Name: 从人多能干细胞使用高度可重复的小分子为基础的分化协议心肌细胞规模化生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 了解利用小分子高效分化人多能干细胞为心肌细胞的可扩展方案。该方法通过生物反应器实现规模化生产，适用于心血管疾病建模与药物筛选，具有成本效益高、重复性好的优势。

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本研究由Royan研究所、伊朗干细胞研究与技术委员会、伊朗国家科学基金会（INSF）、澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC；354400）、澳大利亚国家心脏基金会/Heart Kids Australia（G11S5629）以及新南威尔士州心血管研究网络资助。HF获得了澳大利亚新南威尔士大学国际研究生奖学金的支持。RPH获得了澳大利亚NHMRC澳大利亚研究员项目的支持。作者谨向参与本研究的人类受试者表示衷心感谢。

1. 培养基制备、细胞培养板包被及未分化人多能干细胞的维持
<ol>
	<li>培养基制备 
	注意： 使用0.22 µm滤器对培养基进行灭菌，并在避光条件下于4 °C保存，可保存长达4周。试剂名称、供应商及目录编号列于 材料表.
	<ol>
		<li>小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基的配制：将445 ml DMEM、50 ml 胎牛血清（FBS）和5 ml 细胞培养基例如，谷氨酰胺（Glutamax）。</li>
		<li>将390 ml Knockout-DMEM（KO-DMEM）、100 ml Knockout血清替代物（KO-SR）、5 ml 细胞培养基、5 ml MEM最低必需氨基酸溶液和0.5 ml 55 mM β-巯基乙醇混合，配制hESC培养基。 
		警告： β-巯基乙醇具有毒性，避免吸入、食入和皮肤接触。</li>
		<li>配制 RPMI-B27 (RB) 培养基：将 475 ml RPMI 1640、10 ml 不含胰岛素的 B27、5 ml 细胞培养基、5 ml MEM 必需氨基酸溶液、5 ml 青霉素/链霉素和 0.5 ml 55 mM β-巯基乙醇混合。</li>
		<li>对于解离液（DS），混合 10 ml 0.05% 胰蛋白酶、4 ml KO-SR、1 ml IV 型胶原酶（1 mg/ml）、5 ml KO-DMEM 和 20 µl CaCl₂。2(1 M)</li>
		<li>对于饲养层细胞条件培养基，将15 ml hESC培养基（不含bFGF）加入已长满饲养层细胞（MEF或人包皮成纤维细胞）的T75培养瓶中，饲养层细胞需预先经丝裂霉素C处理或辐照灭活。24小时后收集条件培养基，并更换新鲜hESC培养基。饲养层细胞可在两周内重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养板包被
	<ol>
		<li>ECM凝胶包被：
		<ol>
			<li>购买后，按照生产商说明书，将ECM胶提取物在4 °C下解冻至均匀的液态。用冷的KO-DMEM培养基以1:2的比例稀释，分装后于-20 °C保存。 
			注意： 在制备ECM凝胶期间，确保用于分装和包被步骤的所有材料保持低温。ECM凝胶的浓度随批号不同而有所变化。务必在分装管上标注浓度。分装后的ECM凝胶可在-20 °C保存长达6个月。</li>
			<li>在4 °C下解冻一份ECM凝胶等分试样。解冻后，加入冷的KO-DMEM培养基，使终浓度为0.34 mg/ml。充分吹打混匀，每6孔板每孔加入0.75 ml。在37 °C孵育1小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（MEF）包被 
		注意： MEF饲养层细胞的制备方法此前已有描述。 14
		<ol>
			<li>在室温下用黏附因子（AF）或0.1%明胶（见步骤1.2.3）包被6孔细胞培养板&#160;5 分钟（每孔 0.75 ml，6 孔板每孔）。移除后，将培养板置于生物安全柜（BSC）中晾干。</li>
			<li>将冻存的MEF细胞冻存管转移至37 °C水浴中，解冻约2 - 3分钟。</li>
			<li>向15 ml离心管中加入7 ml MEF培养基。细胞冻存管解冻后，缓慢将内容物转移至15 ml离心管中。在300 x g条件下离心4 min。吸除上清液，将细胞重悬于MEF培养基中。</li>
