsp;ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin 层析柱</td><td>Bio-Rad, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384孔光学底板</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Nunc密封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, USA</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾溶液</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾溶液</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析盒，10k MWCO（试剂盒）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;L离心瓶</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;nbsp;L锥形瓶</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), USA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26XP离心机</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>393127</td><td>或具有相同功能、可离心1 L离心瓶的等效离心机。</td></tr><tr><td>Forma 480轨道摇床</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>480</td><td>或具有相同功能、可同时摇动6个4 L容器的等效摇床。</td></tr><tr><td>JLA-8.1000转子</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>363688</td><td>或适用于上述离心机、可离心1 L离心瓶、离心力达5,000 × g的等效转子。</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R制冷微量离心机</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>368831</td><td>或具有相同功能、可离心2 ml反应管的等效离心机。</td></tr><tr><td>加热块HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Germany</td><td>24465</td><td>或具有相同功能、可将反应管样品加热至100 &amp;deg;C的等效加热块。</td></tr><tr><td>Eppendorf MiniSpin离心机</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5452000018</td><td>或具有相同功能、可离心2 ml反应管的等效离心机。</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3（4 mm轨道直径，0 - 2,500 rpm）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z654760</td><td>或具有相同功能的等效涡旋振荡器。</td></tr><tr><td>Scotsman AF103制冰机</td><td>K&amp;auml;lte-Berlin, Berlin, Germany</td><td>AF103</td><td>或具有相同功能的等效制冰机。</td></tr><tr><td>MyTemp迷你数字培养箱</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z763314</td><td>或具有相同功能、可在29 &amp;deg;C加热样品的等效培养箱。</td></tr><tr><td>EcoCell电泳槽/电泳室</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&amp;szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>AN12005</td><td>或具有相同功能、可使用上述预制凝胶或其他凝胶进行垂直凝胶电泳的等效电泳室。</td></tr><tr><td>Power-phor电泳电源</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&amp;szlig;-Bieberau / Rodau, Germany</td><td>AN12001</td><td>或具有相同功能、可为上述电泳槽/电泳室供电的等效电源。</td></tr><tr><td>VWR Signature人体工学高性能单道可调移液器起始套装1</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>613-5278</td><td>或具有相同精度、可移取相似体积的等效移液器。</td></tr><tr><td>VWR Signature人体工学高性能单道可调移液器起始套装2</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>613-5279</td><td>或具有相同精度、可移取相似体积的等效移液器。</td></tr><tr><td>Pipetman Diamond移液器吸头D10ST（0.1 - 10 &amp;micro;l）</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171101</td><td>或具有相同精度、可移取相似体积的等效低吸附移液器吸头。</td></tr><tr><td>Pipetman Diamond移液器吸头D200ST（2 - 200 &amp;micro;l）</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171301</td><td>或具有相同精度、可移取相似体积的等效低吸附移液器吸头。</td></tr><tr><td>Pipetman Diamond移液器吸头D1000ST（100 - 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l）</td><td>Gilson, Middleton, USA</td><td>F171501</td><td>或具有相同精度、可移取相似体积的等效低吸附移液器吸头。</td></tr><tr><td>50 ml带螺口盖离心管（无菌）</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>15 ml带螺口盖离心管（无菌）</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>14 ml聚丙烯管（圆底，双位通气塞，无菌）</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC色谱柱（3 &amp;micro;m粒径，尺寸L × I.D. 10 cm × 2.1 mm）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 HPLC仪器</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>6500系列高精度四极杆飞行时间质谱（Q-TOF）LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, USA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>乙腈&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega微孔板读数仪</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Germany</td><td>415-101</td><td>或具有相同功能、可测量表达模型蛋白荧光的等效微孔板读数仪。</td></tr><tr><td>Hanna Checker pH计</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>Z351091&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS用甲酸流动相添加剂</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

