利用高可重复性小分子诱导分化方案实现人多能干细胞向心肌细胞的大规模生产

本实验的总体目标是高效且可重复地将人类多能干细胞分化为心肌细胞。该方案可在生物反应器中进行放大，或经修改后用于对单细胞培养敏感的细胞系的分化。该方法有助于利用人源诱导性多能干细胞解答心脏疾病建模中的关键问题。

该技术的主要优势在于成本低，且对人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞均具有高效性、可重复性和广泛适用性。我们今天的演示者是 Hananeh Fonoudi，她目前是维多利亚·张心脏研究所的博士研究生，来自 Royan 研究所。在包被前，使用清洁刷和蒸馏水彻底清除 100 毫升玻璃摆瓶式转瓶中的任何灰尘或培养残留物。

接下来，用70%乙醇充满烧瓶。30分钟后，用蒸馏水冲洗烧瓶，并加入5摩尔氢氧化钠。次日早晨，用流动水冲洗烧瓶5分钟，然后加入1摩尔盐酸。

15 分钟后，在流动水下冲洗烧瓶另外 5 分钟，随后用双蒸水冲洗两次。将烧瓶置于生物安全柜中晾干。然后，向烧瓶中加入 1.5 毫升硅化溶液，并水平旋转烧瓶，使硅化溶液覆盖所有表面。

将包被的烧瓶在干燥烘箱中于 100 摄氏度加热一小时。待烧瓶冷却后，用去离子水冲洗三次，每次 15 分钟。然后，在 121 摄氏度下高压灭菌 20 分钟。

将未分化的类球体使用单细胞传代方法传代至少三次后，用5毫升移液管将所有未分化的类球体转移至15毫升锥形管中。用1毫升人胚胎干细胞培养基洗涤各孔，以收集残留的类球体，并将洗涤液与收集的类球体合并。静置5分钟，使类球体沉降形成松散的沉淀。

然后，吸除上清液，注意不要吸走任何类球体。接着，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗类球体五分钟，并将其在五毫升胰蛋白酶-EDTA溶液中于37摄氏度孵育。四至五分钟后，加入一毫升人胚胎干细胞培养基终止反应，并使用P1000移液器将类球体解离为单细胞悬液。

通过台盼蓝染色排除法计数后，用添加了碱性成纤维细胞生长因子和ROCK抑制剂的条件培养基将细胞重悬，调整细胞浓度为每毫升20万个细胞，然后将100毫升细胞悬液转移至硅化处理的生物反应器培养瓶中。将培养瓶置于摇床上，转速设为35 RPM。24小时后，将摇床转速提高至40 RPM。

48小时后，停止摇动5至10分钟，直至所有重新形成的类球体沉降至培养瓶底部，更换一半培养基为添加了碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基。随后，以40 RPM重新启动摇床继续培养24小时，并在接下来的三天中每天采用相同方法更换一半培养基。第五天，停止摇床5至10分钟。

然后，将所有类球体转移至一个50毫升离心管中，所用培养基体积不超过50毫升。弃去培养瓶中剩余的培养基，注意确保容器中无残留的类球体。随后，小心移除已沉降类球体的上清液，并用25毫升含钙和镁的PBS洗涤细胞簇。

孵育 5 到 10 分钟后，去除洗涤液，并将类球体重悬于 40 毫升添加了糖原合成酶激酶-3 抑制剂、ROCK 抑制剂和聚乙烯醇的 RPMI-B27 培养基中。将所有类球体转移回生物反应器烧瓶中。然后加入新鲜的 RPMI-B27 培养基至总体积为 100 毫升，并以 40 RPM 重新启动振荡。

24小时后，采用相同步骤更换为RPMI-B27培养基。再过24小时后，再次采用相同步骤更换为含有IWP2、purmorphamine和SB43的RPMI-B27培养基。继续培养48小时。

通常在七天后观察到首次搏动。对于尚未适应单细胞培养的人多能干细胞系的快速分化，首先将生长在小鼠胚胎成纤维细胞上、汇合度达到70%至80%的人多能干细胞培养物，用5毫升解离液处理30至60秒。解离液作用时间应仅限于MEF细胞变圆且hPSC克隆边缘变得清晰为止。

如果细胞培养时间过长，将无法正常分化。在适当的时间，迅速用 75 毫升 IV 型胶原酶替代消化液，并在 37 摄氏度下孵育细胞 5 至 15 分钟，每隔几分钟在显微镜下观察培养情况。当整个细胞集落开始脱落时，将胶原酶替换为 1.5 毫升人胚胎干细胞培养基，并使用 P1000 移液器轻轻将整个细胞集落从培养板底部剥离。

细胞应小心地脱离，以避免集落分散成小碎片。随后，使用5 mL移液器将细胞转移至15 mL锥形管中，并用1 mL人胚胎干细胞培养基洗涤培养孔，将残留的细胞收集至15 mL管中。静置沉淀5分钟后，小心弃去上清液，加入2 mL新鲜的人胚胎干细胞培养基，其中添加碱性成纤维细胞生长因子。

使用一支新的5 mL移液管，将细胞转移至超低吸附培养板中，将细胞集落孵育6至12小时。孵育结束后，用5 mL移液管小心地将集落聚集体转移至新的15 mL离心管中，并用RPMI-B27培养基冲洗以收集残留的聚集体。待集落沉降后，弃去上清液，更换为新鲜的RPMI-B27培养基（添加糖原合成酶激酶-3抑制剂），然后小心地将集落转移至包被有层粘连蛋白的培养板中，在37°C条件下进行贴壁培养。

24小时后，更换为RPMI-B27培养基。再过24小时后，更换为含有IWP2、purmorphamine和SB43的RPMI-B27培养基。通常在七天后观察到首次搏动。

迄今为止，该静态悬浮分化方案已在五种人类胚胎干细胞系和四种人类诱导性多能干细胞系上进行了测试，各细胞系均产生超过90%的搏动类球体，表明该方案在不同人类多能干细胞系之间具有高度可重复性。在搅拌式悬浮生物反应器环境中，分化中的类球体表现出与静态系统相似的行为，在第10天时观察到约100%的类球体发生搏动。事实上，在第30天采集的搏动类球体切片分别显示出心肌肌钙蛋白T的胞质表达以及心脏转录因子NKX2.5的核表达。

此外，当未分化的类球体被未分化的细胞聚集体替代时，分化后七天即可观察到搏动的细胞簇。在42个测试的人诱导多能干细胞系中，第15天时平均超过60%的细胞群呈心肌肌钙蛋白T阳性。这些搏动的细胞簇也表现出与搅拌式悬浮生物反应器生成的类球体相似的心肌肌钙蛋白T胞质表达以及NKX2.5核表达。

在进行该操作时，重要的是要记住使用已适应单细胞培养的hPSCs，且在生物反应器中诱导分化前至少需经过连续三次传代。该方法可与其他心肌细胞富集技术联合使用，以获得高纯度的心肌细胞群体。该技术为hPSC来源的心肌细胞的商业化应用奠定了基础。

它在临床、药物、组织工程以及器官或类器官发育应用中具有潜在用途。观看本视频后，您应能充分理解如何高效地将人多能干细胞分化为心肌细胞，并在生物反应器中扩大培养规模。