			<li>计数细胞并接种 1 × 106每6孔板细胞数（约1.7 x 10）5 细胞/孔）。转移至 37 °C / 5% CO₂ 培养箱中2 培养箱中孵育，过夜使细胞贴壁后使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>明胶包被：
		<ol>
			<li>将1 g明胶粉末溶于超纯水中，配制成0.1%（w/v）的溶液。在37 °C孵育15分钟，然后在121 °C下高压灭菌15分钟。冷却后，加入所需数量的孔板中（每孔6孔板加0.75 ml），在37 °C孵育15分钟。 
			注意： 任何剩余的0.1%明胶溶液可在4 °C保存长达1个月。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>层粘连蛋白包被：
		<ol>
			<li>将层粘连蛋白（1 mg/ml）置于 4 °C 解冻至完全融化。取 5 µl 层粘连蛋白溶液，加入 1 ml 冷 PBS，充分吹打混匀，然后加入所需数量的孔板中（每孔 0.75 ml，适用于 6 孔板），于 37 °C 孵育 1 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>旋转烧瓶内表面的硅涂层处理：
		<ol>
			<li>彻底用蒸馏水清洗一个100 ml的旋转培养瓶（带1个玻璃摆锤），使用清洁刷去除任何灰尘和/或培养残留物。加入70%乙醇，30分钟后用蒸馏水冲洗。加入5 M NaOH，过夜放置。</li>
			<li>移除 NaOH 溶液，将烧瓶置于流动水下冲洗 5 分钟。用 1 M HCl 填满烧瓶，静置 15 分钟。再用流动水冲洗烧瓶 5 分钟，随后用双蒸水冲洗两次，以彻底去除残留的 HCl。将烧瓶置于生物安全柜（BSC）中完全晾干。</li>
			<li>向烧瓶中加入1.5 ml硅化溶液，水平旋转以润湿所有表面。对玻璃摆锤重复相同操作。</li>
			<li>将包被的烧瓶置于干燥烘箱中，在 100 °C 下加热 1 小时，或在室温下过夜干燥。若使用烘箱加热，需在加热后于室温下冷却 30 至 60 分钟。</li>
			<li>用去离子水冲洗烧瓶3次，每次15分钟，然后在121 ˚C下高压灭菌20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>未分化人多能干细胞的维持 
	注意： 除非特别说明，所述各实验方案均使用6孔培养板中的孔进行细胞培养，所给体积均适用于该培养板规格。
	<ol>
		<li>在静态悬浮系统中以未分化球体形式培养的人多能干细胞 
		注意： 这些步骤中使用的细胞应已适应单细胞培养。 15
		<ol>
			<li>使用在6孔培养板的ECM凝胶上培养、融合度约为70–80%的人多能干细胞（hPSCs）开始实验。在生物安全柜中利用体视显微镜去除任何已分化的克隆。加入10 µM ROCK抑制剂Y-27632，在37 °C孵育1小时。 
			注意： 使用移液枪头在体视显微镜下手动剥离并轻柔移除已分化的菌落，注意避免移除未分化的菌落。</li>
			<li>从培养箱中取出细胞，吸除培养基。用1 ml PBS洗涤细胞，吸除PBS后加入0.5 ml细胞解离酶。于37 °C孵育4–5分钟。</li>
			<li>加入1 ml hESC培养基，使用细胞刮刀收集细胞。用1000 μl移液器将细胞解离为单细胞。使用台盼蓝和血细胞计数板对活细胞进行计数。</li>
			<li>重悬细胞至 2 × 105 每毫升可行细胞数置于添加了100 ng/ml bFGF和10 µM ROCK抑制剂Y-27632的饲养细胞条件培养基中。使用5 ml移液器将细胞转移至超低吸附培养板（每孔6孔板加入3 ml）。</li>
			<li>2天后，小心地将细胞从培养箱中取出，吸除一半培养基（约1.5 ml），加入含有100 ng/ml bFGF的新鲜条件培养基。</li>
			<li>每天更换一半的培养基，使用添加了100 ng/ml bFGF的条件培养基，持续至第5天。此后，可选择继续培养细胞、传代以维持未分化状态培养（步骤1.3.1.2 - 5），或用于心肌分化（第2节）。若继续培养，每4 - 8天传代一次细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用IV型胶原酶传代饲养层细胞培养的人多能干细胞
		<ol>
			<li>在传代人多能干细胞（hPSCs）之前，于生物安全柜内的体视显微镜下去除任何已分化的克隆集落。吸除培养基，每孔用1 ml PBS洗涤细胞一次。弃去PBS后，每孔加入0.75 ml IV型胶原酶（1 mg/ml），于37 °C孵育5–15分钟，时间以克隆边缘开始卷起、脱落为宜。</li>