利用无细胞蛋白表达系统在模型蛋白中实现非天然氨基酸的残基特异性插入 大肠杆菌 无细胞转录-翻译系统

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

标准氨基酸集合赋予了蛋白质极为广泛的功能性。然而，这一残基集合仍对蛋白质的潜在应用构成了限制。引入非标准氨基酸可拓展这一范围。目前有两种互补的非标准氨基酸引入方法。对于位点特异性引入，除内源的标准翻译系统外，还需提供一个正交的氨酰-tRNA合成酶-tRNA配对系统，该系统不与标准系统相互作用；同时还需要一个未被标准氨基酸占据的密码子，通常为终止密码子。这种遗传密码扩展技术可实现非标准氨基酸在蛋白质特定单一位置的插入。本文所述工作则描述了一种残基特异性引入方法，即在内源翻译系统中对遗传密码进行重新分配。翻译系统将非标准氨基酸识别为替代物，并将其插入至原本由标准密码子指定的位置。 即，蛋白质中所有标准氨基酸均被非标准氨基酸取代。非标准氨基酸的引入可能改变蛋白质结构，从而显著改变其物理和化学性质。由于非标准氨基酸类似物会修饰宿主细胞的内源性蛋白质，常作为表达宿主的细胞生长抑制剂，因而具有限制性 体内 蛋白质生产 在体 将有毒的非天然氨基酸掺入蛋白质仍然极具挑战性。本文介绍了一种无细胞方法，可实现用非天然氨基酸L-刀豆氨酸完全替代L-精氨酸。该方法规避了传统方法中存在的固有困难。 体内 表达。此外，还包括用于质谱分析的目标蛋白制备方案。结果表明，L-赖氨酸可被L-羟基赖氨酸替代，尽管效率较低。原则上，只要内源性 体外 翻译系统会识别它。