			<li>吸出胶原酶，每孔加入1 ml hESC培养基。使用细胞刮将集落刮下并形成小细胞团，然后用1000 μL移液器将细胞转移至15 ml离心管中。注意避免将细胞团过度打散成小碎片。</li>
			<li>用1 ml hESC培养基洗涤孔板，收集残留细胞并转移至15 ml离心管中。在100 × g下离心2分钟。吸除上清液，将细胞重悬于添加了100 ng/ml bFGF的hESC培养基中。</li>
			<li>从培养箱中取出一块MEF包被的培养板，吸除MEF培养基。根据需要按1:3至1:10的比例传代细胞。每天更换新鲜的hESC培养基，其中添加100 ng/ml bFGF。每4至8天传代一次细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在静态悬浮系统中将人多能干细胞作为球体进行分化
<ol>
	<li>使用第5天未分化的类球体开始实验，类球体的制备方法见第1.3.1节。 
	注意： 此阶段类球体的平均大小应为175 ± 25 µm。开始分化实验时，至少应使用50个类球体。</li>
	<li>使用5 ml移液管将类球体转移至15 ml离心管中。用1 ml RB培养基洗涤孔板，以收集残留的类球体，并将其加入同一15 ml离心管中。静置5分钟，待类球体沉降形成松散沉淀（切勿离心）。小心吸除上清液，避免吸走任何类球体。</li>
	<li>加入3 ml添加了12 µM CHIR99021的RB培养基。将细胞重新转移至一个6孔超低吸附培养板的孔中。24小时后，重复步骤2.2。 
	注意： RB培养基对光敏感。操作RB培养基时，请关闭生物安全柜的照明灯。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入3 ml RB培养基。将细胞重新转移至一个6孔超低吸附培养板的孔中。24小时后，重复步骤2.2。</li>
	<li>加入3 ml添加了IWP2、purmorphamine和SB431542（各5 µM）的RB培养基。将细胞重新转移至一个6孔超低吸附培养板的孔中。2天后重复步骤2.2。</li>
	<li>将细胞重悬于3 ml RB培养基中，并转移至明胶包被的培养板，以允许细胞贴壁。 
	注意： 此阶段也可将细胞保持在悬浮状态。若需继续进行静态悬浮培养，请将细胞重新转移至超低吸附培养板。</li>
	<li>2天后更换为3 ml RB培养基。次日，细胞培养物将开始搏动。此后每3–4天用RB培养基更换一次培养液。</li>
</ol>
3. 在搅拌式悬浮生物反应器中将人多能干细胞分化为球状体
<ol>
	<li>使用静态悬浮培养至少传代3次的未分化类球体开始实验（参见第1.3.1节）。加入10 µM ROCK抑制剂Y-27632，于37 °C孵育1小时。</li>
	<li>将细胞从培养箱中取出，用5 ml移液器将所有类球体转移至15 ml离心管中。用1 ml hESC培养基洗涤孔板以收集残留的类球体，并加入同一15 ml离心管中。静置5分钟，直至类球体沉降形成松散的细胞团（切勿离心）。小心吸除上清液，避免吸走类球体。</li>
	<li>加入1 ml PBS洗涤细胞。静置5分钟，直至类球体沉降形成松散的细胞团（切勿离心）。移除上清液，加入0.5 ml含0.05%胰蛋白酶和0.53 mM EDTA的溶液。于37 °C孵育4–5分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出细胞，加入1 ml hESC培养基。使用1,000 µl移液器将细胞解离为单细胞，用台盼蓝染色和血细胞计数板计数细胞。将细胞重悬于添加了100 ng/ml bFGF和10 µM ROCK抑制剂Y-27632的条件培养基中，调整浓度至2 × 105 个活细胞/ml。</li>
	<li>将100 ml细胞悬液转移至含一个摆动件的硅化生物反应器瓶中（参见第1.2.5节）。初始振荡速度设为35 rpm，24小时后提高至40 rpm。</li>
	<li>48小时后，停止振荡5–10分钟，直至所有类球体沉降至瓶底。更换一半培养基为添加了100 ng/ml bFGF的条件培养基。此后每24小时重复此操作，直至第5天。 
	注意： 此阶段应形成平均大小为175 ± 25 µm的未分化类球体。</li>
	<li>停止振荡5–10分钟，直至所有类球体沉降至瓶底。将所有类球体转移至50 ml离心管中，保留最小体积的培养基（少于50 ml）。弃去生物反应器瓶中剩余培养基，仔细确保无类球体残留于容器内。</li>
	<li>静置5–10分钟，直至所有类球体沉降至50 ml离心管底部，然后小心吸除上清液，避免破坏松散的细胞团。用25 ml含钙和镁的PBS或RB培养基洗涤，再次静置5–10分钟，使类球体在50 ml离心管底部沉降并重新形成松散细胞团。</li>
	<li>小心吸除上清液，加入40 ml添加了12 µM CHIR99021、10 µM ROCK抑制剂和0.1%聚乙烯醇（PVA）的RB培养基。重悬类球体，并将所有细胞转移回生物反应器瓶中。补加培养基至总体积为100 ml。以40 rpm重新开始振荡，持续24小时。 
	注意： RB培养基对光敏感。操作时应保持生物安全柜处于关闭照明模式。</li>
	<li>重复步骤3.7–3.8。</li>
	<li>小心吸除上清液，加入40 ml添加了0.1% PVA的RB培养基。重悬类球体，并将所有细胞转移回生物反应器瓶中。补加培养基至总体积为100 ml。以40 rpm重新开始振荡，持续24小时。</li>
	<li>重复步骤3.7–3.8。</li>
	<li>小心吸除上清液，加入40 ml添加了IWP2、purmorphamine和SB431542（各5 µM）的RB培养基。重悬类球体，并将所有细胞转移回生物反应器瓶中。补加培养基至总体积为100 ml。以40 rpm重新开始振荡，持续2天。</li>
	<li>重复步骤3.7–3.8。</li>
	<li>小心吸除上清液，仅加入40 ml RB培养基。重悬类球体，并将所有细胞转移回生物反应器瓶中。补加培养基至总体积为100 ml。以40 rpm重新开始振荡。48–72小时后应观察到搏动的类球体。</li>
	<li>每3–4天更换一半培养基，仅使用RB培养基。停止振荡5–10分钟，直至所有类球体沉降至容器底部。小心吸出50 ml培养基，避免扰动类球体，并小心加入50 ml新鲜RB培养基进行替换。</li>
</ol>
4. 使用未适应单细胞传代培养的 hPSCs 进行分化
注意： 该方法特别适用于大量人多能干细胞系的快速分化，无需适应单细胞培养技术，而后者是一项极为耗时且劳动密集型的过程。该技术适用于对酶法细胞解离高度敏感的细胞系，例如新建立的人多能干细胞系。&#160;
<ol>
	<li>使用在MEF上培养的hPSCs（如第1.3.2节所述），细胞融合度约为70 - 80%时开始实验。在生物安全柜内的体视显微镜下移除任何已分化的克隆。</li>
	<li>移除培养基，加入0.5 ml解离溶液（DS）。孵育0.5 - 1分钟，直至MEF细胞变圆，hPSCs克隆边缘变得清晰。迅速移除DS，加入0.75 ml IV型胶原酶（1 mg/ml）。</li>
	<li>将细胞在37 °C下孵育5 - 15分钟。孵育期间在显微镜下观察细胞，当整个克隆开始脱离时，移除胶原酶并加入1.5 ml hESC培养基。 
	注意： 若孵育15分钟后大部分克隆仍附着，将细胞放回培养箱，每5分钟在显微镜下检查一次。注意胶原酶处理时间不得超过30分钟。若胶原酶溶液中有大量漂浮的克隆，不要移除胶原酶，仅需加入1 ml hESC培养基。</li>
	<li>使用p1,000移液器轻轻吹打克隆，使其以完整克隆形式脱离。避免将克隆打碎成小片段。使用5 ml移液器将细胞转移至15 ml离心管中。用1 ml hESC培养基冲洗孔板，收集残留细胞并加入同一离心管中。静置5分钟，待所有克隆沉降（切勿离心）。</li>
	<li>小心移除上清液，加入2 ml含100 ng/mL bFGF的hESC培养基。使用5 ml移液器将细胞转移至超低吸附培养板中（24孔板每孔1 ml，6孔板每孔3 ml）。在37 °C/5% CO2条件下孵育至少6小时（最长不超过12小时）。</li>
	<li>在此期间，为步骤4.7准备所需数量的层粘连蛋白包被的孔/板。推荐的细胞转移比例为：1个6孔板中完全融合的孔转移至2个24孔板的孔（或按表面积等比例换算）。</li>
	<li>6小时后，使用5 ml移液器小心将克隆聚集体转移至15 ml离心管中。用RB培养基冲洗培养板，收集残留聚集体并加入同一15 ml离心管中（24孔板每孔0.5 ml，6孔板每孔1 ml）。静置5分钟待聚集体沉降后，小心吸走上清液。注意不要扰动松散的沉淀物。</li>
	<li>加入2 ml含12 µM CHIR99021的RB培养基，使用5 ml移液器小心转移至预先准备好的层粘连蛋白包被的孔中（如第1.2.4节所述），以促进细胞贴壁。</li>
	<li>24小时后，小心移除每孔中的培养基，仅加入1 ml RB培养基。 
	注意： 部分聚集体可能仅微弱贴附于培养板上，因此在更换培养基过程中应避免移除可能脱落的大聚集体。但应尽可能去除细小的细胞碎片。</li>
	<li>再过24小时后，小心移除培养基，加入含IWP2、purmorphamine和SB431542（各5 µM）的RB培养基。</li>
	<li>两天后更换为仅含RB培养基。次日细胞将开始搏动。</li>
	<li>此后每3 - 4天用仅含RB培养基更换一次培养基。</li>
</ol>