本方案指导如何将非天然氨基酸（ncAAs）以无细胞体系特异性地掺入模型蛋白中。建议采用SDS-PAGE对掺入实验进行初步评估，并进一步提供步骤以制备适合进行高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI）分析的模型蛋白样品。
此处展示了在无细胞体系中将精氨酸类似物Can以及赖氨酸类似物L-羟基赖氨酸（Hyl）特异性地掺入蛋白质的代表性结果。不同氨基酸溶液、能量缓冲液、编码模型蛋白的载体DNA以及无细胞反应体系均按上述方法制备。对照无细胞反应使用包含20种天然氨基酸（cAAs）的氨基酸溶液。每个实验均设置阴性对照无细胞反应，其所用氨基酸溶液中缺失目标非天然氨基酸（ncAA）对应的天然类似物。在每种方法中，一个无细胞反应在氨基酸溶液中以非天然类似物取代天然氨基酸的条件下表达模型蛋白。随后按照上述方案进行His标签纯化、缓冲液置换以及高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）分析。
模型蛋白为C末端带His标签的deGFP32，是EGFP53的截短版本。其单字母氨基酸序列见（补充材料2）。该模型蛋白分别含有6个Arg和18个Lys位点。 表达载体为pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500。
如果非天然氨基酸（ncAA）完全掺入，则可以假设阴性对照反应不表达deGFP，因为缺少20种天然氨基酸（cAA）中的一种。相反，deGFP必须在另外两个反应中可检测到：一个是在参考的无细胞反应中表达的天然蛋白，另一个是在提供非天然氨基酸的无细胞反应中表达的修饰蛋白。
图1A展示了Can掺入实验的初步SDS-PAGE分析结果。参考的无细胞反应体系中deGFP表达水平最高；在添加Can的无细胞反应体系中，deGFP的表达浓度略低；阴性对照中未检测到deGFP的表达。该SDS-PAGE结果表明Can已成功掺入目标蛋白deGFP中。
为了验证Can完全掺入deGFP的假设，对两种纯化的模型蛋白（如图1B所示）进行了HPLC-ESI质谱分析。图1C展示了纯化deGFP分子的去卷积质谱图。在参考无细胞反应体系中表达的deGFP的去卷积质量为26,192.8 Da；而在含Can的无细胞反应体系中表达的deGFP则呈现26,202.5 Da的质量。天然deGFP6Arg和经修饰的deGFP6Can（其中所有Arg被Can完全取代）的理论质量分别为26,193 Da和26,204 Da。deGFP6Can的质量差异为1.5 Da，处于质谱去卷积的误差范围内。因此，Can在全部6个Arg位点完全掺入deGFP的结果得到证实。
强度降低的两个峰分别对应未形成成熟发色团的天然deGFP6Arg和修饰后的deGFP6Can。发色团通过消除一分子H2O并随后发生氧化反应而自发生成。若该过程未能进行，则导致分子量增加20 Da。
<img alt="蛋白质纯化结果；SDS-PAGE，质谱 deGFP 分析；kDa 标记条带。" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. Can 掺入实验的 SDS-PAGE 分析以及无细胞表达并纯化的 deGFP 分子的 HPLC-ESI 质谱分析。（A）通过 SDS-PAGE 对 Can 掺入实验进行初步评估。从左至右：蛋白质标准品、对照无细胞反应、阴性对照以及提供 Can 而非 Arg 的无细胞反应。（B）表达的 deGFP 分子经 His 标签纯化及缓冲液置换后的 SDS-PAGE 结果。从左至右：蛋白质标准品、来自对照反应的纯化 deGFP、来自含 Can 反应的纯化 deGFP。（C）通过 HPLC-ESI 质谱确认 Can 的完全掺入。天然 deGFP 和完全以 Can 取代 Arg 的修饰型 deGFP 的预期分子量分别为 26,193 Da 和 26,204 Da。每条谱图均归一化至其最高强度（计数）。峰值位置以 Da 标示。为便于可视化，凝胶泳道从原始凝胶图像中提取后拼接，并转换为灰度格式，尺寸经过优化，对比度和亮度得到增强。原始凝胶泳道见补充材料 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图2A展示了Hyl掺入实验的初步SDS-PAGE分析结果。在添加了Hyl的无细胞反应体系中，表达了deGFP。与第一次实验不同的是，在阴性对照反应中可观察到微弱的deGFP条带，这可能是由于无细胞反应体系中存在Lys残基所致。因此，在未添加Lys或Hyl的阴性对照反应中，仍可检测到微弱的deGFP表达。
对于高效液相色谱-电喷雾电离质谱分析，需纯化含有Hyl的无细胞反应中的去折叠GFP分子，并进行缓冲液置换（图2B）。
<img alt="SDS-PAGE 凝胶电泳、蛋白质表达、纯化比较、deGFP 检测、66-27 kDa。" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. Hyl 掺入实验的 SDS-PAGE 分析。 （A）从左至右：阴性对照无细胞反应体系、含 Hyl 的无细胞反应体系及蛋白质标准品。（B）表达的 deGFP 分子经 His 标签纯化及缓冲液置换后的 SDS-PAGE 结果。从左至右：来自含 Hyl 反应体系的纯化 deGFP 及蛋白质标准品。为便于展示，凝胶泳道从原始凝胶图像中截取后拼接，并转换为灰度模式，优化尺寸并增强对比度和亮度。原始凝胶泳道见补充材料 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图3展示了纯化的deGFP分子的去卷积质谱图。图3A证实了无细胞反应中已存在Lys残基的假设。谱图中的主峰对应于天然deGFP（预期质量：26,193 Da）。此外，还可检测到质量高出20 Da但未形成荧光团的deGFP分子。Lys残基优先被赖氨酰-tRNA合成酶加载至tRNALys上，从而导致天然deGFP18Lys的高水平表达。