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</ol>

维克多·张心脏研究所不从事亦不支持以人类胚胎破坏为目的的研究。该研究所对本研究的贡献仅限于人类诱导多能干细胞的相关工作。
作者声明不存在任何竞争性财务利益。

由人多能干细胞（hPSCs）衍生的心肌细胞是用于人类疾病建模、药物筛选/毒性测试，以及未来可能用于再生治疗的极具吸引力的细胞来源。然而，使用这些细胞的主要障碍之一是难以提供足量且高质量的细胞材料以实现其有效应用。通过我们所描述的实验方案，我们提供了一种克服这一局限性的方法。
近期研究表明，靶向心肌发生过程中特定信号通路的合成小分子可促进心脏分化16,17,22,23。这些小分子现已被用作重组细胞因子和含有多种未明确定义成分且存在批次差异的血清的替代方案。与细胞因子或生长因子培养基相比，小分子方案除具有特异性强的优点外，还具有成本低廉、组分稳定、保存期限更长的优势。由于本研究报道的方案中所使用的小分子为低分子量化合物，其结构和功能明确，且能够轻易穿过细胞膜24,25。
迄今为止，已采用多种方法对人多能干细胞（hPSCs）进行研究，以建立稳健且可扩增的分化技术；然而，这些方法大多基于二维、小规模的静态培养体系，可能导致扩增能力差和细胞均一性不佳。目前，强制聚集法、微打印技术以及微载体培养...

人类多能干细胞（hPSCs），包括人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（hiPSCs），具有自我更新的能力，并能分化为三个胚层来源的细胞1,2。由于这些特性，hPSCs为生成和规模化生产与疾病相关的细胞类型提供了宝贵且无限的资源，可用于人类疾病建模3-5、高通量药物筛选和毒性检测6,7，并可能应用于临床8。由hPSCs诱导生成心肌细胞，使我们能够特异性地研究复杂人类心血管疾病的发病机制及其潜在治疗方法，这在此前因缺乏相关的动物模型和/或难以获得受累的原代组织而无法实现。
上述所有人多能干细胞（hPSCs）的应用均需要大量高纯度且具有功能的心肌细胞。因此，建立一种高效、可重复且可扩增的 体外 适用于多种hPSC细胞系的心脏分化方案至关重要。传统心肌细胞分化方案已采用多种策略，例如拟胚体形成 9共培养技术 10，使用细胞因子混合物进行诱导 11 和蛋白质转导方法 12尽管这些技术已取得进展，但在尝试使用多种人多能干细胞（hPSC）系时，大多数方法仍存在效率低下、需要昂贵的生长因子或通用性有限等问题。迄今为止，这些挑战限制了hPSC来源的心肌细胞在动物模型中的细胞治疗研究，以及在制药行业用于药物发现的应用。 13因此，开发出稳定且经济的规模化培养技术，以实现功能性人多能干细胞来源的心肌细胞的大规模生产，将极大推动其在商业和临床领域的应用。
在本文中，我们报道了一种经济高效、一体化的心脏分化系统的开发，该系统具有高效性、可重复性，并适用于多种来源和培养方法建立的人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），包括利用生物反应器大规模生产高度富集的人多能干细胞来源心肌细胞的方法。此外，我们还优化了该方案，使其适用于未适应无饲养层和/或单细胞培养的hPSC细胞系，例如新建立的hiPSCs或与疾病机制分析相关的大量hPSC细胞系。

<table><tbody><tr><td>敲除型DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>敲除型血清替代物（KO-SR）</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-843</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14287072</td><td></td></tr><tr><td>贴壁因子（AF）</td><td>Life Technologies</td><td>S006100</td><td></td></tr><tr><td>ECM胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>B27（不含胰岛素）</td><td>Gibco</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Life Technologies</td><td>17140-019</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素C</td><td>Bioaustralis</td><td>BIA-M1183</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-172</td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-335</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-561</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素胺</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-465</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y-27632</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-169</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇（PVA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>363073</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Accumax&amp;nbsp;</td><td>Innovative Cell Technologies Inc.</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CELLSPIN</td><td>Integra Biosciences</td><td>183 001</td><td></td></tr><tr><td>带一个摆轮的100 ml旋转烧瓶&amp;nbsp;</td><td>Integra Biosciences</td><td>182 023</td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）</td><td>实验室自制（或商业可得）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人多能干细胞系（hPSC）</td><td>实验室自制（或商业可得）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

为了在研究、疾病建模、药物开发和临床应用中最大化人类多能干细胞（hPSCs）的效益，需要建立可靠的方法以实现包括心肌细胞在内的功能性细胞类型的规模化生产。本文展示了通过时序性调控WNT、TGF-β和SHH信号通路，可在静态悬浮培养和搅拌式生物反应器系统中，高效地将单细胞传代的hPSC系分化为心肌细胞。采用该策略后，在培养15天后，几乎全部类胚体均出现搏动，且持续含有&#62;80%的心肌肌钙蛋白T阳性细胞，该结果已在多个hPSC系中得到验证。我们还报告了该方案的一种改进版本，适用于尚未适应单细胞传代的细胞系，其有效性已在42个hPSC系中得到证实。利用这些方案生成的心肌细胞表达谱系特异性标志物，并表现出预期的电生理功能。本方案为大规模生产人源心肌细胞提供了一个简单、高效且稳健的技术平台。

为了建立一种简单的大规模从人多能干细胞（hPSCs）分化为心肌细胞的方法，我们设计了一种方案：首先使用WNT/β-catenin通路激活剂（CHIR99021）16处理细胞，随后使用WNT/β-catenin通路和转化生长因子-β（TGF-β）通路的抑制剂（分别为IWP216和SB43154217），最后使用音猬因子（SHH）通路激活剂（purmorphamine）17（图1A）。在本分化策略中，约50%的类球体（直径为175 ± 25 µm）在启动分化7天后开始搏动，至第10天时搏动比例上升至100%。有趣的是，采用该方案观察到分化的类球体可持续搏动达分化启动后60天之久18。通过对解离后的类球体进行流式细胞术分析的群体研究表明，在第15天时，超过90%的细胞为心肌肌钙蛋白T阳性（cTnT+）细胞，而平滑肌和内皮细胞标志物阳性的细胞比例均低于12%（3.1%为血管性血友病因子阳性（vWF+</su...