Hyl 与 Lys 的质量差为 16 Da。由于 Hyl 与 Lys 残基之间存在竞争，因此生成了所有可能的 deGFP 产物（deGFP18Hyl、deGFP17Hyl+1Lys、…、deGFP16Hyl+2Lys）图3B）。诚然，deGFP1Hyl+17Lys 的峰值与未产生荧光团的天然 deGFP 的峰值重叠图3A）且某些峰的质量与预期质量相差超过2 Da。这些质量差异可归因于deGFP物种含量过低导致的高背景噪声。然而，Hyl总体上能够被无细胞系统所掺入。还需进一步优化以消除无细胞反应中的Lys残基。
<img alt="质谱数据分析；质荷比与归一化强度（kDa）的关系图。" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 含有Hyl的无细胞反应中纯化的deGFP分子的HPLC-ESI质谱分析。 （A）主要检测到天然形式的deGFP18Lys（预期质量：含发色团为26,193 Da，不含成熟发色团为26,213 Da）。（B）放大图显示所有可能的deGFP物种均存在（deGFP18Hyl、deGFP17Hyl+1Lys、deGFP16Hyl+2Lys、…、deGFP1Hyl+17Lys）。其预期质量为26,193 Da + N × 16 Da（N = 1, …, 18）。谱图已归一化至最高强度（计数）。峰值位置以Da为单位标示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="粗提物和无细胞反应制备示意图及能量缓冲液成分表。" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1">
补充材料1：计算模板。 在第2节中，以30 µl的粗提物等分试样以及分别为3 mM和30 mM的最优Mg-和K-谷氨酸盐浓度为例，说明了能量缓冲液主混合液的配制。此示例所得主混合液体积可制备3份能量缓冲液等分试样。在第3节中，以90 nM的DNA储备溶液为例，说明无细胞反应体系的配制，使无细胞反应中载体DNA的最优浓度达到10 nM。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
为了实现适当的可追溯性，以下通过插入与上述示例不同的典型数值来演示计算模板的使用：粗提物体积：28 µl，最佳 Mg-谷氨酸盐浓度：2 mM，最佳 K-谷氨酸盐浓度：40 mM，所需缓冲液分装份数：100，无细胞反应中最佳载体浓度：8 nM，DNA 载体储备液浓度：150 nM。
首先，在第一个模板部分的橙色字段中输入 28 µl 作为粗提物体积。然后，在第二个模板部分的橙色字段中分别输入 2 mM 和 40 mM，作为最佳 Mg-和 K-谷氨酸盐浓度。根据最佳的 Mg-和 K-浓度，计算出 15 µl 能量缓冲液的组成以及相应放大后的 16 µl 分装量。在下方相应地输入 100 作为所需能量缓冲液分装份数（每份 16 µl）。模板将自动调整不同缓冲液组分的体积，以配制 1,700 µl 的母液，具体如下：204 µl 的 100 mM Mg-谷氨酸盐储备液、136 µl 的 3 M K-谷氨酸盐储备液、728.73 µl 的 14x 能量溶液、510 µl 的 40% PEG-8000 以及 121.27 µl 无菌 ddH2O。最后，在第三个模板部分，分别输入 8 nM 和 150 nM，作为无细胞反应中的最佳载体浓度以及载体 DNA 储备液浓度。模板将自动调整需加入 28 µl 粗提物中的各组分体积，以完成 90 µl 无细胞反应体系的配制，具体如下：15 µl 能量缓冲液、15 µl 三种不同组成的氨基酸溶液之一、4.80 µl 载体 DNA 溶液（150 nM）以及 27.20 µl 无菌 ddH2O。
<img alt="用于比较分析的带颜色编码氨基酸的蛋白质序列比对图" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
补充材料 2. 模型蛋白 deGFP 的单字母氨基酸序列。该模型蛋白包含 6 个 Arg 和 18 个 Lys 位点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质电泳结果；凝胶条带在kDa标记处；分子量分析。" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
补充材料3. 对应于图1和图2所示凝胶图像的完整长度且未经修饰的凝胶泳道。 每个独立子图中展示的凝胶泳道均来自同一块SDS-聚丙烯酰胺凝胶。在图1和图2中，这些泳道为便于展示而被拼接在一起。蛋白标准品条带的分子量已在图旁标出。(A.1) 图1A的未裁剪凝胶泳道。从左至右：蛋白标准品、参照无细胞反应、阴性对照以及提供Can而非Arg的无细胞反应。(A.2) 图1B的未裁剪凝胶泳道。从左至右：蛋白标准品、来自参照反应的纯化deGFP、来自含Can反应的纯化deGFP。(B.1) 图2A的未裁剪凝胶泳道。从左至右：阴性对照无细胞反应、含Hyl的无细胞反应以及蛋白标准品。(B.2) 图2B的未裁剪凝胶泳道。从左至右：来自含Hyl反应的纯化deGFP以及蛋白标准品。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种易于使用的无细胞表达方案，可将非天然氨基酸类似物特异性地掺入蛋白质中，并包含下游分析方法，适用于医学、药物学、结构和功能研究。