本文介绍一种针对人多能干细胞（hPSCs）的稳定、快速且可扩展的心肌细胞分化方案。利用该大规模方法获得的心肌细胞可提供足够数量的细胞，有效用于人类心血管疾病建模、高通量药物筛选，以及潜在的临床应用。

充分发挥人多能干细胞（hPSCs）在科研、疾病建模、药物开发及临床应用中的潜力，需要可靠的……

本实验的总体目标是高效且可重复地将人类多能干细胞分化为心肌细胞。该方案可在生物反应器中进行放大，或经修改后用于对单细胞培养敏感的细胞系的分化。该方法有助于利用人源诱导性多能干细胞解答心脏疾病建模中的关键问题。该技术的主要优势在于成本低，且对人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞均具有高效性、可重复性和广泛适用性。我们今天的演示者是 Hananeh Fonoudi，她目前是维多利亚·张心脏研究所的博士研究生，来自 Royan 研究所。在包被前，使用清洁刷和蒸馏水彻底清除 100 毫升玻璃摆瓶式转瓶中的任何灰尘或培养残留物。接下来，用70%乙醇充满烧瓶。30分钟后，用蒸馏水冲洗烧瓶，并加入5摩尔氢氧化钠。次日早晨，用流动水冲洗烧瓶5分钟，然后加入1摩尔盐酸。15 分钟后，在流动水下冲洗烧瓶另外 5 分钟，随后用双蒸水冲洗两次。将烧瓶置于生物安全柜中晾干。然后，向烧瓶中加入 1.5 毫升硅化溶液，并水平旋转烧瓶，使硅化溶液覆盖所有表面。将包被的烧瓶在干燥烘箱中于 100 摄氏度加热一小时。待烧瓶冷却后，用去离子水冲洗三次，每次 15 分钟。然后，在 121 摄氏度下高压灭菌 20 分钟。将未分化的类球体使用单细胞传代方法传代至少三次后，用5毫升移液管将所有未分化的类球体转移至15毫升锥形管中。用1毫升人胚胎干细胞培养基洗涤各孔，以收集残留的类球体，并将洗涤液与收集的类球体合并。静置5分钟，使类球体沉降形成松散的沉淀。然后，吸除上清液，注意不要吸走任何类球体。接着，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗类球体五分钟，并将其在五毫升胰蛋白酶-EDTA溶液中于37摄氏度孵育。四至五分钟后，加入一毫升人胚胎干细胞培养基终止反应，并使用P1000移液器将类球体解离为单细胞悬液。通过台盼蓝染色排除法计数后，用添加了碱性成纤维细胞生长因子和ROCK抑制剂的条件培养基将细胞重悬，调整细胞浓度为每毫升20万个细胞，然后将100毫升细胞悬液转移至硅化处理的生物反应器培养瓶中。将培养瓶置于摇床上，转速设为35 RPM。24小时后，将摇床转速提高至40 RPM。48小时后，停止摇动5至10分钟，直至所有重新形成的类球体沉降至培养瓶底部，更换一半培养基为添加了碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基。随后，以40 RPM重新启动摇床继续培养24小时，并在接下来的三天中每天采用相同方法更换一半培养基。第五天，停止摇床5至10分钟。然后，将所有类球体转移至一个50毫升离心管中，所用培养基体积不超过50毫升。弃去培养瓶中剩余的培养基，注意确保容器中无残留的类球体。随后，小心移除已沉降类球体的上清液，并用25毫升含钙和镁的PBS洗涤细胞簇。孵育 5 到 10 分钟后，去除洗涤液，并将类球体重悬于 40 毫升添加了糖原合成酶激酶-3 抑制剂、ROCK 抑制剂和聚乙烯醇的 RPMI-B27 培养基中。将所有类球体转移回生物反应器烧瓶中。然后加入新鲜的 RPMI-B27 培养基至总体积为 100 毫升，并以 40 RPM 重新启动振荡。24小时后，采用相同步骤更换为RPMI-B27培养基。再过24小时后，再次采用相同步骤更换为含有IWP2、purmorphamine和SB43的RPMI-B27培养基。继续培养48小时。通常在七天后观察到首次搏动。对于尚未适应单细胞培养的人多能干细胞系的快速分化，首先将生长在小鼠胚胎成纤维细胞上、汇合度达到70%至80%的人多能干细胞培养物，用5毫升解离液处理30至60秒。解离液作用时间应仅限于MEF细胞变圆且hPSC克隆边缘变得清晰为止。如果细胞培养时间过长，将无法正常分化。在适当的时间，迅速用 75 毫升 IV 型胶原酶替代消化液，并在 37 摄氏度下孵育细胞 5 至 15 分钟，每隔几分钟在显微镜下观察培养情况。当整个细胞集落开始脱落时，将胶原酶替换为 1.5 毫升人胚胎干细胞培养基，并使用 P1000 移液器轻轻将整个细胞集落从培养板底部剥离。细胞应小心地脱离，以避免集落分散成小碎片。随后，使用5 mL移液器将细胞转移至15 mL锥形管中，并用1 mL人胚胎干细胞培养基洗涤培养孔，将残留的细胞收集至15 mL管中。静置沉淀5分钟后，小心弃去上清液，加入2 mL新鲜的人胚胎干细胞培养基，其中添加碱性成纤维细胞生长因子。使用一支新的5 mL移液管，将细胞转移至超低吸附培养板中，将细胞集落孵育6至12小时。孵育结束后，用5 mL移液管小心地将集落聚集体转移至新的15 mL离心管中，并用RPMI-B27培养基冲洗以收集残留的聚集体。待集落沉降后，弃去上清液，更换为新鲜的RPMI-B27培养基（添加糖原合成酶激酶-3抑制剂），然后小心地将集落转移至包被有层粘连蛋白的培养板中，在37°C条件下进行贴壁培养。24小时后，更换为RPMI-B27培养基。再过24小时后，更换为含有IWP2、purmorphamine和SB43的RPMI-B27培养基。通常在七天后观察到首次搏动。迄今为止，该静态悬浮分化方案已在五种人类胚胎干细胞系和四种人类诱导性多能干细胞系上进行了测试，各细胞系均产生超过90%的搏动类球体，表明该方案在不同人类多能干细胞系之间具有高度可重复性。在搅拌式悬浮生物反应器环境中，分化中的类球体表现出与静态系统相似的行为，在第10天时观察到约100%的类球体发生搏动。事实上，在第30天采集的搏动类球体切片分别显示出心肌肌钙蛋白T的胞质表达以及心脏转录因子NKX2.5的核表达。此外，当未分化的类球体被未分化的细胞聚集体替代时，分化后七天即可观察到搏动的细胞簇。在42个测试的人诱导多能干细胞系中，第15天时平均超过60%的细胞群呈心肌肌钙蛋白T阳性。这些搏动的细胞簇也表现出与搅拌式悬浮生物反应器生成的类球体相似的心肌肌钙蛋白T胞质表达以及NKX2.5核表达。在进行该操作时，重要的是要记住使用已适应单细胞培养的hPSCs，且在生物反应器中诱导分化前至少需经过连续三次传代。该方法可与其他心肌细胞富集技术联合使用，以获得高纯度的心肌细胞群体。该技术为hPSC来源的心肌细胞的商业化应用奠定了基础。它在临床、药物、组织工程以及器官或类器官发育应用中具有潜在用途。观看本视频后，您应能充分理解如何高效地将人多能干细胞分化为心肌细胞，并在生物反应器中扩大培养规模。

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JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从人多能干细胞使用高度可重复的小分子为基础的分化协议心肌细胞规模化生产

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。...

利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。...

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

了解利用小分子高效分化人多能干细胞为心肌细胞的可扩展方案。该方法通过生物反应器实现规模化生产，适用于心血管疾病建模与药物筛选，具有成本效益高、重复性好的优势。

利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

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