标准氨基酸集合赋予了蛋白质极为广泛的功能性。然而，这一残基集合仍然施加了……

本实验的总体目标是利用无细胞表达系统，将非天然氨基酸类似物特异性地掺入模式蛋白中，并进行后续分析。该方法有助于回答医学、药物学和结构生物学领域中的关键问题，例如非天然氨基酸在蛋白质结构中的作用。该技术的主要优势在于，无需依赖任何活体宿主，即可将具有毒性的氨基酸掺入模式蛋白中。开始实验时，准备20种天然氨基酸（CAAs）的完整储备液，以及预先配制的非天然氨基酸储备液（ncAA），均置于室温下。待溶液完全解冻后，频繁涡旋以重新溶解沉淀的氨基酸，并将氨基酸溶液置于冰上。接着，将1.4毫升无菌双蒸水转移至15毫升离心管中，并置于冰上。依次加入每种氨基酸储备液各175微升，每次加入后充分涡旋混匀，并将管子放回冰上。所有氨基酸加完后，彻底涡旋混匀。将管子孵育至溶液尽可能澄清。将氨基酸母液均分为三份，每份1.35毫升，分装至1.5毫升反应管中，保持在冰上。向第一份分装液中加入50微升浓度为168毫摩尔/升的与ncAA相对应的CAA储备液，制备含有全部20种CAA的氨基酸溶液。充分涡旋混匀后，将反应管放回冰上。将该溶液分装至反应管中，并标记为“+CAA”。在液氮中快速冷冻分装液，并于-80摄氏度保存。接下来，向第二份氨基酸母液分装液中加入50微升无菌双蒸水，以制备含有19种CAA的氨基酸混合液，充分涡旋混匀后置于冰上。将该溶液分装，并将管子标记为“-CAA”。最后，向第三份1.35毫升的分装液中加入50微升浓度为168毫摩尔/升的ncAA储备液，以制备含有19种CAA及ncAA的氨基酸混合液。充分涡旋混匀后放回冰上。分装、标记并冷冻保存各管。在冰上解冻三份30微升的粗提物分装液：一份“+CAA”分装液、一份“-CAA”分装液和一份ncAA分装液，三份能量缓冲液分装液，以及质粒DNA溶液。将无菌双蒸水置于冰上。向其中加入15微升能量缓冲液，上下吹打混匀，并轻轻涡旋以充分混合。向30微升粗提物中加入15微升“+CAA”氨基酸溶液分装液、10微升90纳摩尔/升的质粒DNA溶液和20微升无菌双蒸水。设置阴性对照：向30微升粗提物中加入15微升能量缓冲液、15微升“-CAA”溶液、10微升90纳摩尔/升的质粒DNA溶液和20微升无菌双蒸水。进行ncAA反应：向30微升粗提物中加入15微升能量缓冲液、15微升“+ncAA”溶液、10微升90纳摩尔/升的质粒DNA溶液和20微升无菌双蒸水。然后将所有反应管进行孵育。在进行SDS-PAGE前10分钟，将各黏稠的无细胞反应液1微升分别加入含4微升无菌双蒸水的反应管中稀释。充分涡旋混匀，并用小型离心机短暂离心使液体沉降至管底。向5微升稀释后的无细胞反应液中加入5微升2×上样缓冲液。充分涡旋混匀后，用小型离心机离心。将反应管放入加热金属块中，并确保管盖紧密闭合。同时，将电泳缓冲液转移至凝胶电泳槽中。加热后，用小型离心机离心使液体沉降。离心后，短暂涡旋混匀各管，并重复离心一次。将15微升蛋白标准品和各10微升样品加入加样孔中，开始电泳。小心从胶板中取出凝胶，并固定30分钟。随后将凝胶转移至染色液中染色60分钟。染色后，将凝胶转移至脱色液中脱色60至120分钟。取等体积的His结合缓冲液与无细胞反应液混合，上下吹打混合液。然后轻轻涡旋反应管。组装柱层析系统。充分涡旋His亲和凝胶储备液，直至凝胶树脂完全悬浮。使用1毫升移液枪头，将250微升凝胶树脂转移至层析柱中。在13,000至15,000 × g条件下离心5至10秒。确保凝胶树脂完全排干后，向柱中加入150至300微升无细胞反应液与His结合缓冲液的混合液。离心柱子。弃去穿流液，将柱子放回收集管中。加入250微升His洗涤缓冲液，轻敲并轻轻涡旋柱子以重悬凝胶树脂。离心柱管。弃去收集管，将柱子放入新的1.5毫升标准反应管中。加入150微升洗脱缓冲液，通过轻敲和温和涡旋重悬凝胶树脂。然后离心柱子，使纯化蛋白溶于洗脱缓冲液中。首先取下凝胶过滤离心柱的底盖，然后取下顶盖。将柱子放入2毫升洗涤管中，离心以去除凝胶保存缓冲液。弃去穿流液，然后加入最多400微升蛋白保存缓冲液，再次离心。重复此步骤一次，以确保全部蛋白保存缓冲液均通过凝胶。将柱子放入新的收集管中，小心地将最多100微升纯化的模式蛋白溶液直接加至凝胶床中心。离心柱子。完成缓冲液置换后，将全部100微升模式蛋白溶液转移至敞口管中，放入旋转真空浓缩仪。关闭浓缩仪盖子，于30摄氏度开始旋转浓缩。该SDS-PAGE结果显示L-刀豆氨酸（Can）成功掺入目标蛋白deGFP中，其中参照无细胞反应组的deGFP表达水平最高。无细胞Can反应组的deGFP浓度略低，而阴性对照中未检测到deGFP表达。对表达的deGFP分子进行His标签纯化及缓冲液置换后，进行了SDS-PAGE分析。HPLC

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科研

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生物学

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